CC BY
18
Вишневский А.В. Лесовосстановление под пологом спелых сосновых древостоев в борах Ровненского Полесья
Приведены результаты исследований предыдущего естественного возобновления сосновых древостоев в борах Ровненского Полесья. Показаны закономерности динамики естественного возобновления сосны, его связь с возрастом и полнотой материнского древостоя. Рассмотрены предпосылки и возможность перехода к созданию нового поколения сосновых насаждений с использованием способности древесных пород к самовозобновлению в условиях свежего бора.
Ключевые слова: лесные культуры, естественное возобновление, подрост.
Vishnevsky A.V. Renewal under the pine forests canopy in pine forest conditions of Rivnensky Polissya
The results of studying of the previous natural renewal of pine stands of Rivnensky Polissya are given. The regularities of dynamics of natural pine's renewal, its connection with the age of mother's wood and fullness are shown. The preconditions and possibility of transition to alternative way of creation a new generation of pine forests with the using of ability of tree species for refreshing itself in pine wood conditions are observed.
Keywords: forest cultures, natural restoration, grow.
УДК 630*232.3 Acnip. Ю.М. Юсипович; ст. наук. ствроб. В.А. Ковальова;
доц. Р. Т. Гут, д-р бюл. наук - НЛТУ Украти, м. Rbeie
ОСОБЛИВОСТ1 ВИД1ЛЕННЯ СУМАРНО1 РНК З Р1ЗНИХ ТКАНИН СОСНИ ЗВИЧАЙНО1
Представлено методику видшення сумарно! РНК з рiзних тканин та оргашв сосни звичайно!, в основу яко! покладено метод Chang i3 використанням цетилтри-метиламоншбромщу. Встановлено, що модиф1кована методика Chang, адаптована для видшення РНК i3 рiзних тканин сосни звичайно!, дае змогу отримати високояюс-ну сумарну РНК, придатну для подальших генно-шженерних машпуляцш.
Ключовi слова: видшення РНК, сосна звичайна, сумарна РНК, ЦТАБ.
Вступ. У диференцшнш експреси гешв сконцентровано вщображеш змши генетичних програм оргашзму шд д1ею певних умов зовшшнього сере-довища. Найповшш1 дат про функцюнальну актившсть геному дае вивчен-ням РНК, яка е посередником шд час передач! генетично! шформаци вщ ДНК до бшка. Дослщження експреси гешв на р1вш мРНК здшснюеться методами зворотно! транскриптазно! пол1меразно-ланцюгово! реакци (ЗT-ПЛР), ство-рення кДНК б1бл1отек, Нозерн-пбридизаци [1, 2]. Необхщною умовою отри-мання достов1рно! шформаци за транскриптами е видшення 1з дослщжуваних об'еклв достатньо! кшькост яюсно! РНК. Для екстракци РНК 1з тканин тва-рин широко застосовують гуашдин-тюцианатний та тр1азольний методи. Щ методи виявились менш ефективними для видшення РНК 1з тканин хвойних рослин, внаслщок високого вмюту в них фенольних сполук та полщукр1в.
S. Chang запропонував методику видшення сумарно! РНК 1з хво! сосни, яка дае змогу досягти високого виходу високояюсного препарату. Такий ефект досягаеться специф1чним складом екстракцшного буферу на основ! це-тилтриметиламонш-бромщу (ЦТАБ) та використанням лтево-хлоридно! прециштаци нукле!нових кислот. Оскшьки кожна тканина i орган характеризуемся специф1чним вмiстом хiмiчних сполук, то виникла необхiднiсть в мо-
дифшаци згадано! методики для видiлення сумарно! РНК i3 корешв, насiння, стовбура, пагошв, бруньок сосни звичайно!.
У цьому дослщженш навели результати видiлeння сумарно! РНК i3 piзних opганiв i тканин сосни звичайно! за модифшованою методикою Chang et. al. [3].
Матерiали i методи. У дослщах використовували: нeзpiлe насiння, зiбpанe iз серпневих стpoбiл, зародки сухого насшня, наданого ДП мСасiвськe ЛГ" Львiвськo! oбластi; хвою, кopiння, бруньки та камбш зiбpанo у гpуднi з 15^чно! сосни звичайно! Дeндpoбoтанiчнoгo саду НЛТУ Укра!ни. Викорис-тано коршщ, стебла 2-piчних сiянцiв та коршщ, гiпoкoтилi i сiм,ядoлi восьми-денних проростюв сосни звичайно!, вирощених за 25 °C в чашках Пeтpi на фiльтpувальнoму папepi, змоченому дистильованою водою.
Розчини та реактиви готували на MШiq-вoдi, oбpoблeнiй диетилшрокар-бонатом (ДЕПК, "Millipore"). Весь посуд обробляли 0,1 М NaOH, промивали Milliq-водою, обробленою ДЕПК та автоклавували, як i всi буфepнi розчини.
До 0,2-1,0 г заморожено! тканини, яку розтирали в ступщ з рщким азотом, додавали 1 мл попередньо пщгрггого до 65 °C ЦТАБ-буферу (2 % ЦТАБ, 100 мм трис-HCl, рН 8,0, 25 мм ЕДТА (етилендиамштетраоцтова кислота), 2 М NaCl, 2 % пoлiвiнiлпipoлiдoн (ПВП), 0,5 г/л спepмiдин. 2 % в-меркаптоетанол додавали в сумш перед використанням). Суспeнзiю iнкубували за 65 °C 1015 хв iз iнтeнсивним пepeмiшуванням через кожш 2 хв i додавали один об'ем (1 мл) сумiшi хлороформу з iзoамiлoвим спиртом (24:1). Сумш осаджували центрифугуванням за 13 000 об/хв протягом 2-3 хв за юмнатно! температури. Отриману верхню фазу рщини переносили в нову пpoбipку i повторно екстра-гували сумшшю хлороформу з iзoамiлoвим спиртом. До верхньо! фази, отри-мано! шсля центрифугування за кiмнатнo! температури протягом 2-3 хв 13 000 об/хв, додавали % об'ему 10 М LiCl. Осадження здшснювали впродовж нoчi за 4 °C. Осад, що утворився пiсля центрифугування за 14 000 об/хв, 30 хв 4 °C, ресуспендовували в 300 мкл, пщгрггого до 60 °C, ДСН-буферу (1 М NaCl; 0,5 % ДСН (додецилсулфат натрш); 10 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 мм ЕДТА). Суспензш екстрагували однаковим об'емом хлopoфopм-iзoамiлoвo! сумь шi i, додавши два об'еми охолодженого 96 % етанолу, витримували протягом нoчi за -20 °C. РНК осаджували центрифугуванням за 14 000 об/хв 4 °C впродовж 30 хв. Осад двiчi промивали в 500 мкл охолодженого 70 % етанолу. Осад РНК висушували в пpoбipках 10-15 хв (37 °C) i розчиняли в нeoбхiднoму oб,eмi автоклавовано! та оброблено! ДЕПК Milliq-води. Концентрацш РНК визначали спектрофотометрично за А26о, якiсть - за спiввiднoшeнням А26о/А28о, на спeктpoфoтoмeтpi Biotech Photometer UV1101/1101T "Biochrom" та електро-форетично в 1 %-му агарозному гeлi у трис-боратному буфepi, pH 8,3 (50 мм трис-Н3ВО3, 2 мм ЕДТА) за напруги 20 В/см2.
Результати дослщження. РНК легко деградуе шд дieю ендогенних та екзогенних РНКаз, тому процес !! видiлeння потребуе максимально! чистоти та попередньо! шдготовки до роботи. УЫ розчини для видшення РНК, готу-вались на стерильнш Milliq-вoдi, oбpoблeнiй 0,05-0,1 % ДЕПК, який шакти-вуе РНК-ази. Бактери та гриби, якi можуть поширюватися iз пилом, а також руки е основним джерелом РНК-аз, тому посуд багаторазового використання
обробляли 0,1 М NaOH. Для того, щоб уникнути забруднення, дотримували-ся стандартно! мжробюлопчно! тeхнoлoгi! роботи - працювали в стерильних умовах у рукавичках, вщкриваючи реактиви на короткий час.
Отримання висoкoякiснo! сумарно! РНК залежить вiд вихiднoгo мате-piалу, способу його збер^ання та вiд особливостей методу видшення. Пiд час видшення сумарно! РНК iз сосни звичайно!, нeoбхiднo правильно зiбpати й тдготувати матepiал для видiлeння. Найкраще використовувати свiжi ткани-ни iз молодих, активно ростучих пагошв, пpopoсткiв i хво!. Ми використали свiжoзiбpанi зразки i зразки, якi збepiгалися замороженими (-70 °C). Тканини, якi не були попередньо заморожеш у рщкому азoтi перед тривалим збер^ан-ням за -70°С, мiстили пoвнiстю деградовану сумарну РНК (рис.). На вщмшу вщ ДНК, РНК е нестшкою, тому пiд час транспортування свiжoгo матepiалу, або довготривалого збepiгання, його обов'язково пoтpiбнo пoдpiбнити сте-рильним лезом i заморозити у рщкому азoтi для збepiгання [4]. В шшому ра-зi, порушення внутpiшньoклiтиннoгo гомеостазу призводить до деградацп рибонукле!ново! кислоти.
1 2 3 4 5 6 Для видшення сумарно!
РНК iз тканин сосни звичайно! ми модифшували методику Chang et. al. [3]. Пoлiфeнoли i пoлiцукpи, якi мютяться у висoкiй кoнцeнтpацi! у тканинах хвойних, мають здатнiсть зв'язуватись з нукле!новими кислотами, чим ютотно зменшують ви-хiд i чистоту препара^в РНК [5-7]. Вплив цих сполук усунуто вико-ристанням у екстракцшному буфе-pi ПВП i в-меркаптоетанолому. ЕДТА iнгiбуе eндoгeннi РНКази за рахунок утворення кoмплeксiв iз двовалентними катioнами, якi е активаторами цих eнзимiв. Для ефек-тивно! eкстpакцi! нуклеопроте!д-них комплекшв використано висо-ку кoнцeнтpацiю NaCl та ЦТАБ. Дeпpoтe!нiзацiя РНК досягаеться застосуванням ДСН [8]. В екстракцшному буфepi мютиться спермь дин - це пoлiамiн, який слугуе для осадження ДНК на початкових етапах екстрагування. Для отримання препа-ра^в сумарно! РНК високо! чистоти використано повторну eкстpакцiю нук-ле!ново! кислоти сумiшшю хлороформу з iзoамiлoвим спиртом. Пiсля eкстpакцi! хлороформ^зоамшовим розчином препарати РНК звiльняються вщ дoмiшoк ДНК та iнших сполук осадженням за наявност 10 М LiCl [9].
Рис. Електрофореграма сумарноК РНК сосни звичайноК: 1, 2 - повшстю деградована РНК заморожених стебел та кортня 2-р1чног сосни; 3, 5 - деградований препарат РНК; 8-денних проростюв сосни внасл1док
пересушування в термостата; 4 - натвдеградована РНК 8-денних проростюв сосни; 6 - типовий зразок незруйнованог РНК 8-денних проростюв сосни
Осадження та промивання 70 % етанолом забезпечують необхщне очищення препарату вiд рiзноманiтних домiшок та залишкiв Ы+.
Критичним е етап висушування препарату РНК, оскiльки пересушенi препарати РНК деградують та погано розчиняються у водi (рис.).
Для визначення якостi сумарно! РНК здiйснювали електрофорез в 1 % агарозному гелi в трис-боратному буфер^ нуклеlновi кислоти вiзуалiзували бромистим етидiем. Сумарна РНК на електрофореграмi мае вигляд шлейфу вiд 8000 до 300 основ. Дшянка з найбшьшою iнтенсивнiстю свiтiння розмь щена в областi 2000 основ. мРНК зазвичай мiстить 10-25 % рибосомально! РНК (рРНК), яку видно на гелi у виглядi смуг бшя 2000 основ (18 б рРНК), 5000 основ (28 б рРНК), а також школи в дшянщ 100 основ (5 б рРНК) (рис.).
Важливе значення для високого виходу сумарно! РНК iз рiзних тканин мае спiввiдношення вихщно1 наважки зразку та екстракцшного буферу. Ек-спериментальним шляхом ми визначили оптимальне !х спiввiдношення за-лежно вщ типу тканини, якi наведено в таблищ. Очевидно, що на 1 мл ЦТАБ-буферу припадае менша маса наважки насiння та зародюв, нiж камбiю чи ко-ршня 15^чно1 сосни. Це пов'язано з особливостями бiохiмiчного складу, пе-рюду росту та розвитку цих оргашв дерева.
1ндикатором забруднення препарату бшками та полiфенолами е показ-ник сшввщношення А260/А280 (табл.) [10]. Значення А260/А280 у вшх зразках, становило 1,6-2,0, що вказуе на високу чистоту препара^в i можливiсть вико-ристання !х у подальшiй робот для дослiдження експреси генiв.
Табл. Характеристика препаратiв сумарноХ РНК _рiзних тканин сосни звичайноХ_
№ ПП Вегетативт органи та насшня, взяте для видшення сумарно1 РНК Стввднош. маси зразка до екстр. буферу, г/мл Концентр. мкг/мл, за ОБ260 А260/А280
1 Незрше насшня 1: 5 2,68 2,08
2 Зародки сухого насшня 1: 12 1,24 1,88
3 Коршщ 8-денних проростов 1 3 1,05 1,88
4 Гшокотил1 8-денних ироростшв 1 5 1,37 1,98
5 С1м'ядол1 8-денних проростшв 1 5 1,53 2,02
6 Камбш 15-р1чно1 сосни 1 2 1,09 1,61
7 Хвоя 15-р1чно1 сосни 1 5 2,38 2,03
8 Вегетативт бруньки 15-р1чно1 сосни 1 5 1,95 2,04
9 Коршня 15-р1чно1 сосни 1 4 1,58 2,08
Висновки. Особливост бiохiмiчного складу тканин кожного деревно-го виду потребуе особливого шдходу та оптимiзацil методiв видiлення РНК. Процес видiлення нуклешових кислот потребуе максимально: чистоти та попередньо1 пiдготовки до роботи. Для видшення РНК сосни звичайно1 найкраще використовувати свiжозiбранi тканини проросткiв, молодих пагошв та хво1. Значний вмют фенолiв, полiцукрiв та ендогенних РНК-аз у тканинах сосни ускладнюе вихщ необхщно1 якостi та кiлькостi сумарно1 РНК, умови висушування та збершання також можуть впливати на И яюсть. Важливе зна-
чення для виходу оптимально! кшькост сумарно! РНК з piзних тканин мае визначення сшввщношення вихщно! маси наважки зразка i eкстpакцiйнoгo буфера. Збepiгати отриманий препарат варто у 70 % eтанoлi за -20 °C коротко-i дoвгoтepмiнoвo - за -70 °C. Мoдифiкoвана методика Chang адаптована для видшення РНК iз piзних тканин сосни звичайно! дае змогу отримати високо-якiсну сумарну РНК, придатну для подальших гeннo-iнжeнepних маншуляцш.
Лiтература
1. Azevedo H. An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees / Azevedo H., Lino-Neto Т., Tavares Rui M. // Plant molecular biology reporter. -2003. - Vol. 21. - P. 333-338.
2. Gehrig H.H. An improved RNA isolation method for succulent plant species rich in polyphenols and polysaccharides / Gehrig H.H., Winter K., Cushman J., et al. // Plant molecular biology reporter. - 2000. - Vol. 18. - P. 369-376.
3. Chang S. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees / Chang S., Pur-year J., Cairney J // Plant Mol. Biol. Rep. - 1993. - Vol. 11. - P. 113-116.
4. Гут Р.Т. Пор1вняльний анашз pian^ мeтoдiв видшення ДНК з хво! сосни звичайно! (Pinus sylvestrisL.) / Р.Т. Гут, Ю.В. Вербовицька // Науковий вюник НЛТУ Укра!ни : зб. наук.-техн. праць. - Львiв : РВВ НЛТУ Укра!ни. - 2005. - Вип. 15.5. - С. 116-121.
5. Kiefer E. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites / E. Kiefer, W. Heller, D. Ernst // Plant molecular biology reporter. -2000. - Vol. 18. - P. 33-39.
6. Lewinsohn E. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms / Lewinsohn E., Steele C.L., Croteau R. // Plant molecular biology reporter. - 1994. - Vol. 12, № 1. -P. 20-25.
7. Salzman R.A. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates / Salzman R.A., Fujita Т., Zhu-Salzman K., et al. // Plant Molecular biology reporter. - 1999. - Vol. 17. - P. 11-17.
8. Топчш Н. Сучасш методи видшення ДНК вищих рослин / Н. Топчш // Вюник львiвськoгo ушверситету. - Сер.: Бюлопчна. - Львiв. - 2006. - Вип. 42. - С. 26-31.
9. Су М. Выделение высококачественной РНК из различных тканей Populus / Су М., Цзан В., Яо Н., Хуан М. // Физиология растений. - 2009. - Т. 56, № 5. - С. 791-795.
10. Kolosova N. Isolation of high-quality RNA from gymnosperm and angiosperm trees / Ko-losova N., Miller В., Ralph S., et al. // BioTechniques. - 2004. - Vol. 36, № 5. - P. 821-824.
Юсипович Ю.М., Ковалева В.А., Гут Р.Т. Особенности выделения суммарной РНК из разных тканей сосны обыкновенной
Представлена методика выделения суммарной РНК из разных тканей и органов сосны обыкновенной, в основу которой положен метод Chang с использованием це-тилтриметиламонийбромида. Установлено, что модифицированная нами методика Chang, адаптированная для выделения РНК из разных тканей сосны обыкновенной, дает возможность получить высококачественную суммарную РНК, пригодную для последующих генно-инженерных манипуляций.
Ключевые слова: выделение РНК, сосна обычная, суммарная РНК, ЦТАБ.
Yusypovych Yu.M., Kovalyova V.A., Gout R.T. The specials of a total RNA isolation from various Scots pine tissues
In this article are presented а total RNA isolating method from different tissues and organs of Scots pine which is based on Chang's method using cetyltrimethylammonium-bromide. Described that the method of Chang is modified by us adapted for the selection of RNA from different types of pine-tree ordinary, enables to get high-quality total RNA, suitable for subsequent gene engineerings manipulations.
Keywords: RNA isolation, Scots pine, total RNA, CTAB.
