CC BY
4УДК 631.523.11:582.751.42
Е.В. Гузенко, В. А. Лемеш
СОЗДАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ ЛЬНА (LINUM USITATISSIMUM L.), НЕСУЩИХ МУТАНТНЫЙ ГЕН ТУБУЛИНА, МЕТОДОМ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ
ТРАНСФОРМАЦИИ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Современная селекция льна-долгунца ориентирована в основном на улучшение прядильных свойств льноволокна, что является определяющим фактором в конкурентной способности данной культуры. Однако необходимо совершенствовать и другие агрономические характеристики, включая устойчивость к повышенной гербицидной нагрузке. Создание генетически модифицированных растений, малотребовательных к условиям среды и невосприимчивых к гербицидам - альтернативный способ повышения продуктивности сельского хозяйства, позволяющий существенно снизить использование вредных химикатов.
Генетически измененные растения с устойчивостью к различным классам гербицидов являются наиболее успешным биотехнологическим продуктом в области растениеводства. К настоящему времени получены трансгенные растения сельскохозяйственных культур устойчивые к таким компонентам гербицидов, как глифосат (соя, рапс, томат, кукуруза), фос-финотрицин (кукуруза, рис, пшеница, хлопок, картофель, томат, сахарная свекла), хлорсуль-фурон (рапс, рис, томат), динитроанилины (кукуруза, хлопок). Единственная трансгенная линия льна масличного CDC Triffid на основе сорта Norlin, устойчивая к сульфонилмочевине (хлорсульфурон), создана и зарегистрирована в Канаде [1]. Следует подчеркнуть, однако, что получение трансгенных линий льна остается трудно решаемой задачей.
На сегодняшний день приблизительно четверть рынка всех гербицидов занимают соединения, обладающие антимитотическими
свойствами [2-4]. К этой группе гербицидов относятся, в том числе, и разрушители микротрубочек, такие как широко применяемые динитроанилины, в частности, трифлюра-лин, пендиметалин, оризалин и другие [5]. Основными эффектами данных гербицидов являются деполимеризация микротрубочек с последующим нарушением формирования веретена деления и блокированием прохождения клетками митоза [5]. Они также нарушают ориентацию кортикальных микротрубочек, что приводит к появлению клубеньковой морфологии кончиков корней из-за изодиаметри-ческого роста клеток в зоне элонгации корня [3]. Основной мишенью действия динитро-анилинов является белок тубулин [5, 6], высококонсервативный структурный компонент микротрубочек эукариотической клетки, состоящий из а- и Р-субъединиц с молекулярной массой ~50-55 кДа каждая [7]. Хотя уровень гомологии аминокислотных последовательностей этого белка из различных источников достаточно высок, тубулины животных и растений характеризуются различной степенью сродства к динитроанилинам [6, 8, 9]. Именно тубулин растений связывается с данными веществами высокоспецифичным образом в низких микромолярных концентрациях. Как было показано с помощью моделирования т silico пространственной структуры тубулинов растений, такая особенность обусловлена наличием высокоспецифичного сайта связывания с динитроанилинами на поверхности молекулы а-тубулина, локализованного в зоне интерди-мерного контакта [9]. В формировании этого сайта связывания ключевая роль принадлежит
остатку аминокислоты треонина (Тре-239), замена которого на изолейцин (Иле) приводит к приобретению природной устойчивости к динитроанилинам [10, 11]. Поэтому использование мутантного гена а-тубулина (Tuaml), изолированного из устойчивого к динитроа-нилинам (R-биотипа) гусиной травы (Eleusine indica L.) [11], могло бы позволить решить
проблему устойчивости льна не только к ди-нитроанилиновым гербицидам, но и к гербицидам из класса фосфоротиоамидов.
Цель данной работы состояла в получении трансгенных растений льна-долгунца, несущих мутантный ген а-тубулина, который обеспечивает устойчивость к гербицидам дини-троанилинового класса.
Материалы и методы
В качестве исходного материала использовали сорт льна-долгунца белорусской селекции Старт (Могилевская ОС).
Генно-инженерная конструкция была любезно предоставлена академиком Я.Б. Блюмом (Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины) и представляла собой бинарный вектор pBITUBA8, содержащий мутантый ген а-тубулина Тuаml из Klemme indica [11] и ген ß-тубулина HvTUBl из ячменя (Hordeum vulgare) [12]. Оба гена интегрированы в конструкцию под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (35S РНК СаМУ) и октопино-вого терминатора 3'OCS [13].
Выбор селективных концентраций трифлю-ралина. Поскольку трифлюралин (DowElanco, Greenfield, США) является одним из наиболее эффективных представителей класса дини-троаналиновых гербицидов, нами проведен анализ чувствительности клеток каллуса льна к его действию, и установлена его летальная концентрация. Концентрацию трифлюралина определяли с помощью теста in vitro [14, 15]. Для этого готовили 10 мМ стерильный раствор гербицида в диметилсульфоксиде и хранили при -20° С. Затем соответствующие концентрации трифлюралина (0,5-10 мкМ) добавляли в охлажденную стерильную питальную среду для каллусообразования льна.
Агробактериальная трансформация. Для трансформации льна использовали ночную культуру агробактерии, которую выращивали на среде LB [16] с добавлением 100 мг/л рифампицина и 100 мг/л канамицина при температуре 28°С и постоянном качании на орбитальном шейкере (180 об/мин). Клетки агробактерии осаждали центрифугированием (1000 об/мин) и разбавляли свежей жидкой средой МС [17] до достижения оптической плотности OD600 = 0,5 и инкубировали в тех
же условиях в течение 3-4 часов. Полученную суспензию применяли для инфицирования эксплантов.
В качестве эксплантов для трансформации были использованы сегменты гипокотилей пятидневных проростков льна-долгунца размером 3-4 мм, которые помещали на ага-ризованную среду МС-БН, и предкультиви-ровали в течение 48 ч. Трансформацию и ко-культивирование с агробактерией проводили согласно методу, описанному нами ранее [18]. Затем экспланты помещали на среду МС-БН, содержащую антибиотик клафоран в концентрации 200 мг/л для ингибирования развития колоний агробактерий и канамицин в концентрации 100 мг/л для создания селективного давления на нетрансформированные клетки. Параллельно проводили селекцию трансформированных тканей на селективных концентрациях трифлюралина по аналогичной схеме, т. е. вместо канамицина в среду культивирования вносили трифлюралин в концентрации 3 мкМ. Выжившие и регенерировавшие в селективных условиях растения переносили на безгормональную среду МС для укоренения [19, 20] и молекулярно-биологического анализа.
Молекулярно-генетический анализ. Для выделения тотальной ДНК из предположительно трансгенных побегов использовали комплект реагентов «ДНК-сорб-С» (Россия). Целевые гены Тuаml и HvTUBl в используемой нами конструкции находятся под контролем 35Б промотора вируса мозаики цветной капусты, который можно идентифицировать с помощью праймеров к последовательности данного промотора. Для этой цели использована тест-система «АмплиСенск ПЛАНТ-СКРИН». Амплификацию и последующий анализ первичных
трансформантов проводили согласно инструкции производителя.
Для подтверждения интеграции маркерного гена в геном полученных растений-регенерантов проводили ПЦР с праймерами к последовательности гена (5,-СОАСОТТ-GTCACTGAAGCG-3, и 5,-AAGCACGAG-GAAGCGGTCAG-3,). Размер амплифицируе-мого фрагмента 489 пн.
Для доказательства того, что амплификация последовательности селективного маркера происходит с геномной ДНК модифицированных растений, а не с экспрессионного вектора, который встроен в плазмиду бактериальной клетки, проводилась ПЦР с использованием
праймеров к хромосомным генам агробак-терий: 5'-С ATGCTCGGCCGGCTGACA-3', 5'-TGCGCAGGTCGCTTGCTTC-3'.
Реакции проходили в амплификаторе BioRad при следующих условиях: шаг 1 - 2 мин при 94°С; шаг 2 - 29 циклов, 30 сек при 94°С, 1 мин при 56°С и 1 мин при 72°С; шаг 3 - 5 мин при 72°С. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и документировали с помощью системы Bio-Rad GelDoc2000. Размеры амплифицированных фрагментов определяли, используя в качестве маркера GeneRulerTM100 bp (1000 bp) Plus DNA ladder (Fermentas).
Результаты и обсуждение
Исследования, проведенные в Канаде [21], Великобритании [22], Словакии [23] позволили разработать различные способы и условия трансформации льна масличного. Аналогичные исследования на культуре льна-долгунца единичны в силу того, что эта культура обладает пониженной морфо-генетической активностью in vitro по сравнению с другими разновидностями льна. Известно, что важной предпосылкой для создания успешной системы трансформации какого-то определенного вида растений является наличие высокоэффективной системы регенерации побегов в культуре in vitro. Ранее нами была проведена оценка морфогенетического потенциала и регене-рационной способности некоторых сортов льна-долгунца, районированных в Беларуси, в культуре in vitro [24]. В результате был определен гормональный состав питательной среды, оптимальной для каллу-сообразования и регенерации растений, и отобран ряд сортов белорусской селекции, обладающих высоким регенерационным потенциалом [24]. Для данного исследования в качестве основного объекта был выбран сорт льна-долгунца Старт.
Для агротрансформации использовали сегменты гипокотилей пятидневных пророст-
ков длиной 3-5 мм, которые помещали на агаризованную среду МС-БН и предкульти-вировали в течение 48 ч. Наши наблюдения показали, что данный этап является обязательным при проведении агробактериальной трансформации льна-долгунца. В противном случае количество выживших эксплантов после трансформации резко снижается, а в некоторых экспериментах погибают все экспланты. Для льна-долгунца еще недостаточно хорошо разработаны методы переноса генов. Существуют лишь единичные работы по использованию агробактериальной, ПЭГ-индуцированной и биобаллистической трансформации [25, 26] для получения модифицированных растений льна-долгунца. В частности, в результате использования этих методов были созданы первичные растения-трансформанты, несущие химерные или антисмысловые встройки [25, 27, 28], а также растения льна, продуцирующие новые метаболиты [29].
Встраиваемая нами конструкция несла гены, кодирующие обе субъединицы гетеродимерного белка тубулина: мутантый ген а-субъединицы (ТuаmГ) из природного высокоустойчивого к динитроанилинам биотипа гусиной травы и полноразмерный ген Р-субъединицы тубулина (HvTUB\) из ячменя (рис.1).
Рис. 1. Схема Т-ДНК конструкции рБ1ТиБЛ8.
ЬБ и ИБ - левая и правая границы Т-ДНК, 358 - промотор 358 вируса мозаики цветной капусты, Тиат1 -ген мутантного а-тубулина, 3'0С8 - октопиновый терминатор, ИуТПЫ - ген р-тубулина, Рпоб - нопалиновый промотор, прШ - ген устойчивости к канамицину, 3'ио8 - нопалиновый терминатор.
Предполагается, что наличие в конструкции двух субъединиц и их последующая эквимо-лярная коэкспрессия является необходимым условием для обеспечения их корректного встраивания в нативные интерфазные или ми-тотические микротрубочки трансформированных растений [10].
Отбор первичных трансформантов в нашем исследовании был основан на толерантности модифицированных клеток и тканей как кана-мицину за счет экспрессии в них гена прШ, так и за счет экспрессии в клетках гена мутантного тубулина, определяющего устойчивость к ди-нитроанилинам. Оптимальная концентрация селективного агента должна минимизировать процент регенерации нетрансформирован-ных растений и максимально ограничивать
его негативное влияние на органогенез. Чаще всего концентрация канамицина при селекции трансформированных гипокотилей льна-долгунца составляет 100 мг/л [30]. В наших экспериментах большинство гипокотильных сегментов, инокулированных бактериальной суспензией и помещенных на селективную среду (Кт100), замедляли рост, экспланты желтели и засыхали. Однако у части эксплантов на срезах формировался и активно рос зеленый каллус плотной консистенции, что позволило предполагать получение трансформированного каллуса (рис. 2). Аналогичным способом через стадию формирования каллуса проводили регенерацию трансформированных побегов как масличного льна [22], так и льна-долгунца [30].
" Л '
Рис. 2. Формирование каллуса из модифицированных клеток на селективной среде (Кт100)
Для установления эффективной селективной концентрации динитроанилинового гербицида (трифлюралин) каллусы культивировали на твердых средах, содержащих трифлюралин в концентрациях 0,5-10 мкМ, так как ранее было показано, что динитроанилины проявляют высокую антимикротрубочковую активность в растительных клетках при достаточно низких микромолярных концентрациях [6]. В результате наших исследований установлено, что концентрация 3 мкМ является эффективной концентрацией трифлюралина для селекции
in vitro каллусов льна-долгунца. Полученные нами данные коррелируют с результатами предыдущих исследований по установлению критических микромолярных концентраций этого гербицида для других видов некоторых однодольных [15] и двудольных [31] растений.
В таблице представлены результаты эффективности морфогенеза и регенерации гипокотиль-ных эксплантов сорта Старт после проведения агробактериальной трансформации и селекции на средах, содержащих канамицин(Кт100) и трифлюралин (3 мкМ) (табл. 1).
Таблица 1
Эффективность морфогенеза и регенерации после проведения агробактериальной
трансформации
Селективный агент Число эксплантов, шт. Число выживших эксплан-тов, шт. Число эксплантов, образовавших каллус, шт. Число сформировавшихся побегов, шт.
Канамицин 191 191 109 8
Трифлюралин 163 80 59 4
При проведении селекции на среде, содержащей 100 мг/л канамицина, спустя 3-4 недели после инокуляции 191-го сегмента гипо-котилей наблюдалось активное формирование каллусов по краям эксплантов. Несмотря на легкость получения каллусных тканей, получить побеги льна-долгунца после проведения трансформации не всегда удается. Тем не менее, в результате культивирования жизнеспособного каллуса на селективных средах с канамицином сформировалось 8 побегов. Соотношение количества эксплантов, образовавших каллус к количеству сформировавшихся побегов составило 7,3 %. Такой показатель эффективности агробактериальной трансформации характерен для льна [32, 33].
Селекция гипокотильных эксплантов на среде, содержащей 3 мкМ трифлюралина, была более продолжительной, чем на среде, содержащей в качестве селективного агента кана-мицин. Образование каллуса на эксплантах наблюдали только спустя 2-3 месяца от начала культивирования, регенерация побегов также была затруднена. Соотношение количества
эксплантов, образовавших каллус к количеству сформировавшихся побегов составило 6,7 %.
В ходе экспериментов по агробактериаль-ной трансформации гипокотильных сегментов получено 12 первичных трансформантов льна-долгунца сорта Старт. Рост побегов на средах, содержащих канамицин или трифлю-ралин, является косвенным доказательством их трансгенной природы. Для подтверждения интеграции переносимых генов проведен молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов. Поскольку и а-, и Р-тубулины растений кодируются относительно большим количеством генов с очень схожими последовательностями, то специфическая амплификация перенесенных генов из конструкции рВ1ТиВА8 в растения невозможна. Так как целевые гены в использованной конструкции находятся под контролем 35Б промотора, нами проведена амплификация с соответствующими праймерами. Результаты анализа показали наличие фрагментов, соответствующие позитивному контролю (плазмида рВ1ТиВА8) во всех образцах (рис. 3).
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами к 358 промотору (1 - 12 ДНК индивидуальных растений-регенерантов льна-долгунца сорта Старт, 13 - положительный контроль (ДНК плазмиды рБ1ТиБЛ8), К - отрицательный контроль ПЦР, М - маркер молекулярной массы 1000 пн).
Все побеги были перенесены на среду для ризогенеза (MS с половинным набором макро-и микросолей), дополненную канамицином (Km50). Культивирование на селективной среде в условиях in vitro приводило к заметному угнетению способности к корнеобразованию у части растений. В итоге пять побегов дали корни. Для исключения отбора ложных трансформантов, способных расти на средах с антибиотиком, проведен ПЦР-анализ с праймерами к nptII гену, а также к хромосомным генам агробактерии. При агробактериальной трансформации агробакте-
рии способны сохраняться в сосудистой системе и межклеточных пространствах растения в течение нескольких поколений. Для доказательства того, что амплификация последовательности селективного маркера происходит с геномной ДНК генетически модифицированных растений, а не с экспрессионного вектора, который встроен в плазмиду бактериальной клетки, нами проведен анализ с использованием праймеров к хромосомным генам агробактерий. В результате трансгенный статус достоверно подтвержден у пяти растений (рис. 4).
1 кЬ 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами к хромосомным генам A.tumefaciens и к гену (1 - ДНК плазмиды рБ1ТиБЛ8, 2-6 - ДНК индивидуальных растений льна-долгунца).
Таким образом, комплексный молекулярно-генетический скрининг методом ПЦР первичных трансформантов льна-долгунца сорта Старт, полученных методом агробактериаль-ной трансформации, позволил подтвердить
трансгенный статус пяти истинных трансформантов льна-долгунца.
Работа была выполнена при поддержке БРФФИ (грант Б09К-053).
Список использованной литературы
1. Flax / A. Pretova [et al.] // Biotechnology in Agriculture and Forestry. - 2007. - Vol. 6. -P. 129-140.
2. Mitotic disrupter herbicide: recent advances and opportunities / W.T. Molin [et al.] // Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology. - 1997. - P. 143-158.
3. Vaughn, K. C. Anticytoskeletal herbicides / K. C. Vaughn // Plant Microtubules: Potential for Biotechnology. - 2000. - P. 193-205.
4. Vaughn, K.C. The abnormal cell plates formed after microtubule disrupter herbicide treatment are enriched in callose / K.C. Vaughn // Pest. Biochem. Physiol. - 2006. - V. 84. - P. 63-71.
5. Устойчивость растений к гербицидам с антимикротрубочковым механизмом действия: от природных мутантов до переноса генов / А.И. Емец [и др.] // Физиол. раст. 1999. 46, - № 6. - C. 899-907.
6. The biochemistry of compounds with an-timicrotubule activity in plant cells / L.C. More-john [et al.] // Pharm. Ther. - 1991. - V. 51. -P. 217-230.
7. Structural and functional organization of tubulin / D.E. Fosket [et al.] // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1992. - V. 43. - P. 201-240.
8. Drugs with colchicine-like effects that specifically disassemble plant but not animal microtubules / A.S. Bajer [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1986. - V. 466. - P. 767-784.
9. Structural modelling of plant a-tubulin interaction with dinitroanilines and phosphoro-amidates / Ya.B. Blume [et al.] // Cell Biol. Int. - 2003. - V. 27. - P. 171-174.
10. Herbicide resistance caused by spontaneous mutation of the cytoskeletal protein tubulin / R. Anthony [et al.] // Nature. - 1998. -V. 393. - P. 260-263.
11. a-Tubulin missense mutations correlate with antimicrotubule drug resistance in Eleusine indica / E. Yamamoto [et al.]// Plant Cell. - 1998. - V. 10. - P. 297-308.
12. Distinct tubulin genes are differentially expressed during barley grain development / V.V. Radchuk [et al.] // Physiol. Plant. -2007. - V. 131. - P. 571-580.
13. Агробактериальная трансформация льна-долгунца мутантным геном тубули-на, несущим устойчивость к динитроани-линовым гербицидам / А.И. Емец [и др.] //
Генетика. - Т. 45, № 10. - С. 1377-1385.
14. Transfer of amiprophosmethyl-resistance from a Nicotiana plumbaginifolia mutant by somatic hybridization / A.I. Yemets [et al.] // The-or. Appl. Genet. - 2000. - V. 100. - P. 847-857.
15. Efficient callus formation and plant regeneration from dinitroaniline-resistant and susceptible biotypes of Eleusine indica (L.) / A.I. Yemets [et al.] // Plant Cell Rep. - 2003. -V. 21. - P. 503-510.
16. Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual / J. Sambrook, D.W. Russell. - Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY, 2001. - 999 p.
17. Введение в культуру in vitro и регенера-ционная способность сортов льна-долгунца с различной устойчивостью к полеганию / О.А. Баер [и др.] // Физиол. биохим. культ. растений. - 2004. -T. 36, - № 1. - C. 48-54.
18. Гузенко, Е.В. Трансформация различных генотипов льна-долгунца с помощью Agrobacterium tumefaciens: предварительные результаты / Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, А.И. Емец, Я.Б. Блюм, Н.А. Картель // Факторы экспериментальной эволюции организмов: материалы IV междунар. науч. конф., Алушта, 22-26 сентября 2008 г./, К.: Логос; редкол.: И.Р. Бариляк [и др.]. -Алушта, - 2008. - С. 268-273.
19. Ризогенез в культуре in vitro у сортов льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) / Е.В.Гузенко [и др.] // Докл. Нац. Акад. наук Беларуси. Сер. Биол. Наук. - 2009. - Т. 53, № 6. - С. 86-89.
20. Споаб укоршення рослин, отриманих в культурi in vitro: пат. 48060 Украина, МПК51 А 01 Н 4/00/ О.А. Баер, А.И. Емец, Я.Б. Блюм, Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, Л.В. Хотылева, Н.А. Картель; заявитель Ин-т пищ. биотехн. и геномики НАН Украины - №u2009 07669; заявл. 21.07. 09; опубл. 10.0 .10 // Офиц. бюл. / Нац. Центр Интел. Собственности. - 2010. - № 5. - С. 3.
21. Glyphosate tolerant flax plants from Agro-bacterium-mediated gene transfer / M. Jordan [et al.] // Plant Cell Rep. - 1988. - Vol. 7. -P. 281-284.
22. Genetic transformation of flax (Linum usitatissimum L.) by Agrobacterium tumefa-ciens. Regeneration of transformed shoots via
callus phase / N. Basiran [et al.] // Plant Cell Rep. - 1987. - Vol. 6. - P. 396-399.
23. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax / L. Mlynarova [et al.] // Plant Cell Rep. - 1994. - Vol. 13. - P. 282-283.
24. Гузенко, Е.В. Оценка регенерационной способности новых сортов и сортообразцов льна-долгунца (L.ussitatissimum L.) для последующей агробактериальной трансформации / Е.В. Гузенко, В. А. Лемеш, Л.В. Хоты -лева // Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений: материалы III Междунар. науч. конф., посвящен. 50-летию Отдела биох. и биотехн. раст., Минск, 14-16 мая 2008 г./ центр. бот. сад НАН Беларуси; редкол.: В.Н. Решетников [и др.]. - Минск, - 2008. - Ч. 1. - С. 71-76.
25. Plant cell and biotechnology studies in Linum usitatissimum - a review / S. Millam [et al.] // Plant Cell Tissue Org. Cult. - 2005. -V. 82. - P. 93-103.
26. The use of the phosphomannose isomerase gene as alternative selectable marker for Agro-baeterium-mediated transformation of flax (Linum usitatissimum) / F. Lamblin [et al.] // Plant Cell Rep. - 2007. - V. 26. - P. 765-772.
27. Гузенко, Е.В. Получение трансгенных растений льна-долгунца, несущих химерный ген GFP-TUA6 / Е.В. Гузенко, В А. Лемеш, Г.Я. Баер, О А. Баер, А.И. Емец, Я.Б. Блюм, Н.А. Картель. // Генетика и биотехнология
XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты: материалы междунар. науч. конф., Минск, 3-6 декабря 2008 г./ Минск. гос. ун-т; редкол.: Н.П. Максимова [и др.]. - Минск, -2008. - С. 62-64.
28. Создание генетически модифицированных растений льна (Linum usitatissimum L.) методом биолистической трансформации / В.А. Лемеш [и др] // Вес. Нац. акад. на-вук Беларусь Сер. бiял. навук. - 2010. -№ 1. - С .18-23.
29. Pinoresinol-lariciresinol reductase gene expression and secoisolariciresinol diglucoside accumulation in developing flax (Linum usitatis-simum) seeds / C. Hano [et al.] // Planta. - 2006. - V. 224. - P. 1291-1301.
30. Трансформация растений льна-долгунца / А.В. Поляков [и др.] // Физиология растений. - 1998. - Т. 45, - № 6. - С. 882-887.
31. Plant mutants and somatic hybrids with resistance to trifluralin / A.I. Yemets [et al.] // Cell BioI. Int. - 1997. - V. 21. - P. 912-914.
32. Transgenic flax plants from Agrobacte-rium tumefaciens transformation - incidence of chimeric regenerants and inheritance of transgenic plants / J.Z. Dong [et al.] // Plant Sci. -1993. - V. 91. - P. 139-148.
33. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens / J.Z. Dong [et al.] // Plant Sci. -1993. - V. 88. - P. 61-71.
Дата поступления статьи 21 февраля 2011 г.
