CC BY
25
Chygrynets V.P., Rumyantsev M.G., Solodovnik V.A., Buksha M.I. Features of Formining and Regeneration for Oak Stands in a Fresh Maple-lime Oak Forest in the Left-Bank Forest Steppe
Forming and growth features are identified for natural oak stands of seed origin in the Left-Bank Forest Steppe. Quantitative and qualitative state dynamics is analyzed for advance growth of principal and associate species under a shelterwood of parent stands. After a seed year, a mass oak sprouting (over 70 thousand pcs- ha-1) was observed, equally spaced in the area. Scientifically-based measures are developed for the natural oak forests' seed regeneration in the region.
Keywords: natural oak forest stands, advance growth, young seedling, fresh maple-lime oak forest, Left-Bank Forest Steppe.
УДК 630*[14+44]
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНА Д1АГНОСТИКА BACILLUS PUMILUS У СОСНОВОМУ ДЕРЕВОСТАН1 Ю.1. Шаловило1, В.А. Ковальова2, Р. Т. Гут3
Представлено методику визначення ДНК бактерш штаму Bacillus pumilus у тканинах сосни звичайно! (Pinus .sylvestris L.) шляхом полшеразно-ланцюгово! реакцп (ПЛР) i3 використанням видоспецифiчних праймерiв. Цю методику апробовано для щентифша-Щ1 B. pumilus у природному пристиглому сосновому деревосташ. Виявлено присутшсть бактерш B. pumilus у тканинах дерев i3 характерными ознаками бактерiальноl водянки, що шдтверджуе 1х участь у патолопчному процеи. Обстежено саштарний стан сосно-вих насаджень рiзних класш вжу у Судововишнянському лiсiвництвi ДП "Самбiрське лiсове господарство".
Ключовi слова: Bacillus pumilus, сосна звичайна, бактерiальне ураження, ПЛР-аналiз.
Вступ. Сосна звичайна (Pinus sylvestris L.) - це одна i3 основних деревних порiд, яку використовують для лiсорозведення та лiсовiдновлення на територй' Украши. Тому збитки ввд хвороб цieí рослини е особливо вiдчутними як в еко-номiчному, так i в еколопчному аспектах. Вiдомо кiлька сотень збудниюв хвороб на соснi звичайнш, серед яких i бактерiальнi патогени, що спричиняють та-кi захворювання, як пухлиноподiбний бактерiоз, бактерiальну водянку, бактерь альний опiк, бактерiоз однорiчних сiянцiв та iн. [4, 12, 15]. Вважаеться, що на-уковi дослiдження щодо збудникiв бактерiальних захворювань i викликаного ними патогенезу сосни мають фрагментарний характер, що пов'язано як недо-оцiнкою небезпеки бактерiозiв для соснових деревостанiв, так i складнiстю ви-дшення та вдентифшацп мiкроорганiзмiв.
Встановлено, що бактерií штаму Bacillus pumilus, видшеш з тканин сосни звичайно! i3 ознаками бактерiального ураження, проявляють патогеннi власти-восп щодо рослин цього виду [1, 2, 11]. Симптоми захворювання, спричинеш бактерiями B. pumilus, подiбнi до бактерiальноí водянки, небезпечно! хвороби деревних рослин. Тому на сьогодення е актуальним питання щодо розроблення системи швидко! дiагностики B. pumilus для мошторингу бактерiозiв сосни i розроблення методов захисту лiсу вiд бактерiальних iнфекцiй.
1 acnip. Ю.1. Шаловило - НЛТУ Украши, м. Львгв;
2 ст. наук. сп1вроб. В. А. Ковальова, канд. бюл. наук - НЛТУ Украши, м. Льв1в;
3 проф. Р.Т. Гут, д-р бюл. наук - НЛТУ Украши, м. Льв1в
Упродовж останнього десятилтя у лiсовому господарствi дед^ ширше починають застосовувати методи молекулярно1 генетики та бютехнологи, зок-рема для вдентифжацп ДНК патогена, з використанням видоспецифiчних праймерiв [9, 10]. ПЛР-ан^з iнтенсивно розвиваеться для дiагностики грибко-вих захворювань лiсу, також за його допомогою було вдентифшовано бактерп, що асоцiйованi з бактерiальною водянкою берези та лiщини [6].
Мета дослвдження. Визначення саштарного стану соснових насаджень Украшського Розточчя, що належать до рiзних вшових груп та iдентифiкацiя штаму B. pumilus у тканинах деревини Pinus sylvestris L. зi симптомами бактерь ального ураження.
Об'екти та методика дослiдження. Для проведения дослщження було закладено тимчасовi пробнi площi (ТПП) у соснових деревостанах рiзного вiку Судововишнянського лкництва ДП "Самбiрського лiсового господарства" (зпдно з вимогами СОУ 02.02-37-476.2006) [8], що належать до природно-кш-матичних умов Розточчя. Категорда санiтарного стану дерев визначено за "Са-штарними правилами в лiсах Украши" [13]. П1д час вiзуального обстеження саштарного стану дерев на ТПП вщзначали симптоматичш дерева, якi характери-зувались наявнiстю на стовбурi трщин iз витiканиям рiдини, як одною iз основ-них ознак бактерiального ураження. Таксацiйнi показники деревосташв на ТПП визначено з використанням нормативно-довщкових матерiалiв [7].
1з симптоматичних дерев вщбирали зразки деревини, якi помщали на ок-ремi чашки Петрi з картопляним агаром. Чашки шкубували у термостатi протя-гом 2 дiб за температури оптимально!' для росту бактерiальних колонiй +30 °С. Бактерiальнi колонií переносили у рдае картопляно-декстрозне середовище й iнкубували за то!' ж температури. Для видшення бактерiальноí ДНК використо-вували 300 мкл 24-годинно1 бактерiальноí суспензií, що осаджували центрифу-гуванням за 13000 об./хв протягом 5 хв. Осад розчиняли та iнкубували з 300 мкл лiзоцим-лiзувального буферу (100 мМ NaCl; 0,5 M трис-НС1, pH 8,0; 10мг/мл лiзоциму) протягом 1 год за температури +37 °С та додавали 200 мкл ДСН^зувального буферу (100 мМ NaCl; 0,5 M трис-НС1, pH 8,0; 10 % доде-цилсульфату натрда (ДСН)). Вмiст мiкропробiрки перемiшували та витримува-ли 10 хв за температури +65 °С. 1з отриманого супернатанту, вщдшеного вiд протешу, тсля додавання 500 мкл сумiшi хлороформ: iзоамiлового спирту (24:1), прециттували ДНК, додаючи 1/2 об'ему 7,5 М амонш ацетату та рiвний об'ем холодного iзопропанолу. Пiсля iнкубацií вмiсту за -20 °С, ДНК осаджували центрифугуванням за 12000 об./хв. Нуклешову кислоту промивали 2-3 рази у 70 %-му етанолi та розчиняли в 20-50 мкл автоклавовано1 дистильовано1 води.
Для iдентифiкацií бактерiй B. pumilus використовували метод ПЛР-аналiзу iз видоспецифiчними праймерами до гену целюлази (GenBank: GQ849198.1): прямий (Bp-1 T CAAAT CAAGT GGGCAAC) та зворотний (Bp-2 GAGGCATCCCATATATTCG) [5]. ПЛР - амплiфiкацiю проводили в 25 мкл сумш^ що мiстила 1 мкл тотально1 ДНК бактерiй, однократний ПЛР буфер (Fermentas), 1 мМ MgCl2 (Fermentas), 0,2 мМ дНТФ (Fermentas), по 0,5 мкМ праймерiв та 0,5 у.о. Taq полшерази (Fermentas). ПЛР здшснювали за допомогою амплiфiкатора Proteus (Helena Biosciences, Англiя) за умови: денатурацiя за
95 °С протягом 5 хв iз подальшими 25 циклами амплiфiкацií (95 °С - 1 хв; 52 °С - 1 хв; 72 °С - 1 хв) i елонгацiя за 72 °С протягом 5 хв. Очкувана довжи-на продукту амплiфiкацií - 1461 п.н. Роздшення продуктш ПЛР проводили в 1 %-му агарозному гелi у трис-боратнiй буфернiй системi (50 мМ трис-Н3ВО3, рН 8,3; 2 мМ ЕДТА), зафарбовували бромистим етидieм (0,5 мкг/мл), вiзуалiзу-вали в УФ-свiтлi та фотографували.
Результати дослвдження та 1х обговорення. Ус пробнi площi закладено в умовах В2-дС (свiжому дубово-сосновому суборi) у насадженнях рiзних класш вiку: молодняку I класу, молодняку II класу, середньовiкових, пристиглих та стиглих.
За результатами оцшювання санiтарного стану дерев на ТПП вираховували середнiй зважений шдекс санiтарного стану насаджень (1с), який визначали да-ленням суми добуттв кiлькостi дерев кожно! категорií стану i балiв вiдповiдних категорiй стану на загальну кiлькiсть дерев у перелку. Ми не виявили залеж-ностi мiж кiлькiстю дерев з ознаками бактерiального ураження та значенням ш-дексу санiтарного стану або/чи вком насаджень (табл.). Так, найбшьше дерев iз витiканням рiдини на стовбурi виявлено у пристиглому насадженш, де 1с був найнижчим i становив 2,01. Дещо менше дерев iз симптомами бактерiального ураження, а саме 19 % - знайдено у 39^чному насадженш, де 1с=2,29. Тодi як на iнших ТПП виявлено тальки поодинокi симптоматичнi дерева.
Табл. Саштарний стан соснових насаджень
Клас вiку Вк, роки Розподш дерев за категоркми саттарного стану, % Шдекс сан. ст. (1с) Потенцшно уражено бак-терюзом, %
I II III IV V VI
Молодняк I класу 15 27 25 20 13 6 9 2,73 1
Молодняк II класу 39 27 41 15 12 3 2 2,29 19
Середньовшовий 58 19 35 28 15 1 2 2,50 7
Пристиглий 73 35 38 21 4 1 1 2,01 32
Стиглий 88 24 47 23 3 1 2 2,16 9
Для молекулярно-генетично! дiагностики штаму В. рытМш вибрано ТПП №4, закладену у 73^чному насадженнi, де виявлено найбшьшу кiлькiсть дерев iз ознаками бактерiального ураження, зокрема на стовбурах дерев були трщи-ни, як з невеликими, так i рясними смолотечами (рис. 1). У червш 2016 р. провели вiдбiр 32 зразюв уражених тканин деревини сосни звичайно! та трьох зраз-кiв iз здорових дерев. Дерева iз симптомами захворювання на ТПП розмщува-лися здебшьшого групами по 7-10 дерев, що може свщчити про iнфекцiйний характер ураження.
Пiсля шкубування зразкiв на живильному середовищi у чашках Петрi нав-коло 18 зразюв деревини спостерiгали за ростом мщелда гриба, а навколо 14 -за ростом колонш бактерш. Варто зауважити, що навколо деревини, де розви-вався мiцелiй, встановлено слабкий ркт бактерiальних штамiв, i навпаки. У чашках Петрi зi зразками деревини iз здорових дерев спостершався рiст пооди-ноких колонш бактерш тшьки навколо одного зразка iз трьох. Колонií бактерiй переносили у рвдке поживне середовище. 1з 24-годинних бактерiальних суспен-зiй видшяли тотальну ДНК бактерiй.
Рис. 1. Смолотечi на 73-р1чних деревах: А - малi смолотечi; Б - рясм смолотечi
Для щентифжацп В. рпшИш у вщбраних зразках використано ПЛР-анаиз iз використанням специфiчних праймерiв [5]. У реакцiйну сумш вносили видь лену ДНК бактерш та праймери Вр1 та Вр2, специфiчнi до гена целюлази шта-му В. рышИш. Присутнiсть ДНК В. рышИш визначали за наявшстю продукту довжиною 1461 п.н. (рис. 2).
Рис. 2. Електрофоретичний aHmÍ3 npodyKmie амплiфiкацü суммарной ДНК бак-mepiü Í3 ¿eHocne^(pÍ4HUMU праймерами для штаму B. pumilus: М - маркери 1 kb DNALadderPlus (Fermentas); дорiжка Р140 та Р142 - ДНК B. pumilus (пози-тивний контроль); доргжка Зд. - сумарна ДНК бактерт, що обросли навколо де-ревини 3Í здорового дерева; дорiжки № 14, 17, 19, 32, 33, 36, 46, 49, 55, 56, 74, 84, 88, 100 - сумарна ДНК бактерш, що обросли навколо деревини Í3 симптоматичных дерев
Електрофоретичний aHanÍ3 ПЛР-продуклв показав присутшсть ДНК B. pumilus ттьки у 4 зразках. А саме у тканинах деревини, вщбраних з уражених дерев тд номерами 49, 55, 74 та 100. На стовбурi дерев № 55 та 74 виявлено велик трщини, темна "мокра деревина" i кислий запах виткаючо'' рщини, що е характерними ознаками бaктерiaльноí водянки. На деревах № 33, 36, 56 також спостерггались велию трщини iз штенсивними смолотечами, але без характерного запаху кислого бродшня. У зразках деревини iз цих дерев присутшсть бактерш B. pumilus не визначено. На стовбурi дерев № 49 та 100 спостерп^алися невелик за розмiром смолотечi без кислого запаху, але ДНК бактерш B. pumilus в
зразках i3 цих дерев було виявлено. Таю ж смолотечi знайдено ще у 20 дерев, що розмiшувалися навколо зазначених вище у радiусi 7-10 м. Навколо тканин i3 цих дерев спостеркали за ростом мщелда гриба i колонiй бактерiй. Проте ДНК бактерш B. pumilus не виявлено.
Розвиток бактерiальноí iнфекцií зазвичай мае системний характер, тобто збудник поширюеться по судиннiй системi рослин, одночасно заселяе практично вс Ii частини i проникае в насшня. Бактерií B. pumilus здатш рухатися по тканинах деревини, а також присутш серед аутомiкрофлори насшня [3]. Це мо-же представляти реальну загрозу у лiсовому господарств^ через ураження та втрату дшово! деревини, а також iнфiкування проростюв сосни звичайно' вже пiд час проростання насiння.
Висновки. Отже, з'ясовано, що в уражених тканинах деревини з дерев, mi характеризувались наявнктю трiшин iз смолотечами, присутнi гриби та/або бактерп. Використовуючи методику на основi полшеразно-ланцюгово!' реакцй' зi геноспецифiчними праймерами Вр1 та Вр2, щентифшовано бактерй' штаму B. pumilus у зразках деревини з дерев iз характерними ознаками бактерiальноí водянки [14], що свдаить, що щ бактерй' е однiею з причин розвитку патолопчно-го процесу. Окрш цього, бактерй' B. pumilus виявлено в деревах на початковш стадо розвитку бактерюзу, що робить перспективним використання ще!' методики для ранньо' дiагностики хвороби. Запропонована методика молекулярно-генетично' дiагностики дасть змогу оперативно проводити контроль насiння на заражешсть B. pumilus, лiсопатологiчний мониторинг поширення цього патогена у деревостанах для рацюнального планування лiсозахисних заходiв.
Лiтература
1. Bacillus pumilus - a new phytopathogen of Scots pine / V.A. Kovaleva, Y.I. Shalovylo, Y.N. Gorovik [et al.] // Journal of forest science. - 2015. - Vol. 61(3). - Pp. 131-137.
2. Bacillus pumilus - новый фитопатоген сосны обыкновенной / Ю.Н. Горовик, Ю.И. Шаловило, В.А. Ковалева та др. // Труды БГУ : сб. науч. тр. - 2012. - Т. 7, ч. 1. - С. 194-198.
3. Гвоздяк Р.1. Жсова фггопатобактерюлопя / Р.1. Гвоздяк, А.Ф. Гойчук, В.В. Розенфельд; навч. пойбн. / за ред. проф. А.Ф. Гойчука. - К. : Вид. дш "Вiнiченко". - 2014. - 252 с.
4. Гойчук А.Ф. Бактерiальнi хвороби сосни звичайно! / А.Ф. Гойчук, В.В. Розенфельд // Науковi пращ Жсшничо! академи наук Украши : зб. наук. праць. - Львiв : РВВ НЛТУ Украши. -2011. - Вип. 9. - С. 130-136.
5. Горовик Ю.Н. ПЦР - диагностика бактерий Bacillus pumilus / Ю.Н. Горовик, А. Л. Лагоненко, А.Н. Евтушенков // Труды БГУ : сб. науч. тр. - Т. 9, ч. 1. - 2014. - С. 162-166.
6. Баранов О.Ю. Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных питомниках / О.Ю. Баранов, В.А. Ярмолович, С.В. Пантелеев та др. // Лесное и охотничье хозяйство: сб. науч. тр. - 2012. - № 6. - С. 21-29.
7. Нормативно-справочные материалы для таксации лесов Украины и Молдавии / под ред.
A.З. Швиденко. - К. : Изд-во "Урожай", 1987. - 560 с.
8. Площi пробш люовпорядш. Метод закладання: СОУ 02.02-37-476: 2006. - [Чинний вщ 2007-05-01]. - К. : Мшагрополинки Украши, 2006. - 32 с. - (Стандарт Оргашзацн Украши).
9. Алимова Т.С. Применение методов молекулярной генетики для анализа наличия фитопатогенов в лесных насаждениях и питомниках Российской Федерации / Т.С. Алимова,
B.А. Сиволапов, Н.А. Карпеченко та др. // Сибирский лесной журнал. - 2014. - № 4. - С. 35-41.
10. Применение молекулярно-генетических методов в лесном хозяйстве Беларуси / В.Е. Падутов, О.Ю. Баранов, Д.И. Каган та др. // Сибирский лесной журнал : сб. науч. тр. - 2014. - № 4. - С. 16-20.
11. Шаловило Ю.1. Реакцш рослин Pinus sylvestris L. при взаемоди з бактерiями родгв Bacillus, Paenibacillus та Pseudomonas / Ю.1. Шаловило, В.А. Ковальова, Р.Т. Гут та iH. // Науковий вюник НЛТУ Украши : зб. наук.-техн. праць. - Львш : РВВ НЛТУ Украши. - 2012. -Вип. 22.13. - С. 62-70.
12. Рыбалко Т.Н. Бактериозы хвойных Сибири / Т.Н. Рыбалко, А.Б. Гукасян. -Новосибирск : Изд-во "Наука". - 1986. - 80 с.
13. Саштарш правила в люах Украши (затверджен наказом Мшстерства аграрно'1 политики та продовольства Украши вiд 21.03.2012 р., № 136). [Електронний ресурс]. -Доступний з http://zakon2.rada.gov.ua/laws/show/z0505-12. - Дата звернення: 5.05.2016 р.
14. Шаловило Ю.1. Дiагностика дерев сосни зi симптомами бактерiальноï водянки / Ю.1. Шаловило // Геномжа рослин та бютехнологш : матер. 1-о'1 Мiжнар. наук. конф.; Бiологiя рослин та бютехнологш : матер. 2-о'1 наук. конф. молод. вчених, 23-24 грудня 2013. - К. - С. 40-53.
15. Шаловило Ю.1. Типи баю^альних хвороб хвойних рослин / Ю.1. Шаловило, В.А. Ковальова, Р.Т. Гут // Науковий вюник НЛТУ Украши : зб. наук.-техн. праць. - Львгв : РВВ НЛТУ Украши. - 2011. - Вип. 21.13. - С. 68-72.
Надтшла до редакцп 08.09.2016р.
Шаловило Ю.И., Ковалева В.А., Гут Р.Т. Молекулярно-генетическая диагностика Bacillus pumilus в сосновом древостое
Представлена методика определения ДНК бактерий штамма Bacillus pumilus в тканях сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием видоспецифических праймеров. Эту методика апробирована для идентификации B. pumilus в естественном сосновом древостое. Обнаружено присутствие бактерий B. pumilus в тканях деревьев с характерными признаками бактериальной водянки, что подтверждает их участие в патологическом процессе. Проведено обследование санитарного состояния сосновых насаждений разных классов возраста в Судововишнянском лесничестве ГП "Самборское лесное хозяйство".
Ключевые слова: Bacillus pumilus, сосна обыкновенная, бактериоз, ПЦР-анализ.
Shalovylo Yu.I., Kovaleva VA., GoutR.T. Molecular Genetic Identification of Bacillus Pumilus in a Pine Stand
The method of identification of Bacillus pumilus DNA in Pinus sylvestris L. tissues by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers was presented. This method was tested for the identification of B. pumilus strain in a 73 - years old pine stand. The presence of B. pumilus DNA in tissues of pine trees with characteristic signs of bacterial dropsy, which confirms participation of B. pumilus in the pathological processes, was established. The diagnostics of sanitary conditions in the pine plantations of different age classes in Sudova Vyshnya Forestry of Sambir State Forest Enterprise was conducted.
Keywords: Bacillus pumilus, Scots pine, bacteriosis, PCR analysis.
