CC BY
16
часовий перюд проходження Tiei чи шшо! фенофази, фенодати яко! можуть вiдрiзнятися на 10-15 днiв.
Погоднi умови ютотно впливають на проходження конкретно! фенофази у бархата, ii початок i завершення. Протягом дослщжуваного перiоду фенодати одте! i ие! ж фенофази можуть вiдрiзнятися на 10-15 дшв.
Час настання фенофаз у бархата навесш в умовах Захщного Лiсостепу та Хабаровського краю в загальних рисах збiгаються, однак в умовах ареалу вегетацшний перюд завершуеться швидше i тому вш е коротшим, нiж у За-хiдному Лiсостепу.
Плодоношення у бархата вщбуваеться щорiчно, а рясне повторюеться через 1-2 роки. Перше слабке опадання плодiв вiдбуваеться в жовтнi-листопадi пiсля настання морозiв, тривае у грудш-шчш i масове опадання вщбуваеться наприкiнцi лютого. Повне опадання плодiв iнодi затягуеться аж до кв^ня.
Л1тература
1. Бархат амурский/Цымек А.А., Соловьева К.П., Любарский Л.В., Трегубова Г.М., Емашев С.Д. и др. - М.-Л.: Гогслесбумиздат, 1952. - 132 с.
2. Горд1енко Н.М., Бондар А.О., Горд1енко М.1. 1нтродуценти в д1бровах Полюся та Лкостепу Укра1ни. - К.: Урожай, 2001. - 448 с.
3. Гурский В.В. Амурский бархат и его выращивание в лесах Украинской ССР. - М.: Гослесбумиздат, 1950. - 44 с.
4. Добровольский В.И. Работы по интродукции новых древесных растений и внедрения их в производство// Селекция, интродукция и семеноводство древесных лесных пород. -К.: Урожай, 1964. - С.160-166.
5. Кучинский А.Ф. Бархат амурский в Белорусской ССР: Автореф. дисс. ... канд. с.-х. наук. - Минск, 1954. - 22 с.
6. Логгинов Б.И., Гордиенко М.И. Опыт выращивания культур бархата амурского. -М.: Лесн. пром-сть, 1976. - 152 с.
7. Лыпа А.Л., Косаревский И.А., Салатич А.К. Озеленение населенных мест. - К.: Изд-во Акад. архитектуры УССР, 1952. - 482 с.
8. Павлов В.М. Бархат амурский и опыт его культур в Брянской и Курской областях: Автореф. дисс. ... канд. с.-х. наук. - Брянск, 1964. - 22 с.
9. Федорук А.Т. Опыт интродукции древесных лиственных растений в Беларусии. -Минск: Наука и техника, 1985. - 158 с.
10. Ягниченко Н.М. Разведение бархата амурского в Украинской ССР// Сб. науч. тр. Киев. Лесохоз. ин-та. - 1953, вып. 2. - С.68-102.
УДК581*162.6 1нж. Ю.М. Юсипович; доц. Р.Т. Гут, канд. бюл. наук;
ст. наук. ствроб. В.А. Ковальова - НЛТУ Украти, м. Rbeie
ВПЛИВ Ф1ТОПАТОГЕННИХ ГРИБ1В HETEROBASIDION ANNOSUM ТА FUSARIUM OXYSPORUM НА Р1ВЕНЬ ЕКСПРЕСП ДЕФЕНЗИН1В В ПРОРОСТКАХ PINUSSYLVESTRIS
ТА PICEA ABIES
Показано особливосп впливу ф1топатогенних гриб1в Heterobasidion annosum, Fusarium oxysporum на р1вень експресп дефензишв PsDef1 та SPI1 тд час проростан-ня проростюв Pinus sylvestris та Picea abies.
Ключов1 слова: дефензини PsDef1, SPI1, антифунгальна д1я, Heterobasidion annosum, Fusarium oxysporum, р1вень експресп дефензину.
Нащональний лкотехшчний унiверситет Украши
Eng. Y.M. Yusypovych; senior research officer V.A. Kovalyova;
assoc. prof. R.T. Gout - NUFWT of Ukraine, L'viv
The influence of phytopathogenic fungi Heterobasidion annosum and Fusarium oxysporum to the defensin expression level in seedlings
of Pinus sylvestris and Picea abies
There are presented specials of effect of phytopathogenic fungi Heterobasidion annosum, Fusarium oxysporum to the expression level of defensins PsDef1 and SPI1 during the germination of seedlings of Pinus sylvestris and Picea abies.
Keywords: defensins PsDef1, SPI1, antifungal effect, Heterobasidion annosum, Fusarium oxysporum, defensin expression level.
Вступ. Рослинш оргашзми, так як i тваринш, в умовах природного ic-нування шддаються впливу негативних чинниюв довкшля, зокрема, ди пато-генних органiзмiв. Найбшьш небезпечними патогенами для рослин е грибки. Бшьшють видiв хвойних рослин, особливо ïx проростки, потерпають вiд Fusarium oxysporum, а також вщ кореневоï губки Heterobasidion annosum. Найчастше гриби роду Fusarium, Alternaria, Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Phytophtora зумовлюють полягання Ыянщв хвойних порiд дерев. Це захворю-вання молодих, до 6-ти тижневого вжу, ciянцiв. Зовнiшнi ознаки хвороби проявляються в тому, що на кореневiй шийцi виникае перетяжка темного кольору. Уражеш ciянцi школи сохнуть, у них вiдмирають боковi корiнцi i заломлюеться пагiн у мющ перетяжки. Коренева губка е також одним i3 найнебезпечнiшиx захворювань соснових лiciв Украïни. В умовах Карпат, iз вологим клiматом, часто уражае ялиновi насадження i ялице-буковi лicи. Зах-ворювання спричиняе Fomitopsis annosa (Heterobasidion annosum), зумовлю-ючи кореневу гниль. На початковому еташ захворювання у рослин змен-шуеться прирicт, особливо у висоту, хвоя жов^е i завчасно осипаеться [2]. Одними iз головних меxанiзмiв реаизаци природженого iмунiтету рослин на патогенний виклик е синтез антимжробних бшюв. До групи цих бiлкiв належать рослинш дефензини. Це низькомолекулярш бшки (молекулярна маса 5,6 кДа) iз високим вмicтом циcтеïнiв у ïxньому cкладi та широким спектром антифунгальноï д^'. Роcлиннi дефензини виконують роль першо1' лiнiï захисту найбшьш уразливих тканин, вони експресуються конститутивно у поверхне-вих шарах клггин наciння, вегетативних та генеративних оргашв рослин [5]. Припускають, що i дефензин ялини европейcькоï (SPI1) вщграе подiбну роль у заxиcтi вщ проникнення гiфiв гриба крiзь кору корешв до транспортних шляxiв рослини [3].
Сьогодш залишаеться важливим вивчення впливу Heterobasidion annosum та Fusarium oxysporum на синтез дефензишв у проростках сосни зви-чайноï та ялини европей^ко", що дозволило б знайти оптимальш пiдxоди для захисту Ыянщв хвойних рослин вщ ïx ураження патогенними культурами грибiв. Вiдповiдно, щоб вивчити вплив фггопатогенних грибiв на екcпреciю дефензинiв у хвойних рослин, на оcновi дефензину 1 сосни (PsDef1) одержано cпецифiчнi полiклональнi антитiла.
Матерiали i методи. У дослщах використано вщсортоване життездат-не наciння Pinus sylvestris, ялини звичайноï Picea abies, яке надано Львiвcь-кою державною зональною лicонаciнневою iнcпекцiею. Культури ф^опато-
генних грибiв Fusarium oxysporum люб'язно надано 1нститутом мiкробiологiï i вiруcологiï НАН Украши, культуру гриба Heterobasidion annosum канд. с.-г. наук, доцентом кафедри лiciвництва НЛТУУкраши В.О. Крамарцем.
Умови пророщування иасiиия. Наciння, промите дистильованою водою, пророщували в стерильних умовах за температури 26 иС на фшьтрувально-му паперi, змоченому дистильованою водою, в чашках Петрi (100 шт. на чашку).
Мщелш цих грибiв нарощували в картопляно-декстрозному поживно-му середовишд протягом 3 днiв при температурi 26 оС та отримували гомоге-нат. Гомогенати тканин одержували двома способами: 1) меxанiчним розти-ранням в гомогенiзаторi Поттера з додаванням 1 ml 50 mM H2SO4 на 300 мг зразку, екстрагуючи за кiмнатноï температури на cтрушувачi протягом годи-ни та з наступним центрифугуванням протягом 20 хв. при 14000 об/хв.; 2) ме-хашчним розтиранням в гомогенiзаторi Поттера з додаванням 200 мкл PB S на 100 мг зразку, екстрагуючи при температурi +4 оС протягом 30 хв. з наступним центрифугуванням 30 хв. при 14000 об/хв.
П'ятиденш проростки Pinus sylvestris i Picea abies уражали Heterobasidion annosum та Fusarium oxysporum, кожною культурою гриба зокрема. Для контролю використовували чашку Петрi з незараженими проростками цих видiв рослин. Ус чашки шкубували в термостат при температурi 26 оС. Тка-нини пророcткiв вiдбирали через 2, 24, та 48 год.
Для визначення концентраци бшка в кштинних лiзатаx застосовували колориметричний метод з використанням ФЕК UV 1101 Biotech Photometer. Поглинання вимiрювали за OD280. Контрольний розчин мicтив буфер, у яко-му екстрагували зразки. Концентращю бiлка визначали за калiбрувальним графiком, побудованим за стандартними розчинами альбумшу. При поста-новцi до^ду з визначення впливу патогенних грибiв Heterobasidion annosum та Fusarium oxysporum на рiвень екcпреciï дефензину PsDef1 у проростках сосни звичайноï та ялини европейской було проведено визначення загальноï концентрацiï бiлка в отриманих зразках. Вiдповiдно до отриманих концентра-цiй загальноï кiлькоcтi бiлка у контрол^ здiйcнювали пiдраxунок для вирiв-нювання концентрацiï бiлка, яку необхщно наносити в лунки полiакриламiд-ного гелю (ПААГ).
Електрофоретичие роздiлеиия бшюв у ПААГ. Електрофоретичне роздiлення низькомолекулярних бшюв здiйcнювали в 15 % ПААГ з 3 % вмю-том бюакриламщу в триc-трициновiй буфернш cиcтемi [4]. Анодний буфер мктив: 0,1 M трис, 0,0225 M НО, рН 8,9; катодний - 0,1 M трис, 0,1 M три-цин, 0,1 % ДСН; буфер для гелю - 1 M трис, 0,33 M На, 0,1 % ДСН, рН 8,45; буфер для зразюв - 50 мM трис- НО, рН 7,0, 4 % ДСН (додецилсульфат нат-рш), 2 % 2-меркаптоетанол, 10 % глщерин, 0,015 % Coomassie G-250. Гель забарвлювали фарбою, що мютила 0,025 % Coomassie G-250, 50 % метанолу та 10 % оцтовоï кислоти.
Вестери-блот аналiз лiзатiв тканин. Пicля електрофорезу в ПААГ, гель замочували у буферi для переносу (192 мМ глщин, 25 мМ трис-НС1, рН 8,3 та 20 % метанол) приблизно на 5 хв. По^м гель переносили на штроце-люлозну мембрану або промиту метиловим спиртом полiвiнiлдифторидну
Нащональний лкотехшчний унiверситет УкраТни
мембрану (PVDF) ("Millipore") та розташовували мiж декшькома шарами фiльтрувального паперу, попередно змоченого буфером для переносу. Елек-троперенос бшюв з гелю на мембрану проводили на апарат Trans-Blot™, за рекомендащями виробника ("Bio-Rad") при 250 мА протягом 2 год.
Шсля напiвсухого переносу мембрану iнкубували в буферi для блоку-вання: 5 % знежирене сухе молоко в ЗФРТ (ЗФР/0,1 %-ий Твiн-20) упродовж 1 год при юмнатнш температурi для блокування сайтiв неспецифiчного зв'язування на мембранi. Мембрану iнкубували з анти-дефензин 1 антитшами у блокувальному буферi (1/1000) 2 год. при юмнатнш температурi. Надлишок антитiл вщмивали буфером для блокування. Мембрану вщмивали три рази по 10 хв. вказаним буфером. Вторинш антитiла кози проти IgG кроля, кон'юго-ваш з пероксидазою хрону, додавали у розведенш (1/2500) та iнкубували протягом 1 год. при юмнатнш температурь Шсля шкубаци мембрану знову вщмивали вщ надлишку антитiл буфером ЗФРТ три рази по 5 хв. 1мунореак-тивш бiлки виявляли за реакщею посилено! хемшюмшесценци. Час експози-цп оброблених мембран на рентгешвськш плiвцi залежав вiд iнтенсивностi хемшюмшесценци i тривав 1-15 хв.
Результати i обговорення. Культури грибiв H. аnnosum та F. оxyspo-rum е типовими збудниками захворювань хвойних, особливо F. оxysporum часто уражае проростки хвойних дерев. На початкових етапах проростання захисну роль у проростках вадграють саме дефензини. За допомогою результат Вестерн-блот аналiзу лiзатiв тканин, iнфiкованих проросткiв цих видiв хвойних рослин, стало очевидним, що H. аnnosum та F. оxysporum впливають по рiзному на експресш дефензинiв у проростках сосни звичайно! та ялини европейсько!'. Шсля шфжування проросткiв P. sylvestris через 2 години, знач-них i помiтних змiн не спостерiгаеться (рис. 1, а), на вщмшу вщ двогодинно iнфiкованих пророскiв P. аbies, де рiвень експреси дефензину починае зроста-
ти i в KOHTpcmi вш дещо нижний (рис. 1, б). кДа 12 3 4 5 6 7 8 9 кДа 1 2 3 4 5 6 7 8 9
a б
Рис. 1. Вестерн-блот апальз лЬатьв тканин проростке Pinus sylvestris (а) i Picea abies (б), тфжованих H. аnnosum (2 - 2 год., 5 - 24 год., 8 - 48 год.) та F. оxyspo-rum (3 - 2 год., 6 - 24 год., 9 - 48 год.); контроль - (1 - 2 год., 4 - 24 год., 7- 48 год.)
На 24-ту годину, порiвнюючи з контролем, експреЫя дефензину PsDef1 рiзко змшюеться. 1нфжування проростюв сосни звичайно! та ялини европейсько! патогенними грибами шдукуе у рослин синтез дефензину таким
чином, що KpiM нативно1 форми дефензину можна виявити ще i його попе-редника, який не зазнав процесингу. Тому зразок екстракту бшка проростюв сосни, iнфiкованих H. апиоБиш мiстить двi фракци PsDefl, одна - з вщнос-ною молекулярною масою бiля 8 кДа, друга - становить 5,6 кДа. Вщомо, що ген дефензину кодуе бшок з 83 амiнокислотних залишкiв (а. з.). Цей незрiлий бiлок (попередник) мютить N-кiнцевий сигнальний пептид з 33 а.з. Зрша форма бшка складаеться з 50 а.з. Саме N-юнцевий сигнальний пептид, харак-терний для секреторних бшюв, який вiдрiзаеться вщ незрiлого пептиду на еташ процесингу, сприяючи секреци дефензину в позаклггинний простiр. Таким чином, С-юнцевий пептид формуеться у нативну форму PsDefl [1].
У зразках P. abies, як видно з рис. 1, б, спостер^аеться лише одна iму-нореактивна смуга бшя 6 кДа. Порiвнюючи вплив на еспресш PsDefl H. ап-nosum i F. оxysporuш, помiтно, що при ди останнього наявнiсть двох форм дефензину виявляеться тiльки шсля 48 годин шокуляци проросткiв патоген-ним грибом, до того ж вш сприяе накопиченню дефензину в позаклггинному просторi, тому його концентращя в зразках з F. оxysporuш вища, нiж у зразках з H. аnnosum, що спостер^аеться у сосни звичайно! та ялини европейсь-ко! (рис. 1, а i б).
Крiм цього, можливе явище бiльш специфiчного зв'язування дефензину сосни з мембраною гриба H. аnnosum, тж з мембраною F. оxysporum. У процесi центрифугування певна кiлькiсть зв'язаного дефензину з грибом могла оЫсти в нерозчиннш фракци. У цьому випадку, SPI1 та PsDefl проявили бшьшу специфiчнiсть ди до H. аnnosum, нiж до F. оxysporuш.
Висновки. Внаслщок здiйснених дослiдiв стало очевидним, що вже через двi години шкубаци проросткiв з патогенним грибом, захисна реакщя у проросткiв P. аbies на дiю патогенного гриба вщбуваеться швидше, нiж у проростюв P. sylvestris. Виявилося, що дефензини SPI1 та PsDef1 бiльш спе-цифiчно зв'язуються з мембраною гриба H. аnnosum, нiж з мембраною F. оxysporuш, а це може свщчити про те, що дефензини здатш проявляти певну специфiчнiсть ди до певного виду патогенного гриба. Крiм цього, H. аnnosuш шдукуе посилений синтез PsDef1 таким чином, що процесинг попередника дефензину проходить неповшстю, сприяючи накопиченню в кштит зршо1 та незршо1 форм дефензишв. Вплив такого типу патогенних грибiв на експресiю SPI1 в проростках P. abies - вщсутнш.
Лггература
1. Ковальова В.А., Гут 1.Т., К1ямова Р.Г., Ф1лоненко В.В., Гут Р.Т. Клонування та анал1з кДНК дефензину 1 сосни звичайно'х'// Бюпол1мери i кл1тина. - 2007, т. 23, № 5. -С. 398-404.
2. Шевченко С.В. Лесная фитопатология. - Львов: Вища шк., 1978. - 318 с.
3. Fossdal C., Nagy N., Sharma P., Lonneborg A. The putative gymnosperm plant defensin polypeptide (SPI1) accumulates after seed germination, is not readily released, and the SPI1 levels are reduced in Pythium dimorphum-infected spruce roots// Plant Molecular Biology. - 2003. - Vol. 52, № 2. - P. 291-302.
4. Schagger H., von Jagow G. Tricine - sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1-100 kDalton// Anal. Biochem. -1987. - Vol. 166, № 2. - P. 368-379.
5. Thomma B., CammueB., Thevissen K. Plant defensins// Planta. - 2002. - Vol. 216, № 2. - P. 193-202.
