CC BY
11
УДК 577.112 Мол. наук. ствроб. В.А. Ковальова;
доц. Р. Т. Гут, канд. бюл. наук - НЛТУ Украти
НОВИЙ МЕТОД ВИД1ЛЕННЯ Б1ЛКА З ПРОТИГРИБКОВОЮ АКТИВН1СТЮ З ПРОРОСТК1В НАС1ННЯ СОСНИ ЗВИЧАЙНО1
Запропоновано швидкий та ефективний метод видiлення рослинних дефензи-шв, який дае змогу iзолювати з проростюв сосни звичайно! бiлок з молекулярною масою близько 10 KDa з антифунгальною активнiстю проти ф^опатогенних грибiв Fusarium oxysporum та Pythium debaryanum.
Ключов1 слова: дефензин, сосна звичайна, фосфоцелюлоза, видiлення.
Researcher V.A. Kovalyova; doc. R.T. Gout - NUFWT of Ukraine A new method of isolation of an antifungal protein from seedlings of Scots pine
The rapid and effective method of isolation of plant defensins is proposed. We have purified from seedlings of Scots pine 10 RDa protein with antifungal activity against plant pathogenic fungi Fusarium oxysporum and Pythium debaryanum.
Keywords: defensin, Scots pine, phosphocellulose, isolation.
1нфекцшш хвороби люових культур, що викликаються фггопатогенни-ми грибами, завдають значних економ1чних збитюв люовому господарству. Важливе мюце серед метод1в боротьби з люовими шфекщями належить бь олопчним, як найбшьш еколопчно чистим. Дослщження молекулярних меха-н1зм1в захисту рослин вщ патогешв е одшею з передумов правильного визна-чення засоб1в боротьби з хворобами люу.
У вщповщь на шфжування рослини синтезують ряд бшюв, яю отри-мали назву патогеншдукованих [1]. Одну з груп цих бшюв становлять дефен-зини - основш, низькомолекулярш, цистешомютю проте1ни з протигрибко-вою актившстю [2]. Описано вже понад 80 дефензинопод1бних бшюв з 38 ви-д1в рослин, амшокислотний склад 1х характеризуеться високою р1зномашт-шстю, консервативним е положення лише восьми цисте1шв та ще трьох амь нокислот [3]. Дефензини були 1зольоваш з насшня [4], листя [5], бульби кар-топш [6], фрукпв [7] та тканин генеративних оргашв рослин [8].
Нещодавно гени, що кодують дефензини, були щентифжоваш i у ге-ном1 деяких видiв голонасiнних Picea glauca, Picea abies, Ginkgo biloba [9]. Рашше ми показали, що дефензин експресуеться в проростках насшня сосни звичайно! [10]. Осюльки цей бшок ще не був iзольований з тканин хвойних рослин, то для дослщження його властивостей ми розробили метод видшення дефензину з корешв проросткiв сосни Pinus sylvestris L.
Матер1али i методи
Вщсортоване життездатне насiння сосни звичайно! пророщували у чашках Петрi на фшьтрувальному паперi, змоченому дистильованою водою, у термостат при температурi 26 °С. Коренi з семиденних проросткiв видаля-ли та зберiгали при температурi - 70 °С.
Рослинний матерiал (20 г) розтирали у ступщ у рiдкому азотi до по-рошкоподiбного стану. Бiлки екстрагували 50 мМ сульфатною кислотою (3 мл/г сиро! ваги) протягом 30 хв. при 4 °С. Нерозчинний матерiал видаляли фiльтрацiею через тканину та подальшим центрифугуванням (15000 об/хв.,
Науковий вкник, 2005, вип. 15.4
20 хв., 4 °С). До надосадово! рiдини додавали по краплях 10 мМ NaOH до рН 7,8 i витримували суспензiю протягом 30 хв. при 4 °С. Осад видаляли пiсля центрифугування при 15 000 об/хв., 20 хв. при 4 °С. Бiлки з надосадово! рщи-ни осаджували шляхом додавання твердого сульфату амошю спочатку до 35 % насичення, а по^м до 80 %, осад формувався протягом 18 год при 4 °С i вiдокремлювався при центрифугуванш (15000 об/хв., 30 хв., 4 °С). Осад роз-чиняли у буфер^ що мiстив 20 мМ трис-НС1, pH 7,4, 10 мМ NaCl, розчин прогрiвали 10 хв. при 85 °С, центрифугували 14000 об/хв. протягом 20 хв. i 4 °С. Супернатант дiалiзували проти буферу, що мютив 20 мМ трис-НС1, pH 7,4, 100 мМ NaCl, i наносили на колонку (об'емом 3 мл) з фосфоцелюлозою Р11 (Whathman, Великобританiя), попередньо зрiвноважену дiалiзним буфером. Сорбованi бшки елюювали ступiнчастим градiентом концентрацп NaCl: 0,3 М; 0,5 М та 1 М.
Бшки отриманих фракцш аналiзували електрофорезом у системi Лем-лi [11]. З щею метою до алшвот фракцiй (50 мкл) додавали ТХО до кшцево! концентрацп 10 %, бiлки осаджували центрифугуванням та промивали хо-лодним ацетоном, розчиняли у денатуруючому буферi (65 мМ трис-HCl, рН 6,8, 1 % SDS, 2 % 2-меркаптоетанол, 10 % глщерин) та фракцюнували електрофорезом у градiентi густини 5-22 % ПААГ за наявност 0,1 % SDS. Гель тсля електрофорезу фарбували срiблом.
Фракцп, що мютили бiлки з однаковою молекулярною масою, об'една-ли, дiалiзували проти буфера, що мютив 20 мМ трис-HCl, pH 7,4, 10 мМ NaC1, та збер^али при -70 °С до використання.
Результати та ix обговорення
На даний час юнуе декiлька методичних пiдходiв видшення дефензи-нiв з рослинного матерiалу [8, 12, 13]. Запропонованi методи базуються на властивостях, характерних для цих бшюв: високий позитивний заряд молеку-ли (+5 .. .+7) та !х термостiйкiсть. Враховуючи це, а також стабiльнiсть дефен-зинiв при екстремальних значеннях рН, на перших етапах видшення ми вико-ристали модифiковану методику, яка була застосована для iзоляцil тюне!шв з ячменю [14], - екстракщю багатих на цисте!н бiлкiв сульфатною кислотою (рис. 1). Використання кислотно! екстракцп та наступне фракцшне осаджен-ня бшюв рiзними концентрацiями сульфату амонiю дало змогу ютотно збага-тити фракцш дефензину та очистити !! вщ основно! маси бiлкiв (рис. 2, до-рiжки 1,3), що екстрагуються з проросткiв сосни звичайно!.
Для подальшого очищення дефензину було використано юнообмшну хроматографiю. У бiльшостi методик як сорбент ф^урують сильнi катюшти з сульфогрупою [12, 15]. Вибiр нами фосфоцелюлози був зумовлений високою спорщнешстю дефензину з Pinus sylvestris до сорбента, який мютив фосфог-рупу, що було показано нами у попередшх дослiдженнях [16].
Електрофоретичний аналiз фракцiй, елюйованих з фосфоцелюлози стушнчастим градiентом концентрацп хлориду натрда, показав, що бiлок, близький за молекулярною масою до дефензину, десорбувався з катюшту розчином 0,5 М NaC1 (рис. 2, дорiжка 2).
Ним LlfHIHHH fUJLMHHHIJL IJ HdlVpldJI V V JJUKLJMV aJHJIL
Eki'i pükuin uL'tkib 50 111M IllStJi {30 х1ц4ЧГ) L I.llli фнфч vbjHHK {I4Ö0Ö 30 хь. 4aQ
(k'Ü^Ki'H H И U L L UU LI|J LI II JL'II 4tH H L 35 "'IpI N I I j) IS C.) i {I van, 4aC) ULLI ipнфvi vbJHtiK i I4Ö0Ö & 30 Ib. 4'4";i
{ku^ML IhlHvLlkiu при Ы JITLI1L tun i fiö % {MI j) lS( >J { I fi 10Д, 4aQ Ulli фиф vi гьапнн {14000 30 хь. 4aQ
Iii Htl-UU XI LH LI J \ p-U Ш IUI JJ JljlL И LI J фиф] LI LL. L HA. LIJ JL E.'H.lK I ри^НфСШ'МШМ JLIJ.LLJ II fH." IM |f JI V
Рис. 1. Схема видтення бтка з протигрибковою актившстю з семиденних
проростшв сосни звичайноХ
Видшений бшок мав антифунгальну активнiсть стосовно фггопатоген-них грибiв Fusarium oxysporum i Pythium debaryanum. Вихщ чистого бiлка з протигрибковою актившстю, отриманого за даною методикою, становить близько 400 мжрограм бшка з 20 грамiв рослинного матерiалу.
Запропонований нами методичний шдхщ дае змогу швидко та ефектив-но з використанням простих бiохiмiчних процедур та iонообмiнно! хроматографа отримати електрофоретично гомогенний препарат бшка, гомолопчний рос-линним дефензинам. Цей метод випдно вiдрiзняеться вiд традицших пiдходiв до видiлення рослинних дефензишв, як включають декiлька видiв хроматографы: гель-фiльтрацiю, iонообмiнну та зворотнофазову високоефективну рщин-ну на заключному етапi, потребують дорогого обладнання та тривалi за часом.
Таким чином, нами був вперше iзольований дефензин з представника класу голонасiнних та показана його актившсть проти деяких видiв фггопато-генних грибiв. Метою наступних дослщжень буде подальше вивчення бюло-гiчно! активностi видiленого бшка, мехашзму протигрибково! активностi, а також можливост використання дефензину як маркера для пошуку та вщбо-ру у природних популящях генотипiв з високим рiвнем експреси дефензину, який зумовлюе резистентшсть рослин до патогешв.
Науковий вкчшк, 2005, вип. 15.4
Рис. 2. Очистка дефензину з семиденних проросткьв сосни звичайноИ на фосфоцелюлози Бтки фракщоноваш 4-22 % ПААГ електрофорезом у присутност10,1 % SDS. Гель зафарбований срьблом:
1 - сульфатамонтний осад б\лк\в;
2 - бтки, елюйоват з фосфоцелюлози 0,5 М NaCl; 3 -загальний екстракт кислоторозчинних б\лк\в. Зл1ва вказано положення маркер1в молекулярних мас
Лггература
1. Van Loon LC. Pathothenesisrelated proteins// Plant Mol.Biol. - 1985. - 4. - P. 111-116.
2. Menedez E, Moreno A, Collila F, Pelaez F, Limas GG, Mendez R, Soriano F, Malinas M, DeHaro C. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, y-hordothionin, from barley endosperm.// Eur. J. Biochem. - 1990. - 194. - P. 533-539.
3. Thomma BPHJ, Cammue BP A, Thevissen K. Plant defensins// Planta. - 2002. -216. - P. 193-202.
4. Broekaert WF, Terras FRG, Cammune BPA, Osborn RW. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system// Plant Physiol. - 1995. - 108. - P 1353-1358.
5. Terras FRG, Eggermont K, Kovaleva V, Raikhel NV, Osborn RW, Kester A, Rees SB, Torrekens S, Van Leuven F, Vanderleyden J, Cammue BPA, Broekaert WF. Small cyste-ine-rich antifunga1 proteins from radish (Raphanus sativus L.). Their role in host defense// Plant Cell. - 1995. - 7. - P. 573-588.
6. Moreno M, Segura A, Garcia-Olmedo F. Pseudothionin-ST1, a potato peptide active against potato pathogens// Eur. J. Biochem. - 1994. - 223. - P. 135-139.
7. Meyer B, Houlne G, Pozueta-Romero J, Schantz ML, Schantz R. Fruit-specific expression of a defensin-type gene family in bell pepper. Upregulation during ripening and upon wounding// Plant Physiol. - 1996. - 112. - P. 615-22.
8. Lay Ft, Bruglierra F, Anderson MA. Isolation and properties of floral defensins from ornamental tobacco and petunia// Plant Physiol. - 2003. - 131. - P. 1283-1293.
9. Sharma P, Lonneborg A. Isolation and characterization of a cDNA encoding a plant de-fensin-like protein from roots of Norway spruce// Plant Mol. Biol. - 1996. - 3. - P. 707-712.
10. Гут РТ, Ковальова ВА. Дефензини як фактор резистентност рослин до бютич-ного стресу// Наук. вюник УкрДЛТУ. - 2004, вип. 14.6. - С. 49-55.
11. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4// Nature-1970. - 227. - P. 680-684.
12. Cammue BPA, De Bolle MFC, Terras FRG, Proost P, Damme JV, Rees SB, Van-derleyden J, Broekaert WF. Isolation and characterization of a novel class of plant antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa L. seeds// J. Biol.Chem. - 1992. - 267. - P. 2228-2233.
13. Wong JH, Ng TB. Gymnin, a potent defensin-like antifungal peptide from the Yunnan bean (Gymnocladus chinensis Baill)// Peptides. - 2003. - 24. - P. 963-968.
M
kDa 75— 50 — 37.5 —
25—
15— ^ 10— -
14. Ozaki Y, Wada K, Hase T, Matsubara H, Natanishi T, Yoshizumi H. Amino acid sequence of a purothionein analogue of barley flour// J. Biochem. - 1980. - 87. - P. 549-555.
15. Osborn RW, Desamblanx GW, Thevissen K, Goderis I, Torrekenes S, vanLeuven F, Attenborough S, Rees SB, Broekaert WF. Isolation and characterization of plant defensins from seeds of Asteracea, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae// FEBS Lett. - 1995. - 368. - P. 257-262.
16. Kovalyova VA, Cramer R, Gout IT, Gout RT. The analysis of tyrosine phosphorylation in the process of seed germination of Scots pine// yKp. EioxiM. ^ypH. - 2005. - 77, № 2. - C. 119-120.
УДК 591.5+630*13 Астр. I.I. Делеган1 -НЛТУ Украши
ЗБЕРЕЖЕН1СТЬ ДЕРЕВ БУКА Л1СОВОГО (FAGUS SILVATICA L.) Р1ЗНИХ ЕКОТИП1В У ГЕОГРАФ1ЧНИХ
КУЛЬТУРАХ НА РОЗТОЧЧ1
Подано загальну характеристику географiчних культур бука люового (Fagus silvatica L.) створених за М!жнародною програмою 1ЮФРО в 1995 р. Наведено результата дослщження збереженосп дерев бука залежно вщ географiчного походження.
Ключовi слова: географiчнi культури, екотип, бук лiсовий, збереженiсть.
Doctorate I.I. Delehan - NUFWT of Ukraine
Conservation of the Beech Trees (Fagus Silvatica L.) of Different Ecotypes
in Geographic Crops in Roztochya
Geographic crops of the beech (Fagus silvatica L.), which were created according to the International program IUFRO in 1995 are characterized. The results of the study of conservation of beech trees depending from the geographic origin are given.
Keywords: geographic crops, ecotype, beech (Fagus silvatica L.), conservation.
Збереження й вщтворення лiсiв в умовах глобального потеплшня кль мату потребуе подальших поглиблених дослщжень з метою отримання нових даних стосовно збереженосп, особливостей росту та розвитку екотишв, ос-новних люоутворюючих порщ у рiзному середовишд.
Однiею з таких порщ е бук лiсовий, географiчнi культури якого й послужили об'ектом дослщження. Закладеш культури весною 1995 р., у Страд-чiвському навчально-виробничому лiсокомбiнатi. Дослiдний об'ект створено в рамках М!жнародно1 програми - "Оцшка генетичних ресурсiв бука у Свро-пiм пiд керiвництвом професора, д-ра бюл. наук Г.Т. Криницького. У цьому загальноевропейському експериментi беруть участь 23 краши, в тому чи^ i Укра1на. Аналогiчнi культури бука за ушфжованою методикою створено в 22 пунктах Свропи [1].
Розмщення блокiв у географiчних культурах бука показано на рис. 1. Як видно з цього рисунка, кожен екотип висаджений у трьох блоках з трикратною повторшстю. Блок, у свою чергу, складаеться з п'яти рядiв по десять садивних мюць у кожному (рис. 2).
1 delehan@lviv.farlep.net
