CC BY
11УДК 633.521:581.4:604.6
В.А. Лемеш1, Е.В. Гузенко1, Т.Е. Саматадзе2, Е.В. Железнякова1, Н.Л. Большева2, О.В. Муравенко2
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСфОРМАЦИЯ ЛЬНА Обзорная статья
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Российская Федерация, г. Москва, ул. Вавилова, 32
Генетическая инженерия в растениеводстве
Первая публикация об экспрессии чужеродных генов в растительных клетках появилась в 1983 году в журнале «Nature» [1]. С тех пор более чем на 120 видах растений проведена успешная трансформация. Первые коммерческие сорта на основе трансгенных растений были зарегистрированы в 1994 году американской фирмой Монсанто. Это картофель, устойчивый к колорадскому жуку (New Leaf); хлопчатник, устойчивый к насекомым и вирусным болезням (Bollgard); кукуруза, толерантная к гербициду глифосату и кукурузной мухе (Yield Gard) и др. [2].
За прошедший период генетически модифицированные (ГМ) коммерческие сорта показали высокую эффективность и преимущество перед сортами, созданными с помощью традиционной селекции, поэтому посевные площади под ними стремительно расширяются. По данным Международной службы по мониторингу за применением агробиотехноло-гий (ISAAA), посевы ГМ культур увеличились более чем в 100 раз с 1,7 млн га в 1996 г. до 175,2 млн га в 2013 г. ГМ культуры выращивают в 27 развитых и развивающихся странах, лидерами среди которых являются США, Бразилия, Аргентина, Индия и Канада. На территории Евросоюза в 2013 г. биотехнологические культуры выращивали в Испании, Португалии, Чехии, Румынии и Словакии.
Генетически измененные растения с устойчивостью к различным классам гербицидов остаются наиболее успешным биотехнологическим продуктом. По данным FAO, в мире зарегистрировано 192 трансгенные формы различных видов растений, толерантных к гербицидам, что составляет 52% от общего количества ГМ растений [3]. Компания Dow
AgroSciences (США) заявила о выпуске на рынок ГМ сортов сои и кукурузы с одновременной устойчивостью к глифосату и 2,4-D. В случае одобрения государственными структурами США эти культуры будут представлять начало второго поколения ГМ сельскохозяйственных культур [4].
Накопленные знания о механизмах патогенеза и современные возможности генетической инженерии позволяют создавать ГМ растения, устойчивые к насекомым-вредителям, грибным, бактериальным и вирусным инфекциям [5-9]. По последним данным, 172 трансгенные формы различных видов растений с устойчивостью к насекомым прошли или проходят процедуру оценки биобезопасности [3]. В 2011 году появилась работа, в которой приводятся данные о создании трансформантов, устойчивых к болезням, вызываемых вироидами. Получены трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген рибозима hammerhead, транскрипты которого расщепляют минус цепь РНК веретеновидного вироида клубней картофеля [10]. Двадцать одна зарегистрированная форма относится к категории ГМ растений с улучшенными признаками, связанными с урожайностью и качеством продукции растениеводства, а также с синтезом вторичных метаболитов, включая вещества для медицины [3, 11, 12, 13].
В последние годы большое значение приобретают работы по созданию растений, устойчивых к неблагоприятным факторам среды: холод, засуха, засоление почвы, повышенное содержание тяжелых металлов и др. [14, 15, 16].
Международная служба мониторинга за применением агробиотехнологий составила рейтинг посевов биотехнологических культур, согласно которому соя, кукуруза, хлоп-
чатник, рапс занимают лидирующие позиции. В 2013 г. на мировой рынок вышли ГМ-сорта люцерны, сахарной свеклы, папайи, тыквы, тополя, томатов и перца [17]. В мире существует единственная коммерческая ГМ линия льна масличного CDC Triffid на основе сорта Norlin, устойчивая к гербициду сульфонилмо-чевине [18].
Генетическая трансформация льна масличного
Первое сообщение о возможности проведения генетической трансформации льна с помощью A. tumefaciens появилось в 1983 году. Hepburn et al. в эксперименте наблюдали развитие галла на эксплантах льна после инфицирования агробактериями [19]. В 1987 году Basiran et al. опубликовали работу с описанием регенерации трансформированных побегов через стадию каллусогенеза [20]. Генетическая трансформация льна была осуществлена при использовании разоруженных векторов A. tumefaciens, которые включали ген nptII и дикий тип гена, синтезирующего нопалин. В дальнейшем Zhan et al. описали регенерацию побегов льна, трансформированных с помощью Agrobacterium rizogenes [21]. Семядоли, использованные в качестве эксплантов для трансформации, формировали трансформированные корни, которые впоследствии регенерировали модифицированные побеги. Подтвержденная агробактериальная трансформация льна и последующее создание генетически модифицированных растений с устойчивостью к глифосату представлена в работе M. Jordan и A. McHughen [22]. Глифосату стой-чивые растения были получены в результате встройки гена 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат синтазы (EPSPS) при трансформации гипокотильных эксплантов льна. В этом же исследовании впервые сообщалось об обнаружении так называемых «ложных трансформантов» (в англ. лит. - "escapes") - растений, приспособившихся к существованию на селективной среде с антибиотиком или гербицидом, но не содержащих в своем геноме чужеродной ДНК.
Получены трансгенные растения льна с устойчивостью к гербициду хлорсульфу-рону [23]. Известна попытка ввести ген фосфотрицин-К-ацетилтрансферазы (pat),
придающий устойчивость к неселективному гербициду глюфосинату, однако полевые испытания растений-трансформантов льна не были успешны [24].
Дальнейшие работы в области создания генетически модифицированных растений льна были направлены на повышение эффективности технологии, предложенной M. Jordan и A. McHughen. Проводились исследования периода сокультивации растительных экс-плантов и агробактерий, периода прекультива-ции, рассматривались вопросы наследования признаков потомками генетически модифицированных растений, а также причины появления химерных растений-регенерантов [25-30]. F. Lamblin с соавт. представили ген фосфоманнозной изомеразы (pmi) в качестве альтернативного селективного маркера генам устойчивости к антибиотикам в экспериментах по получению трансгенных растений льна [31]. M.Wrobel-Kwiatkowska с соавт. предприняли попытку улучшить устойчивость льна к Fusarium oxysporum и Fusarium culmorum путем введения гена ß-1,3-глюканазы из картофеля. Полученные трансгенные растения оказались в три раза устойчивее к фузариоз-ному увяданию, чем немодифицированные формы [32].
В качестве альтернативного способа прямой трансформации был предложен метод биобаллистики [33, 34]. Метод биобаллистики считается одним из перспективных способов введения чужеродной ДНК. Он пригоден для трансформации любых растительных объектов, тканей и органов; не нуждается в сложных векторных конструкциях; возможна прямая регенерация трансгенных побегов минуя каллус; возможно введение нескольких генов одновременно. Метод биобаллистики был адаптирован для изучения транзиентной экспрессии различных специфических промоторов. H. Drex-ler с соавт. проводили поиск сильного растительного промотора, способного обеспечить высокую экспрессию целевого гена в семенах льна. Авторами показано, что промотор гена usp (кодирующий белок семян Viciafaba L.) и промотор гена leb4 (кодирующий запасающий белок легумин семян Vicia faba L.) могут быть успешно использованы для экспрессии гетеро-логичных генов в семенах льна при получении трансгенных растений [35].
Генетическая трансформация льна-долгунца
Проводятся эксперименты по использованию агробактериальной, PEG-индуцированной и биобаллистической трансформации для создания модифицированных растений льна-долгунца. В результате применения этих методов на гипокотильных эксплантах льна-долгунца удалось регенерировать трансгенный каллус, устойчивый к канамицину [36]; создать первичные растения-трансформанты, несущие химерные или антисмысловые встройки [37, 38]; растения льна-долунца, устойчивые к гербицидам группы хлорсульфурона [39]. Получены первичные растения-трансформанты дикорастущих видов льна, содержащие маркерные гены nptII, gus [40].
S. Rakousky с соавт. предложили использовать ген устойчивости к гигромицину В качестве альтернативного селективного маркерного гена, что значительно снизило образование нетрансформи-рованных побегов льна-долгунца [41]. М. Бело-ноговой разработан метод трансформации семядольных эксплантов льна-долгунца, и получены растения с репортерным геном ß-глюкуронидазы (gus). Установлено, что наличие в используемой для трансформации конструкции последовательности внутренней инициации трансляции IresMPcr75, выделенной из генома тобамовируса крестоцветных, вызвало увеличение эффективности трансляции по сравнению с экспрессией гена в линиях трансгенных растений, полученных после трансформации с конструкциями, не имеющими такой последовательности [42]. М.Wrobel-Kwiatkowska с соавт. начали работы по улучшению качества льноволокна. С помощью технологии РНК-интерференции было увеличено содержание предшественника лигнина и сокращено содержание пектина и гемицеллюлозы у трансгенных растений льна-долгунца, что может положительно сказаться при экстракции волокна. В этом же исследовании отмечено, что полученные трансгенные растения были в два раза чувствительнее к Fusarium oxysporum. Грибы, принадлежащие к данному роду, используются при мочке льна, поэтому предполагается, что данный процесс будет проходить намного эффективнее на растениях льна-долгунца с повышенной восприимчивостью [43]. Этими же исследователями созданы трансгенные растения льна-долгунца, в геном которых включены три бактериальных
гена phbA, phbB, phbC, кодирующих ключевые ферменты биосинтеза полигидроксиалканоатов. Успешная экспрессия данных генов способствовала накоплению в стебле трансгенных растений льна-долгунца такого соединения как полиги-дроксибутират, которое значительно улучшило упругие свойства волокна. В то же время у модифицированных растений отмечено сокращение содержания лигнина, пектина и гемицеллюлозы, а также значительное увеличение уровня феноль-ных кислот, при этом снижения урожайности не обнаружено [44].
M.Beranova с соавт. предложили использовать ультразвуковую обработку гипокотиль-ных и семядольных эксплантов льна-долгунца перед проведением агробактериальной трансформации. Электронная микроскопия показала, что после воздействия ультразвука на поверхности растительного экспланта остаются микропоры, что, по мнению исследователей, облегчает проникновение чужеродной ДНК. Транзиентая экспрессия гена gfp в клетках трансформированного каллуса наблюдалась в течение 30 дней [45]. J. В^о с соавт. проверяли возможность применения метода агро-бактериальной инфильтрации листьев для создания трансгенных растений льна-долгунца. В течение 6-7 дней после инфильтрации они наблюдали транзиентную экспрессию репор-терного гена ^ в эндоплазматическом рети-кулуме клеток листа [46].
Генетическая трансформация льна-долгунца химерным геном ^р-Шаб
Несмотря на определенные успехи в области генетической трансформации льна, получение стабильно воспроизводимых трансгенных линий до сих пор остается трудноразрешимой задачей, что делает особенно актуальным изучение особенностей создания, развития и репродукции ГМ линий данной сельскохозяйственной культуры.
Эффективность генетической трансформации чужеродными генами в значительной степени зависит от выбранного генотипа, который определяет частоту образования мор-фогенного каллуса, эффективность регенерации проростков, выживаемость растительной ткани после воздействия селективных сред. Для льна-долгунца характерны значительные генотипические различия по регенерационной
способности [47, 48]. В наших исследованиях эксперименты по генетической трансформации проводились на сортах льна-долгунца белорусской селекции Белита и Василек, для которых выбранные условия культивирования являются оптимальными для реализации их морфогенетического потенциала [49]. Для аг-ротрансформации мы использовали сегменты гипокотилей пятидневных проростков льна-долгунца длиной 3-5 мм, которые помещали на агаризованную среду МС-БН и предкуль-тивировали в течение 48 ч. Наши наблюдения показали, что данный этап является обязательным при проведении агробактериальной трансформации льна-долгунца. В противном случае количество выживших эксплантов после трансформации резко снижается, а в некоторых экспериментах погибают все экспланты.
Отбор первичных трансформантов был основан на толерантности модифицированных клеток и тканей к канамицину, поскольку встраиваемая плазмида несла маркерный ген ^Ш.
Для проведения генетической трансформации использована конструкция с геном тубу-лина, «слитым» с репортерным геном ^ [50, 51, 52]. Анализ новообразований с помощью конфокального микроскопа подтвердил инкорпорацию GFP-меченого тубулина в клетки каллуса, сформировавшегося на гипокотиль-ных эксплантах. Встроенный химерный ген gfp-tua6 экспрессировался не только в клетках модифицированного каллуса, но и в побегах, сформировавшихся на каллусах. После трех месяцев культивирования на селективной среде выжило 23 первичных растения-трансформанта льна-долгунца, ДНК которых была исследована с помощью молекулярно-генетического анализа. Встройка маркерного гена и 35S промотора обнаружена у 17-ти растений-трансформантов, последовательность только 35S промотора найдена у 4-х растений-трансформантов. По некоторым данным, генетическая конструкция может встраиваться в ядерный геном растений в виде фрагментов [53] и только с помощью секвени-рования возможно установить полноценность встройки.
С применением биобалистической трансформации гипокотильных эксплантов льна-долгунца сорта Василек получены транс-
генные растения, несущие генетическую конструкцию с химерным геном gfp-tua6. Трансгенный статус первичных трансформантов подтвержден с использованием конфокальной микроскопии. Методом ПЦР-анализа доказана достоверность встройки последовательности 35S промотора и селективного маркерного гена у семи из десяти растений [54].
Характеристика трансгенных линий льна
Жизнеспособные трансгенные растения послужили основой для создания самоопыленных линий: В-1 (агробактериальная трансформация сорта Белита), У-1, У-2, У-3 (биобаллистическая трансформация сорта Василек). Все линии воспроизводились в теплице в течение трех генераций, и в каждом поколении проводился отбор истинных растений-трансформантов с помощью ПЦР-анализа. Следует отметить, что трансгенные линии достоверно не отличались друг от друга и от исходных сортов по продолжительности фенологических стадий и высоте растений, тогда как количество коробочек и количество семян в коробочке снизилось уже в первый год воспроизведения [55]. Аномалии в развитии цветков, пыльников, зародыша и эндосперма, приводящие к снижению репродуктивной функции, выявлены и у других видов трансгенных растений, например, табака и томата. При этом наблюдаются нарушения как в процессе мейотического деления клеток, так и в микроспорогенезе [56, 57, 58]. С целью выяснения причин снижения семенной продуктивности трансгенных линий было проведено изучение мейоза этих линий на стадиях мета-фазы I и анафазы I.
Сравнительное изучение мейоза выявило, что при его нормальном течении у изучаемых линий наблюдалось 15 бивалентов в основном открытых. Встречались клетки, содержащие унивален-ты в метафазе I. Наличие открытых бивалентов не нарушает общего течения мейоза, но может указывать на ослабление конъюгации. Отсутствие конъюгации хромосом является причиной нарушений при прохождении последующих стадий мейоза. В норме центромерные районы объединенных в биваленты хромосом ориентированы к полюсам веретена деления. Полярная
ориентация унивалентных хромосом в клетках исследуемых линий нарушена - чаще всего они находятся за пределами метафазной пластинки, сбоку от нее или у полюсов микроспороцита. Клетки с нарушениями (клетки с унивалента-ми и т.д.) составили у контроля: сорт Василек -2,19% и сорт Белита - 1,98% , что не является критическим. У трансгенных линий процент клеток с нарушениями составил: У-2 - 3,84% и У-3 - 5,67%; В-1 - 3,01%. В исследованном материале встречались клетки как с тривалентами, так и с квадривалентами. Основной тип нарушений у линий в анафазе I и анафазе II состоит в отставании нескольких хромосом от основной группы деления и образовании мостов. Большинство отстающих хромосом не достигает полюсов и остается в цитоплазме. Когда наступает телофаза, они становятся микроядрами в клетках диад. Были выявлены клетки с дегенерацией хромосом. В результате подобных нарушений формируются гаметы с несбалансированным числом хромосом, что приводит к снижению фертильности пыльцы и обуславливает нарушение репродуктивной функции. По-видимому, встраивание в геном трансформантов льна-долгунца генетической конструкции методами как биобаллистической, так и агробактериаль-ной трансформации не имеет специфичности и может приводить к различным структурным изменениям хромосом. Эти изменения незначительно отражаются на морфологии растений трансгенных линий, но в разной степени нарушают течение мейоза, что приводит к различной динамике снижения числа завязавшихся семян. Наше исследование показало, что фактором нестабильности репродукции трансгенных линий льна-долгунца, возможно, является нарушение мейоза, вызванное встройкой чужеродной генетической конструкции, что может приводить к прекращению воспроизводства созданных трансгенных линий.
Растения «ложные трансформанты»
Последствия воздействия генетической трансформации могут рассматриваться как сложный, многоуровневый биотический стресс. Особенность проявления стресса заключается в том, что растение, будучи лишенным пространственной подвижности, необходимой для поиска лучшего места обитания, компенсирует это повышенной геномной и фи-
зиологической «подвижностью», «пластичностью», позволяющей гибко приспосабливаться к стрессовым факторам различной природы [59]. В ответ на любой вид стресса у растения происходит активация окислительных ферментов, что может стать причиной целого спектра изменений в ДНК - от точечных мутаций до таких крупных изменений, как аберрации и полиплоидия [60]. Одним из побочных эффектов трансгенеза является появление растений, так называемых «ложных трансформантов» (в англ. лит. - "escapes"), приспособившихся к существованию на селективной среде, но не содержащих в своем геноме чужеродной ДНК. Такие растения являются уникальными, расширяют спектр генетической изменчивости и могут быть полезны для создания форм с ценным сочетанием признаков [61].
Молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов льна-долгунца выявил пять растений, которые не несли трансгенной вставки, но росли на селективной среде. Четыре из них успешно адаптировались к условиям ex vitro и выращивались в контролируемых условиях климатической камеры. Наблюдения за онтогенезом данных растений показали, что фенологические стадии роста (елочка, быстрый рост, бутонизация, цветение, спелость) были намного продолжительней, чем у исходных сортов. Так, стадия бутонизации наступила только после 180 дней роста, тогда как весь вегетационный период у исходных сортов максимально составляет 105 дней. В результате самоопыления растений «ложных трансформантов» были получены семена, которые разделили на группы: для испытания в естественных условиях, для испытания в условиях in vitro.
Регенерационная способность гипокотиль-ных эксплантов «ложных трансформантов» была в 3-4 раза ниже, чем у эксплантов контрольных сортов. Кроме того, у растений «ложных трансформантов» обнаружено довольно редкое для льна явление - полиэмбри-ония семян. Анализ метафазных пластинок корневых чехликов установил, что одна пара близнецов «ложных трансформантов» составляла сочетание гаплоидного и диплоидного растения, другая - двух гаплоидных растений.
До настоящего времени не проводились исследования, связанные с изучением «ложных трансформантов», появление которых, по на-
шему мнению, можно рассматривать как естественный соматический мутагенез, усиленный культивированием организма в стрессовых условиях (генетическая трансформация). Для дальнейшего исследования растений «ложных трансформантов» нами были созданы самоопыленные линии на их основе: EsV-1, EsV-2, EsV-3, EsB-1, которые воспроизводились в полевых условиях в течение двух вегетационного периодов.
Сравнительный анализ морфологических признаков первого года воспроизводства линий «ложных трансформантов» показал достоверное превышение линиями EsV-3, EsB-1 уровня контрольных сортов (исходных сортов Василек, Белита) по признакам «общая высота растения» и «техническая длина»; линией EsV-3 - по признаку «количество коробочек». При сравнении вариации морфологических признаков оказалось, что контрольные сорта более однородны, чем линии «ложных трансформантов» первого года воспроизводства [61]. В исследованиях А. Полякова отмечено, что популяции растений-регенерантов первого поколения по высоте и технической длине стебля находятся на уровне исходного сорта или выше, а по числу коробочек и семян на уровне или ниже контроля [62]. В других работах показано, что в большинстве случаев происходит снижение средних значений по количественным признакам, но возможно появление форм с положительными свойствами [63, 64].
Первичная оценка морфоанатомических показателей линий «ложных трансформантов» показала, что в стеблях растений формируются волокна граненой формы с небольшим внутренним просветом и в большом количестве в одном лубяном пучке, кроме того, растения линии EsV-2, EsV-3 достоверно превзошли уровень контрольного сорта Василек по числу элементарных волокон на срезе на 12,2%, что характерно для перспективных по качеству волокна форм льна-долгунца [61].
Результаты второго года полевых испытаний «ложных трансформантов» обнаружили, что изменчивость признака «общая высота растения» у линий EsV-1, EsV-3, EsB-1 достоверно ниже, чем у контрольных сортов. Следует отметить, что для линии EsB-1 характерна меньшая изменчивость и по всем остальным признакам, что свидетельствует о сбалансированности сформировавшегося генотипа.
Сомаклональные изменения могут иметь как наследственную генетическую природу, так и являться длительными модификациями. Применение молекулярных методов на разных этапах культивирования клеток дает возможность отслеживать генетическую изменчивость и делать предположения о времени и природе возникновения мутаций. С помощью RAPD- и ISSR-анализа были обнаружены изменения ДНК у сомаклонов гороха [63]. Недостаточно высокая разрешающая способность RAPD-метода при анализе полиморфизма близкородственных генотипов обусловила выбор нами микросателлитного анализа как высоковоспроизводимого, более точного и информативного.
Для выявления возможных изменений в геноме растений «ложных трансформантов» проведен SSR-анализ внутрилинейного и межлинейного ДНК- полиморфизма первого семенного поколения. Молекулярно-генетический анализ с помощью 10 информативных праймеров [65, 66] не обнаружил различий между индивидуальными растениями внутри линий «ложных трансформантов», что подтверждает генетическую однородность данных форм.
При сравнении микросателлитных профилей амплификации линий «ложных трансформантов» и контрольных сортов установлен полиморфизм по шести локусам Lu2, Lu13, Lu17, Lu2l, Lu23, Lu28, при этом обнаружены отличия аллельного состава как между линиями, так и между линиями и контрольными сортами [61]. Подавляющая доля мутаций в микросателлитных локусах возникает за счет специфической ошибки репликации ДНК в районе микросателлита - проскальзывания (англ. slippage), что приводит к появлению ал-леля нового размера. В то же время часть микросателлитных мутаций может изменять количество повторов как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения (на два и более повторов). Мутационные изменения, затрагивающие размеры микросателлитных кластеров и число микросателлитных звеньев, изменяют такие важные молекулярно-биологические и биохимические характеристики как нуклео-тидный состав, GC-содержание локусов, энергию Гиббса образования ДНК/ДНК-дуплекса, соотношение молекулярных масс 5'-3' и 3'-5' последовательностей.
Проведенный нами молекулярно-генети-ческий анализ с помощью SSR-маркеров позволил впервые обнаружить изменения в геноме потомства растений «ложных трансформантов» льна-долгунца и выявить отличия по генетической структуре от исходных форм.
При адаптации к определенным стрессовым факторам окружающей среды в некоторых линиях льна-долгунца (генотрофы), а также сортах происходят наследуемые изменения генома, которые связаны с появлением вставки LIS-1 - последовательности нуклеотидов размером 5,7kb, которая встраивается в единичной копии в определенный сайт генома льна. В большинстве случаев появление LIS-1 специфически ограничивается особями (генотипами), реагирующими на ростовые условия, модифицируя свой геном в специфических условиях роста и, если условия не сохраняются, LIS-1 теряется. Однако встречаются генотипы, у которых вставка LIS-1 стабильно наследуется вне зависимости от условий и фенологических фаз развития [67]. Мы предположили, что стрессовые условия длительного культивирования in vitro при проведении генетической трансформации могли индуцировать перестройку и объединение последовательностей ДНК во вставку LIS-1 у растений «ложных трансформантов».
При анализе ДНК индивидуальных растений линии EsV-1 нами обнаружена вставка LIS-1. Получен положительный результат амплификации с праймерами к соответствующим концевым последовательностям LIS-1 у всех проанализированных индивидуальных растений линии EsV-1. При анализе ДНК линий EsV-2, EsV-3 и исходного сорта Василек вставки LIS-1 не обнаружено. Полученные данные подтверждают тот факт, что появление фрагмента ограничивается особями (генотипами), которые специфически реагируют на условия культивирования и модифицируют свой геном.
ПЦР-анализ ДНК линии EsB-1 дал положительный результат при амплификации с прай-мерами к последовательности LIS-1, при этом у исходного сорта Белита данный фрагмент не амплифицировался.
Возможно, что именно стрессовые условия культивирования in vitro при проведении генетической трансформации индуцировали появление вставки LIS-1 у растений «ложных трансформантов». При этом можно утверждать, что
исходные сорта Василек и Белита относятся к «пластичным» формам и в их геноме присутствуют короткие последовательности, из которых при определенных условиях собирается LIS-1. BLAST анализ генома сорта Bethune, который относится к «непластичным», не обнаружил соответствующие участки LIS-1, поэтому инсерция у данного сорта невозможна [68].
LIS-1 является первым подобным событием, описанным для сложных генетических систем, когда происходит специфическая воспроизводимая комплексная перестройка генома. Оригинальностью данного события является и то, что происходит оно в ответ на решение конкретных проблем роста и может быть стабильно передано потомству [67, 69]. Мы проанализировали два поколения линии EsB-1, выращенных в естественных условиях окружающей среды, и обнаружили стабильное наследование LIS-1. Безусловно, генотипы, имеющие вставку LIS-1, заслуживают особое внимание при дальнейших исследованиях механизмов адаптации льна к неблагоприятным факторам внешней среды. Кроме того, полагают, что гены, контролирующие ответ на стрессовое воздействие, тесно связаны с генами, контролирующими высокое качество льняного волокна, и наследуются сцепленно [70]. Современная селекция льна-долгунца ориентирована в основном на улучшение прядильных свойств льноволокна, и изучение генотипов, имеющих вставку LIS-1, представляет несомненный интерес.
Заключение
Изучение трансгенных линий льна-долгунца, экспрессирующих химерный ген gfp-tua6, созданных методами агробактериальной и биобаллистической трансформации, показало, что фактором нестабильности репродукции, возможно, является нарушение мейоза, вызванное встройкой чужеродного гена. Последствия генетической трансформации могут рассматриваться как сложный многоуровневый биотический стресс, который приводит к целому спектру изменений в ДНК трансформируемого растения. Впервые проведены молекулярно-генетические исследования растений «ложных трансформантов», которые обнаружили изменения в геноме. Появление и стабильное наследование вставки LIS-1 у линий «ложных трансформантов» заслуживает особого внимания при дальнейших исследованиях механизмов адаптации льна.
Список использованных источников
1. Expression of chimeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector / L. Herrera-Estrella [et al.] // Nature. - 1983. -Vol. 303, № 5915. - P. 209-213.
2. Статус коммерческих биотехнологических / ГМ культур в мире: 2010 г. // Клайв Джеймс ISAAA [Электронный ресурс]. -Режим доступа: http://www.isaaa.org. - Дата доступа: 25.07.2011.
3. FAO GM Food Platform [Electronic resource] - Mode of access: http://fao.org/gm-platform. - Date of access: 30.07.2014.
4. Biosafety Information Centre [Electronic resource] - Mode of access: http://www.biosafe-ty-info.net. - Date of access: 30.07.14.
5. Enhanced resistance to blast (Magna-porthe grísea) in transgenic japonica rice by constitutive expression of rice chitinase Revue / Y. Nishizawa [et al.] // Theor. And Appl. Genetics. - 1999. - Vol. 99, № 3-4. - P. 383-390.
6. Альфа-дефензины - антимикробные пептиды нейтрофилов: свойства и функции / А.С. Будихина [и др.] // Иммунология. -
2008. - Т. 29, № 5. - С. 317-320.
7. Expression of the bacterial gene CspD in tobacco plants increases their resistance to fungal and viral pathogens / K.A. Kromina [et al.] // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. - 2006. - Part 3. -P. 100-104.
8. Растение как объект биотехнологии / А.В. Бабикова [и др.] // Комаровские чтения. -2007. - Вып. LV. - C. 184-212.
9. Viral Protection in Transgenic Tobacco Plants Expressing the Cucumber Mosaic Virus Coat Protein or its Antisense RNA / M. Cuozzo [et al.] // Nature Biotechnology. - 1988. - Vol. 6, № 5. - P. 549-557.
10. Trans-cleaving hammerhead ribozymes with tertiary stabilizing motifs: in vitro and in vivo activity against a structured viroid RNA / A. Carbonell [et al.] // Nucleic Acids Res. -2011. - Vol. 39, № 6. - P. 2432-2444.
11. High lysine and high tryptophan transgenic maize resulting from the reduction of both 19-and 22-kD alpha-zeins / S. Huang [et al.] // Plant. Mol. Biol. - 2006. - Vol. 61, № 3. - P. 25-35.
12. Symposium on Nutrition Security for India. Issues and Way forward // Indian National Science Academy / [Electronic resource]. -
2009. - Mode of access: http://typo3.fao.org/
fileadmin/user_upload/fsn/docs/Symposium_ Report_Nutrition_Security_India.pdf. - Date of access: 08.12.2011.
13. Starch metabolism in tubers of transgenic potato (Solanum tuberosum) with increased ADP-glucose pyrophosphorylase / J. Lee [et al.] // Bio-chem. J. - 1996. - Vol. 320, Part 2. - P. 493-498.
14. Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects / Pooja Bhatnagar-Mathur [et al.] // Plant Cell. Rep. - 2008. - Vol. 27, № 3. - P. 411-424.
15. Transgenic plants tolerant to abiotic stresses / Ya. S. Kolodyazhnaya [et al.] // Cytology and Genetics. - 2009. - Vol. 43, № 2. - P. 132-149.
16. Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance / W. Wang [et al.] // Planta. -2003. - Vol. 218, № 1. - P. 1-17.
17. International Service For The Acquisition Of Agri-Biotech Applications [Electronic resource]. - Mode of access: www.isaaa.org. -Date of access: 30.07.14.
18. McHughen A. Pandora's picnic basket. The Potential and Hazards of Genetically Modified Foods / A. McHughen. - New York: Oxford University Press Inc., 2000. - 281 p.
19. Nopalin Ti-plasmid, pTiT37, T-DNA insertion into a flax genome / A.G. Hepburn [et al.] // J. Mol. Appl. Genet. - 1983. - Vol. 2, № 2. -P. 211-224.
20. Genetic transformation of flax (Linum usitatissimum L.) by Agrobacterium tumefa-ciens. Regeneration of transformed shoots via callus phase / N. Basiran [et al.] // Plant Cell Rep. - 1987. -Vol. 6, № 5. - P. 396-399.
21. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes / X. Zhan [et al.] // Plant Mol. Biol. - 1988. - Vol. 11, № 5. -P. 551-559.
22. Glyphosate tolerant flax plants from Agro-bacterium-mediated gene transfer / M.C. Jordan [et al.] // Plant Cell Rep. - 1988a. - Vol. 7, № 4. - P. 281-284.
23. McHughen, A. Agrobacterium mediated transfer of chlorsulfuron resistance to commercial flax cultivars / A. McHughen // Plant Cell Rep. - 1989. - Vol. 8, № 8. - P. 445-449.
24. Development and preliminary field testing of a glufosinate-ammonium tolerant transgenic flax / A. McHughen [et al.] // Can. J. Plant Sci. -1995. - Vol. 75, № 1. - P. 117-120.
25. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax / L. Mlynarova [et al.] // Plant Cell Rep. - 1994. - Vol. 13, № 5. - P. 282-285.
26. Patterns of transformation intensity on flax hypocotyls inoculated with Agrobacterium tu-mefaciens / J.Z. Dong [et al.] // Plant Cell Rep. -1991. - Vol. 10, № 11. - P. 555-560.
27. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens / J.Z. Dong [et al.] // Plant Sci. -1993(a). - Vol. 88, № 1. - P. 61-71.
28. А preculture period рпог to Agrobacte-rium tumefaciens inoculation increases production of transgenic plants / McHughen А. [et al.] // J. Plant. Physiol. - 1989. - Vol. 135, № 2. -Р. 245-248.
29. Transgenic flax plants from Agrobacte-rium tumefaciens transformation - incidence of chimeric regenerants and inheritance of transgenic plants / J.Z. Dong [et al.] // Plant Sci. -1993(b). - Vol. 91, № 2. - P. 139-148.
30. Construction of intron-containing marker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant transformation / G.Vancanneyt [et al.] // Mol Gen Genet. -Vol. 220, № 2. - P. 245-250.
31. The use of the phosphomannose isomerase gene as alternative selectable marker for Agro-bacterium mediated transformation of flax (Li-num usitatissimum) / F. Lamblin [et al.] // Plant Cell Rep. - 2007. - Vol. 26, № 6. - P. 765-772.
32. Expression of P-1,3-glucanase in flax causes increased resistance to fungi / M. Wro-bel-Kwiatkowska [et al.] // Physiol. Mol. Plant Pathol. - 2004. - Vol. 65, № 5. - P. 245-256.
33. Wijayanto, T. Gene transfer to flax (Linum usitatissimum L.) using particle bombardment: M.Sc. diss. / T. Wijayanto; University of Saskatchewan - Saskatoon, SK, Canada, 1998.
34. Genetic trensformation of Linum by particle bombardment / Wijayanto T [et al.] // In vitro Cell Dev. Biol. Plant - 1999. - Vol. 35, № 6. -P. 456-465.
35. Evaluation of putative seed-specific promoters for Linum usitatissimum / H.S. Drex-ler [et al.] // Mol. Breeding. - 2003. - Vol. 11, № 2. - P. 149-158.
36. Чикризова, О.Ф. Создание форм льна-долгунца на основе генетической транс-формацииA. tumefaciens: автореф. дис. .. .канд.
сельхоз. наук: 06.01.05, 03.00.23 / О.Ф. Чикризова; Всерос. научно-исслед. инст. Льна. -Москва, 1997. - 18 с.
37. Plant cell and biotechnology studies in Li-num usitatissimum - a review / S. Millam [et al.] // Plant Cell Tissue Org. Cult. - 2005. - Vol. 82, № 1. - P. 93-103.
38. Гузенко, Е.В. Трансформация различных генотипов льна-долгунца с помощью Agrobac-terium tumefaciens: предварительные результаты / Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, А.И. Емец, Я.Б. Блюм, Н.А. Картель // Факторы экспериментальной эволюции организмов: материалы IV межд. науч. конф., Алушта, 22-26 сент. 2008 г. / НАН Украины, НААН Украины, Укр. Об-во генетиков и селекционеров им. М.И. Вавилова; редкол. В.А.Кунах и др. - К.: Логос, 2008. - С. 268-273.
39. Оптимизация условий получения трансгенных растений льна-долгунца, устойчивых к гербицидам группы хлорсульфурона / О.Ф. Чикризова [и др.] // Сельхоз. Биология. -1996. - № 3. - С. 117-121.
40. Каляева, М.А. Разработка эффективной системы генетической трансформации льна и дикорастущих видов рода Linum: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.12. / М.А. Каляева. -Пущино, 2001. - 145 с.
41. Hygromycin B - an alternative in flax transformation selection / S. Rakousky [et al.] // Plant. - 1999. - Vol. 42, № 3. - P. 361-369.
42. Белоногова М.А. Генетическая трансформация льна-долгунца (Linum usitatis-simum L.) с использованием семядольных эксплантов: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.12 / М.А.Белоногова. - Москва, 2006. - 129 с.
43. Lignin deficiency in transgenic flax resulted in plants with improved mechanical properties / M. Wrobel-Kwiatkowska [et al.] // J. Biotechnol. - 2007a. - Vol. 128, № 4. -P. 919-934.
44. Engineering of PHB Synthesis Causes Improved Elastic Causes Improved Elastic Properties of Flax Fibers / M. Wrobel-Kwiatkowska [et al.] // Biotechnol. Prog. - 2007b. - Vol. 23, № 1. - P. 269-277.
45. Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.) / M. Beranova [et al.] / Plant Cell Tiss Organ Cult Springer Science+Business Media. - 2008.
46. Green fluorescent proteins as a vital marker for non-destructive detection of transient transformation events in flax explants / J. Bleho [et al.] // Agriculture (Pol'nohospodarstvo). -2010. - Vol. 56, № 4. - P. 99-105.
47. Введение в культуру in vitro и регенерационная способность сортов льна-долгунца с различной устойчивостью к полеганию / О.А. Баер [и др.] // Физиол. биохим. культ. растений. - 2004. - Т. 36, № 1. - С. 48-54.
48. Шут, М.В. Культура in vitro и регенерация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), районированных в Беларуси / М.В. Шут // Весщ НАНБ. - 2005 - Т. 2, № 5. - С. 110-112.
49. Лемеш, В.А. Морфогенез и регенера-ционная способность сортов льна-долгунца, районированных в Беларуси / В.А. Лемеш, М.В. Богданова, Е.В. Гузенко, Л.В. Хотылева // Доклады НАН Беларуси. - 2006. - Т. 50, № 6. - С. 81-83.
50. Visualisation of microtubules in living cells of transgenic Arabidopsis thaliana L. / K. Ueda [et al.] // Protoplasma. - 1999. - Vol. 206, № 1. -P. 201-206.
51. Altered microtubule dynamics by expression of modified gfp-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants / T. Abe [et al.] // Plant J. - 2005 - Vol. 43, № 2. - P. 191-204.
52. Microtubule dynamics in living root hair: transient slowing by lipochitin oligosaccharide nodulation signals / V.N. Vassileve [et al.] // Plant Cell. - 2005. - Vol. 17, № 6. - P. 1777-1787.
53. Пермякова, Н.В. Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) и моркови (Daucus carota L.): автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.15 / Н.В. Пермякова; Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН. - Новосибирск, 2008. - 26 с.
54. Создание генетически модифицированных растений льна (Linum usitatissi-mum L.) методом биолистической трансформации / В.А. Лемеш [и др.] // Весщ НАН Беларусь Сер. бiял навук. - 2010. - № 1. -С. 18-23.
55. Особенности развития и репродукции трансгенных растений льна-долгунца / В.А. Лемеш [и др.] / (в печати)
56. Особенностипроявленияинаследования TPDl-фенотипа у инсерционного мутанта табака с длительным периодом цветения / Т.В. Баврина [и др.] // Физиол. растений. -2007. - Т. 54. - С. 730-737.
57. Чабан, И.А. Цитоэмбриологическое изучение трансгенных растений томатов с аномальным фенотипом / И.А. Чабан, М.Р. Халилуев, С.В. Долгов // Тезисы III Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности». Москва, 1821 октября 2010 г. - С. 84.
58. Преждевременный цитокинез в материнских клетках пыльцы трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) / Ю.В. Сидорчук [и др.] // Цитология. - 2008. -Т. 50, № 5. - С. 447-451.
59. Walbot, V The plasticity of the plant genome - is it a requirement for success? / V Walbot, C. Cul-lis // Plant Mol. Biol. Rep. - 1983. - Vol. 1. - P. 3-11.
60. Concepts in plant stress physiology. Application to plant tissue cultures / T. Gaspar [et al.] // J. Plant Growth Regulation. - 2002. - Vol. 37. -P. 263-285.
61. Гузенко, Е.В. Морфо-генетический полиморфизм популяций льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), сформированных на основе ложных трансформантов / Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, М.В. Богданова // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - Минск: Право и экономика, 2012. - Т. 13. - С. 1-14.
62. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна: Монография / А.В. Поляков. -2-е изд-е. - М., 2010. - 201 с.
63. Кузнецова, О.И. Молекулярно-гене-тический анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха: автореф. дис. ... канд. биол. наук / О.И. Кузнецова. - М., 2005. - 19 с.
64. Полонецкая, Л.М. Сравнительный анализ стабильности и генотипической изменчивости признаков продуктивности популяций льна-долгунца Linum usitatissimum L, сформированных на основе регенерантов соматического происхождения / Л.М. Полонецкая В.И. Сакович, Л.В. Хотылева / Материалы Международной научной конференции «Современные проблемы генетики», Минск, 17-18 ноября 2005 г.: Научные труды, Минск. - 2005. - С. 184.
65. Polymorphic microsatellite loci in Linum usitatissimum / C. Roose-Amsaleg [et al.] // Molecular Ecology Notes. - 2006. - Vol. 6. -P. 796-799.
66. Межсортовой полиморфизм геномов льна (Linum usitatissimum L.) по молекулярно-цитогенетическим маркерам / О.А.Рачинская [и др.] // Генетика. - 2011. - Т. 47, №2 1. - С. 1-11.
67. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax / Y. Chen [et al.] // Internat. Journ. Genet. and Molecular Biol. - 2009. -Vol. 1, № 3. - P. 38-47.
68. C. Bickel. Identification of genomic regions involved in stress responsiveness in flax by genetic mapping: PhD dissertation. - Case Western Reserve University. - 2011. -178 p.
69. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs incluced by environment / Y. Chen [et al.] // New Phytol. - 2005. - Vol. 167, № 1. -P. 171-180.
70. Cullis, C.A. Mechanisms and control of rapid genomic changes in flax / C.A. Cullis // Annals of Botany. - Vol. 95. - P. 201-206.
Дата поступления статьи 1 октября 2014 г.
