CC BY
175
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2016, том 51, № 5, с. 602-616
УДК 633.52:631.52:[573.6.086.83+577.21] doi: 10.15389/agrobiology.2016.5.602rus
ОСОБЕННОСТИ СЕЛЕКЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЛЬНА (Linum usitatissimum L.)
(обзор)
И.В. УЩАПОВСКИЙ1, В.А. ЛЕМЕШ2, М.В. БОГДАНОВА2, Е.В. ГУЗЕНКО2
История селекционно-генетических исследований льна (Linum usitatissimum L.) насчитывает более 100 лет, но их актуальность не снижается. Более 200 сортов этой культуры предлагается на международном рынке для возделывания на масло и волокно с объемом площадей соответственно около 1 млн га и 0,3 млн га ежегодно. Разнообразие агроклиматических условий в льносеющих странах и прогресс в технологиях переработки и применения льнопродукции определяют необходимость ускорения селекционного процесса, длительность которого в настоящее время составляет до 10-15 лет. Доминирующий метод создания сортов льна — внутривидовая гибридизация с последующей системой отборов. Базовый элемент селекционной работы — экологическое изучение и широкое вовлечение в гибридизацию не только лучших современных сортов, но и стародавних кряжей, местных и селекционных форм (С.Н. Кутузова с соавт., 2010; A. Diedrechsen с соавт., 2013). Пребридинговая работа направлена на преодоление ограничений традиционных методов гибридизации за счет особенностей комбинационной изменчивости (Л.Н. Павлова, 2010). Индуцирование рекомбинаций возможно при использовании стрессовых условий возделывания гибридных растений (А.А. Жученко мл. с соавт., 2009). Использование физических (у-излучение) и химических (нитрозометилмочевина, этиленимин, диметилсульфат) мутагенов значительно повышает выход мутантных форм масличного и долгунцового льна с положительными хозяйственно ценными признаками (М.И. Логинов с соавт., 2005; И.В. Ущаповский, 2013). Приведены примеры использования методов культуры клеток и тканей, расширяющие сомаклональную изменчивость и позволяющие получать селекционно-значимые линии льна, в том числе устойчивые к болезням (фузариоз, антракноз) (В.А. Лях с соавт., 2008; Н.В. Пролетова, 2010). Рассматриваются методы ДНК маркирования, позволяющие группировать генетический материал льна в соответствии с его генетической близостью, что позволяет оптимизировать подбор пар для гибридизации с целью сохранения максимального генетического разнообразия селекционного материала (Y.B. Fuetal, 2003; В.А. Лемеш с соавт., 2006). SSR маркирование рассматривается как перспективное направление для генетической идентификации линий и сортов льна (В.А. Лемеш с соавт., 2013), выявления меж- и внутривидовых генетических связей (J. Vromans, 2006), возможных связей маркеров с хозяйственно ценными признаками (В.А. Лемеш с соавт., 2012) и установления групп сцепления между маркерами (S. Cloutier, 2012). Представлена характеристика микро-сателлитных маркеров (SSR) у ряда генотипов льна. Рассматриваются аспекты официального применения молекулярных маркеров при испытании сортов по критериям ООС (отличимость, однородность, стабильность) в странах-участниках UPOV (International Union for the Protection of New Varieties of Plants). Выбор методов молекулярного маркирования должен быть согласован не только с технической, но и юридической позиций. Рассмотрены направления возможной интеграции традиционных селекционных методов и методов молекулярной биологии для создания новых сортов льна с заданными параметрами хозяйственно ценных признаков.
Ключевые слова: лен-долгунец, лен масличный, селекция, гибридизация, отбор, мутагенез, культура тканей, генетическое разнообразие, праймеры, SSR маркеры, PCR.
Из-за уникальных свойств волокна и масла лен (Linum usitatissimum L.) начал использоваться человеком еще на заре цивилизации и до сих пор представляет интерес для исследования. Это однолетнее растение с коротким вегетационным периодом (80-120 сут), небольшим числом хозяйственно ценных и морфологических признаков, малым коэффициентом размножения и мелким цветком, в котором к моменту открытия, как правило, уже происходит опыление, достаточно глубоко изучено в качестве сельскохозяйственной культуры. Однако его фило- и онтогенез, генетический контроль и характер наследования признаков остаются актуальным предметом изучения (1-4).
В результате доместикации и селекционной работы эта культура представлена чистолинейными сортами двух типов — прядильными (во-
локнистая продукция из стебля) и масличными (льняное масло и другие компоненты из семян). В настоящее время в льносеющих странах зарегистрировано свыше 250 сортов льна (5). По данным ФАО ^АО и^, площадь посевов льна в последние годы остается достаточно стабильной: масличного — более 2,3 млн га, прядильного — более 0,3 млн га (6). Так как интерес к продукции из льна возрастает в связи с использованием в различных областях промышленности и развитием доктрины экологически безопасной экономики, посевы культуры будут расширяться, а роль селекции в льноводстве — возрастать. При этом прядильный и масличный морфотипы льна необходимо рассматривать как единый объект селекционно-генетических исследований в силу их видовой схожести.
Цель нашего обзора — обобщить результаты и проанализировать перспективы использования молекулярно-генетических методов для изучения особенностей исходного материала и создания сортов льна.
Этапы развития работ по селекции льна. Как прикладная наука селекция льна известна с начала XX века с экспериментальных работ по индивидуальным отборам из популяций местных льнов, проведенных в Голландии L. Вгоекета и России Д.Л. Рудзинским, Н.А. Дьяконовым, Л.Ф. Альтгаузеном, К.Г. Ренардом (7-9). С тех пор селекция культуры в основном основывалась на сочетании простых и сложных скрещиваний с последующим отбором чистолинейного материала (10, 11). Практический опыт селекционера и большое количество исходных форм, проверяемых на различных фонах, определяют эффективность создания сорта (12). Сложности связаны главным образом с тем, что частная генетика льна изучена недостаточно, набор используемых менделевских генов невелик, в подавляющем числе случаев хозяйственно ценные характеристики сорта определяются количественными признаками, отсутствует координации между национальными исследовательскими проектами по льну.
В исторической ретроспективе временная шкала развития методов селекции льна может быть представлена следующим образом (рис.).
1 1 2 3 1 4 5 6 7 8 1
Сорта-популяции Сорта Мутагенные линии, сорта Генно-моди- Генетически Сорта с генетиче-
стародавние, чистоли- [синтетиче- фицирован- маркированные ским и экологи-
«кряжи» неиные ские ные сорта линии и сорта ческим паспортом
■--------> .....
Развитие методов селекции льна (1лпат usitatissimum L.) и типы создаваемых сортов: 1 — бессознательный отбор (с момента окультуривания в У11-У веках до н.э.); 2 — массовый отбор (Х111-Х1Х века); 3 — индивидуальный отбор (с начала ХХ века); 4 — гибридизация на основе мейотического рекомбиногенеза (с 1920-х годов); 5 — индуцированный мутагенез (с 1960-х годов); 6 — культура клеток и генетическая трансформация (с 1980-х годов); 7 — молекулярное маркирование (с 1990-х годов); 8 — интегрированный подход (по прогнозу с 2020-х годов).
На этапе бессознательного отбора началось использование растений льна для получения волокна и пищевых продуктов. Считается, что это происходило в период расцвета цивилизации Древнего Египта (7-5 тыс. лет назад), но есть предположения и о более ранних датах (10-30 тыс. лет назад) введения льна в культуру на территории Колхиды (13, 14). В результате сформировались популяции с незначительным влиянием фактора отбора, образцы тысячелетней эволюции которых и сегодня встречаются на территориях происхождения культурного льна, представляя ценный материал для его изучения. В большинстве случаев образцы таких популяций находятся в мировых коллекциях льна (4, 15-18). Классическим примером массового отбора из природных популяций льна служит многообразие так называемых «кряжей» (стародавние сорта) — полиморфных локальных популяций льна-долгунца, известных в крупных регионах льносеяния Руси с
ХП-ХШ веков. Кряжи (локальные популяции) имели более высокую урожайность и качество волокна в месте создания, но не обладали генетической стабильностью и выравненностью (1). В конце XIX века в Западной Европе и России появились селекционные научные школы. Впервые с использованием индивидуальных отборов, а впоследствии и скрещиваний были получены чистолинейные сорта (12). Основные направления селекции льна — продуктивность (урожай соломы, волокна, семян, масла, содержание волокна в стебле), качество (тонина и разрывная нагрузка волокна, жирнокислотный состав масла, содержание биоактивных веществ в семенах), устойчивость (к грибным заболеваниям, эдафическим и климатическим факторам), онтогенез (изменение вегетационного периода, межфазных периодов, синхронизация генеративного и вегетативного развития). Приоритетами уже почти столетие остаются высокий выход волокна или масла и устойчивость к болезням и полеганию.
В современных условиях создание сорта льна требует от 300 тыс. до 1 млн долларов США и длится более 10 лет (19). Наиболее успешным селекционным группам удается предлагать на рынке сортов до трех новых наименований ежегодно, но замену ими уже используемых затрудняют многие экономические и организационные причины (20). Стабильные сорта с приемлемыми хозяйственно ценными характеристиками (Л-1120, Оршанский 2, Белинка, Могилевский и др.) могут возделываться в течение десятилетий. Однако интенсификация производства требует вести селекцию на более высокую и стабильную урожайность качество льнопродукции (21, 22), а также на новые признаки или комбинации признаков (например, при создании сортов двойного назначения или озимого льна).
Комбинационная селекция и источники генетического разнообразия. Генетическая (мейотическая) рекомбинация остается основой наиболее эффективных методических подходов в селекции масличного и прядильного льна (простая гибридизация, беккроссирование, переопыление трех и более сортов, ступенчатые скрещивания), с помощью которых создано подавляющее большинство современных сортов льна-долгунца (21-24). Идентификация трансгрессивных форм позволяет формировать фонд отбора по параметрам продуктивности и качества волокна льна (25). Однако изучению особенностей рекомбинационной системы льна уделяется недостаточно внимания (26).
Важный источник генов хозяйственно ценных признаков для комбинационной селекции — рабочие, национальные и международные (под эгидой ФАО) коллекции льна (15, 17, 27-29), насчитывающие в совокупности более 25 тыс. единиц хранения. В процессе селекции льна-долгунца с 1930-х по 2000-е годы генетическое разнообразие культуры сузилось, что привело к усилению нежелательных корреляций между продуктивностью, скороспелостью и качеством (30). Следует признать, что генетическая изученность коллекций недостаточна, а примеры научного сотрудничества их крупных держателей редки, в то время как для понимания современного состояния генофонда льна, предотвращения необоснованного дублирования образцов под разными наименованиями, надежного сохранения и эффективного использования необходима объективная оценка генетического разнообразия (16, 31, 32). «Золотым фондом» коллекций считаются стародавние сорта и местные формы, полученные в результате длительного естественного и искусственного отбора, поскольку они лучше других приспособлены к локальным условиям произрастания, в том числе по длительности вегетационного периода (27). Изучение местных сортов позволяет не только получить представление об их основных свойствах, но и восстановить филогенетические связи, что важно для геногеографических исследований.
Среди молекулярно-генетических методов (33) отметим молекулярное маркирование, которое особенно эффективно в отношении видов со слабыми межсортовыми различиями (к их числу принадлежит лен). С использованием молекулярных методов у современных сортов льна выявлено уменьшение частоты редких и уникальных аллелей микросателлитных локусов и увеличение доли фиксированных рецессивных RAPD (random Amplification of polymorphic DNA) локусов, то есть сужение спектра генетической изменчивости (34). Показана высокая эффективность микросател-литного (simple sequence repeats, SSR) анализа при выявлении уникальных локусов, повышающих генетическое разнообразие культуры. На основании оценки полиморфизма микросателлитных локусов выделены источники редких и уникальных аллелей среди сортов льна масличного, льна-долгунца и белорусских ландрас, что ценно для селекции (35).
Индуцированный мутагенез. у-Облучение (200-900 Гр) семян льна позволяет получить в потомстве линии с положительно измененными хозяйственно ценными признаками (36), а химические мутагены (нитрозометилмочевина, этиленимин, диметилсульфат) приводят к значительному формобразованию, что проявляется в высоком (более 30 %) выходе мутантных семей в потомстве обработанных растений (37). Стрессор (гербицид) усиливает эффект этилметансульфоната (EMS) на льне-долгунце (38). Однако мутационная изменчивость используется для формообразования и отбора новых признаков недостаточно широко: за более чем полувековую историю с помощью радиационного и химического мутагенеза получено около 3 % от общего числа сортов льна-долгунца (39). Пример удачного применения экспериментального мутагенеза в селекции масличного льна — сорт с измененным жирнокислотным составом масла (коммерческий тип льна Solin). Показано, что низкое содержание а-линоле-новой кислоты у льна контролируют два рецессивных гена в независимых локусах. С применением EMS получены мутанты, у которых в поколении M2 выявлены растения, несущие мутации в обоих генах (40). В результате их самоопыления создана линия с содержанием линоленовой кислоты менее 2 % по сравнению с 49 % у родителей дикого типа (сорт McGregor). Также с помощью EMS выделены два мутанта (41) с содержанием лино-леновой кислоты примерно 30 %. При рекомбинации генов у этих мутантов стало возможным получить растения с содержанием линоленовой кислоты ниже 2 %, причем резкое сокращения количества линоленовой кислоты в семенах не сопровождалось изменением ее содержания в листьях (42). Значительная коллекция мутаций, индуцированных у-излучением и EMS (флоральные, ростовые и др.), получена на масличном льне (43).
В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси создан кодоми-нантный ДНК-маркер MutFad3, способный выявлять мутантный аллель fad3B гена синтеза ю3/А15-десатуразы льна при отборе генотипов с пониженным содержанием а-линоленовой кислоты в масле семян (44).
Культура клеток и тканей. Культура in vitro позволяет вовлекать в селекционный процесс генотипы, полученные на основе трансформации, диплоидизации гаплоидов, соматической изменчивости.
Лен как биотехнологический объект имеет длительную историю. Зародыши льна были одними из первых эмбриоидов, культивированных in vitro (45, 46), а первое сообщение о возможности инициировать точки роста на гипокотильных эксплантах льна сделано в 1946 году (47). В 1970-х годах появились публикации о влиянии различных биохимических компонентов питательных сред на морфогенетическую активность льна в культуре in vitro (48, 49). В 1976 году у фрагментов гипокотиля обнаружили способность образовывать побеги, развивающиеся в полноценные расте-
ния, а у изолированных протопластов — формирование каллусов с последующим ризогенезом (50). Те же исследователи установили зависимость регенерационной способности in vitro от генотипа эксплантов (50).
Первые объяснения различий процессов, протекающих in situ и in vitro в культуре зародышевой ткани, также были получены по результатам экспериментов на льне. Сначала в качестве исходного материала при соматическом эмбриогенезе льна использовали незрелые и зрелые зиготические эмбриоиды (51). Позже соматические эмбриоиды получили из сегментов гипокотилей семян льна, пророщенных in vitro (52), а также из протопластов альпийского льна (L. alpinum L.) (53). Сообщалось о влиянии ряда факторов (источник углерода, содержание общего азота, свободного стерола, соотношение кальция и зеатина) на соматический эмбриогенез гипокотиль-ных эксплантов у льна in vitro (54). Продолжается поиск стимуляторов (6-безиламинопурин и др.) каллусо- и органогенеза в культуре гипокотелей (55). Растения-регенеранты, полученные из гипокотилей, имели измененные хозяйственно ценные признаки, в том числе повышенную устойчивость к фузариозу (56). Изучение каллусогенеза и регенерации показало разную генетическую основу этих процессов (57).
В литературе описано создание гаплоидных и дигаплоидных линий льна-долгунца (58, 59) и льна-кудряша (60) посредством регенерации из культуры пыльников или микроспор. В настоящее время имеется значительное число отечественных селекционных линий, устойчивых к фузари-озу и антракнозу, полученных с использованием отборов in vitro на средах с токсинами патогенов (61, 62). Успешно развивается селекция in vitro на алюмо- и температурную устойчивость (63, 64). Очевидно, что сомаклональ-ная изменчивость расширяет возможности практической селекции льна. Кроме того, эксперименты in vitro углубляют представления об основах клеточного метаболизма у этой культуры.
Трансгенез льна. Первая успешная агробактериальная трансформация льна была проведена в 1987 году с использованием штамма Ag-robacterium tumefaciens, содержащего вектор на основе неонкогенной Ti-плазмиды с химерным nptII-геном и геном нопалин-синтазы дикого типа (65). В 1988 году появилось первое сообщение о трансформации льна другой патогенной бактерией — A. rhizogenes (66). В том же году были опубликованы результаты работы по получению генетически модифицированных растений льна масличного с устойчивостью к глифосату (67, 68). У таких растений при трансформации гипокотильных эксплантов произошла встройка гена 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSPS). Затем те же авторы получили трансгенные растения льна с устойчивостью к гербициду хлорсульфурону (68). Оценка потомства таких растений в лабораторных и полевых условиях при повышенной гербицидной нагрузке показала возможность создания форм, сочетающих высокую урожайность и устойчивость к гербицидам (69, 70). Известна попытка передать льну ген фос-фотрицин-^ацетилтрансферазы (pat), придающий устойчивость к неселективному гербициду глюфосинату. Однако полевые испытания таких растений-трансформантов не были успешными (71). Выполнялись работы по повышению устойчивости льна к Fusarium oxysporum и F. culmorum посредством введения гена р-1,3-глюканазы из картофеля. Полученные трансгенные растения оказались в 3 раза устойчивее к фузариозному увяданию, чем немодифицированные формы (72).
Один из побочных эффектов трансгенеза состоит в появлении так называемых ложных трансформантов (escapes) — растений, приспособившихся к существованию на селективной среде с антибиотиком или гербицидом, но не содержащих в геноме чужеродную ДНК. Условия in vitro
сами по себе могут рассматриваться как стресс, в результате которого усиливается частота и спектр генетической изменчивости (поли- и анеуплои-дия, точечные мутации, транспозиции мобильных элементов, соматический кроссинговер и др.). На основе сомаклональной изменчивости льна в культуре in vitro получены формы, устойчивые к экстремальным факторам среды (73), засолению (74), стрессу (75), гербициду хлорсульфурону (76), грибным заболеваниям (59).
Можно предположить, что ложные трансформанты, выжившие под влиянием многих стрессовых факторов, физиологически более пластичны и подвижны, расширяют спектр генетической изменчивости и будут полезны для создания форм с ценным сочетанием признаков. В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси впервые на основе ложных трансформантов созданы четыре популяции льна-долгунца. Выделены группы растений, достоверно превосходящих исходный сорт по числу пучков на срезе и числу элементарных волокон на срезе (по последнему признаку — на 12,2 %), что свидетельствует о хорошо развитой волокнистой ткани и, следовательно, высоких количественных и качественных характеристиках волокна. Полевые 2-летние испытания популяций льна-долгунца, созданных на основе ложных трансформантов, показали достоверное превышение ряда показателей (общая высота растения, техническая длина, число коробочек и семян) по сравнению с таковыми у исходных сортов (77).
Белковые маркеры. Эффективность селекции льна (несмотря на практические успехи традиционных методов гибридизации и отбора) сдерживается тем, что улучшение генотипов по большинству хозяйственно ценных признаков уже подошло к биологическим границам продуктивности. Поэтому для оценки генетически детерминированных особенностей сортообразцов, их сравнения и контроля этапов селекционного процесса (что сокращает его сроки) необходим переход на молекулярно-генетиче-ский уровень. С этой целью могут использоваться разные маркерные системы, в том числе ДНК- и белковые маркеры (78-81).
Идентификация и регистрация сортов и биотипов льна по полиморфизму запасных белков не нашли широкого применения. У этой культуры белки семян представлены двумя типами — 2S-альбуминами, или конлининами, которые кодируются двумя независимыми локусами Cnll и Cnl2 (82), и llS-глобулинами (83). Спектры запасных белков (и суммарных белков из семян) у изученных российских (84, 85) и зарубежных (86) сортов при разных методах экстракции и электрофореза различались незначительно, поэтому вопрос об их использования для задач генетики, филоге-нетики, систематики, селекции и семеноводства льна остается открытым.
Биохимическими маркерами также могут быть изоферменты. Изучение изоферментных спектров 6-фосфоглюконатдегидрагеназы и кислой фосфатазы у сортов льна-долгунца выявило по два, а аспартатамино-трасферазы — четыре типа энзимограмм, обусловленных отсутствием одной или нескольких изоформ (79). В то же время большинство образцов характеризовались однородностью, что не позволило использовать эти изоферменты для внутривидовой и сортовой дифференциации. Однако горизонтальный электрофорез показал высокое генетическое разнообразие по трем ферментативным системам (PGD — 6-phosphogluconate dehydrogenase, GPI — glucose phosphate isomerase и MDH — malate dehydrogenase) как между сортами разной селекционной направленности (долгунцы, масличные и ландрасы), так и внутри каждого образца (87).
ДНК-маркеры. С помощью ДНК-маркеров можно дифференцировать индивидуальные организмы и таксоны. Применение ДНК-маркеров, тесно сцепленных с тем или иным признаком (или маркер-ассоци-
ированная селекция — marker assisted breeding, MAB), намного повышает эффективность селекционных программ.
Следует отметить, что анализ структуры и функциональной активности генома у льна лимитируется недостаточной изученностью его карио-типа: мелкий размер хромосом затрудняет кариологические исследования, (начаты более полувека назад), определение хромосом и цитологические исследования мейотических процессов. В 1940-1970-х году были опубликованы данные о разном числе хромосом в кариотипе возделываемого вида L. usitatissimum L. — 2n = 30 и 2n = 32 (88-91). Относительно недавно (92) получено подтверждение, что число хромосом у L. usitatissimum — 2n = 30. На хромосомах льна после флуоресцентной гибридизации in situ DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) дифференциальное окрашивание было сходно с рисунком С-окрашивания хромосом. Анализ распределения C/DAPI-бэндов по длине хромосом показал, что самые крупные располагаются преимущественно в прицентромерных, а средние и небольшие — в теломер-ных и интеркалярных районах хромосом. В геноме льна обнаружены один-два основных локуса 26S-рДНК, колокализованные с локусами 5S-рДНК, а также от одного до трех отдельных локусов 5S-рДНК (92).
Геном льна состоит из ~ 35 % высоко повторяющихся нуклеотид-ных последовательностей, ~ 15 % умеренно повторяющихся и ~ 50 % низ-кокопийных (93). Первые цитогенетические исследования льна выявили два района ядрышкового организатора с тандемно повторяющимися генами рРНК длиной 8,6 т.п.н., кодирующими 45S-рРНК и спейсерную ДНК, а 45S-рРНК служит предшественником 25S-, 5,8S- и Ш-рРНК (94). Ло-кусы 5S-рРНК распределены равномерно по всем хромосомам льна как тандемные повторы длиной 350-370 п.н., состоящие из транскрипционных единиц (120 п.н.) и спейсерной ДНК (230 п.н.) (90). У льна на мультиген-ное семейство 5S-рРНК (~ 117000 копий на диплоидный геном) приходится около 3 % генома (95), тогда как у Arabidopsis — только 0,7 % (96).
По опубликованным ранее данным, размер генома льна варьировал от С = 538 млн п.н. до С = 685 млн п.н., хотя по анализу кинетики реас-социации составлял С = 350 млн п.н. (93, 97). По последним оценкам, размер генома сорта льна масличного CDC Bethune — ~ 373 млн п.н. (98). Этот геном был секвенирован методом WGS («whole genome shotgun» — «метод дробовика») (98). В результате секвенирования получили 116602 контига с суммарной длиной ~ 302 млн п.н. в составе 88 384 скаффолдов (промежуточные неполные структуры секвенируемой последовательности) размером ~ 318 млн п.н., что соответствует ~ 81 % генома льна. Оставшиеся ~ 70 млн п.н. составляют пробелы внутри и между скаффолдами. На сегодняшний день после исправления ошибок общая длина собранных скаффолдов--271 млн п.н. Предполагаемый размер хромосом льна колеблется от 15,1 до 32,8 млн п.н. (99).
В 2011 году (100) была построена первая генетическая карта генома льна, включавшая 24 группы сцепления со 113 маркерами, охватывающими ~ 833,8 cM. QTL-анализ обнаружил по два основных локуса количественных признаков для линолевой кислоты (LIO, QLio.crc-LG7, QLio.crc-LG16), линоленовой кислоты (LIN, QLin.crc-LG7, QLin.crc-LG16) и йодного числа (IOD, QIod.crc-LG7, QIod.crc-LG16) и один главный QTL для пальмитиновой кислоты (PAL, QPal.crc-LG9). Мутантный аллель fad3A, картированный на хромосомном сегменте, унаследованном от родителя SP2047, лежит в основе QTL 7-й группы сцепления и положительно ассоциирован с высоким содержанием линолевой кислоты, но отрицательно — с содержанием линоленовой кислоты и йодным числом. В том же году (101) представили физическую карту генома льна. Она состоит из 416 контигов, охваты-
вающих ~ 368 млн п.н. На известные фракции генома приходится 54,9 %, из которых 20,7 % — диспергированные повторы, представленные элементами LTR-copia (3,4 %), LTR-gypsy (1,8 %), LINEs и SINEs (0,4 %), неклассифицированными LTR-элементами, ДНК-транспозонами (0,4 %), рибо-сомной ДНК (13,8 %) и микросателлитами (0,2 %). Кодирующие области у льна занимают 26,8 % генома, 45,1 % — неизвестные последовательности.
Интеграция генетической и физической карты (102) показала, что гаплоидному числу хромосом L. usitatissimum соответствуют 15 групп сцепления. Суммарная длина консенсусной генетической карты — 1551 сМ. Всего 670 маркеров привязаны к 204 из 416 контигов физической карты, которые покрывают ~ 274 млн п.н., или 74 % генома льна (370 млн п.н.).
RAPD-анализ использовался для оценки генетического разнообразия внутри и между сортами льна и ландрасами (80), а также генетического разнообразия и географического распространения канадского льна, что помогает понять процесс доместикации культуры (103). Показано, что сорта льна-долгунца весьма сходны по генетическим маркерам и составляют гомогенную группу, в то время как лен масличный образует несколько групп вместе с девятью ландрасами. Также отмечено, что в Канаде селекция льна привела к большей потере генетического разнообразия, чем в США. Эти выводы касались большинства локусов в канадских селекционных программах. При анализе географически удаленных образцов оказалось, что вариабельность между формами из разных стран достигает 84,2 %, тогда как внутри одной страны составляет 15,8 %. Также выяснилось, что образцы из Восточной Азии и Европы обладали наибольшим генетическим разнообразием, а из Африки и Индии — были более генетически однородны (103, 104).
Эксперты, тестирующие сорта льна по DUS-критериям (distinctness, uniformity, stability), отмечают, что морфологическая вариабельность новых сортов значительно снизилась (104). Это указывает на их узкую генетическую основу. В этом исследовании проводился AFLP (amplified length fragment polymorphism) анализ большого числа образцов, чтобы получить информацию о меж- и внутригрупповом генетическом разнообразии льна-долгунца и льна масличного, а также о влиянии условий выращивания на генетическое разнообразие льна. Хотя анализ не позволил распределить сорта льна-долгунца по кластерам, было установлено, что популяция льна-долгунца представляет собой подгруппу в популяции льна масличного. Таким образом, подтверждается, что отделение льна-долгунца от масличного льна вызвано недавней селекцией по признакам качества волокна, и это, в свою очередь, согласуется с гипотезой о происхождения льна-долгунца от льна масличного (78, 105). Если исходить из представленной гипотезы, более старые сорта льна-долгунца должны иметь больше сходства с сортами масличного льна, чем современные сорта.
У льна в настоящее время описано 1306 SSR-маркеров, что выгодно отличает его от других основных сельскохозяйственных культур (106). Согласно публикациям разных авторов, из микросателлитов в растительном геноме преобладают тринуклеотидные повторы (107-111). Однако эти данные могут оказаться ошибочными, так как в большинстве исследований микросателлиты были получены из экспрессируемых последовательностей EST (expressed sequence tags), для которых характерны тринуклео-тидные повторы. У льна также наиболее распространены тринуклеотидные SSR, однако динуклеотидные SSR более полиморфны (102), что соответствует данным по некоторым другим сельскохозяйственным культурам.
Показано, что тринуклеодидные повторы AGC-GCA-CAG преобладают у 8 культур (таро, женьшень, мандарин, просо, имбирь, хурма, га-
зонная трава и щетинник итальянский) (112), AGG-GGA-GAG — также у 8 (китайская капуста, дагусса, редис и кунжут), динуклеотидные повторы AG-GA — у 9 культур (китайская капуста, дагусса, кукушкины слезки, перилла, амарант, кунжут, редис, хурма, абрикос), AC-CA — у 4 (кунжут, мандарин, имбирь, таро). У льна наиболее распространенными тринуклео-тидными и динуклеотидными мотивами были GAA-AAG-AGA и AT-TA, что свидетельствует об уникальном составе его генома (102).
Согласно данным анализа полиморфизма по EST-SSR и BES-SSR (BAC-end sequences—SSR) маркерам (102), у льна в EST-SSR тринуклеоти-ды встречались чаще (68,7 %), чем в BES-SSR (54,6 %), вероятно, из-за подавления нетримерных SSR в кодирующих областях, что может приводить к изменениям в рамках считывания. Степень полиморфизма положительно коррелировала с числом повторов на локус и общей длиной локуса. BES-SSR маркеры выявляли достоверно более высокий полиморфизм (58 %, PIC = 0,39) по сравнению с EST-SSR маркерами (42 %, PIC = 0,34). При этом полиморфизм сортов у льна (даже при 42 % по EST-SSR маркерам) выше, чем у пшеницы, ячменя, сои и хлопка (106, 108, 113-115). В то же время степень полиморфизма может существенно варьировать в зависимости от числа исследуемых генотипов и их генетического разнообразия (табл.).
Характеристика микросателлитных маркеров (simple sequence repeats — SSR) у
протестированных генотипов льна (Linum usitatissimum L.)
Источник SSR1 Число PIC2 (от-до) Авторство
генотипов полиморфных пар праймеров локусов
всего на пару праймеров аллелей на локус
Геном 8 10 - - 3,7 (2-8) 0,60 (0,25-1,0) I. Wiesner et al. (2001)
Геном 93 23 28 1,22 3,3 (2-10) 0,33 (0,02-0,73) C. Roose-Amsaleg et al. (2006)
ESTs 23 248 275 1,11 2,3 (2-7) 0,35 (0,08-0,82) S. Cloutier et al. (2009)
Геном 60 60 66 1,10 3,0 (2-8) 0,39 (0,06-0,87) B.J. Soto-Cerda et al. (2011)
Геном 8 35 37 1,06 3,5 (2-6) 0,60 (0,23-0,84) X. Deng et al. (2010)
ESTs 61 23 23 1,00 2,3 (2-4) 0,38 (0,08-0,55) B.J. Soto-Cerda et al. (2011)
Геном 8 38 38 1,00 3,4 (2-12) 0,43 (0,20-0,88) X. Deng et al. (2011)
Геном 27 9 - - - - S.M. Kale et al. (2011)
Геном 19 42 42 1,00 3,3 (2-8) 0,47 (0,10-0,86) C.L. Bickel et al. (2011)
ESTs 16 145 149 1,03 2,4 (2-6) 0,34 (0,12-0,70) S. Cloutier et al. (2012)
BESs 16 673 720 1,07 2,8 (2-9) 0,39 (0,12-0,85) S. Cloutier et al. (2012)
Всего 1306 1400 1,07
Примечание. 1 — геномная библиотека или опубликованные последовательности генома, экспрессиру-емые последовательности EST (expressed sequence tag) или BES (BAC-end sequencing); 2 — polymorphism information content (индекс информативности). Прочерки означают, что в статье нет соответствующих данных.
Интеграция молекулярных и традиционных методов селекции. В селекционных программах формирование фонда для отбора требует изучения генетической изменчивости — как имеющейся у современных и примитивных сортов, так и индуцированной за счет рекомбинаций и мутаций. Молекулярно-генетические методы необходимы для генетической идентификации линий и сортов льна, выявления меж- и внутривидовых генетических связей, возможных связей маркеров с количественными признаками и установления групп сцепления между маркерами. Использование кластерного анализа дает возможность группировать формы в соответствии с их генетической близостью, что позволяет оптимизировать подбор пар для гибридизации с целью сохранения максимального генетического разнообразия селекционного материала льна.
Интеграция молекулярных и традиционных методов селекции также важна при идентификации сортов (для защиты авторских прав селекционеров и селекционных учреждений, контроля чистоты сорта и его соответствия известному стандарту). В настоящее время возможность использовать молекулярные маркеры при испытании сортов по критериям ООС (отличимость, однородность, стабильность) в странах-участниках UPOV
(International Union for the Protection of New Varieties of Plants) остается предметом дискуссий по техническим (выбор методов молекулярного маркирования) и юридическим аспектам. Позиция UPOV обобщена в ряде документов, касающихся развития соответствующих методологических подходов. Рекомендуемые молекулярные маркеры должны быть сцеплены с традиционными признаками сортов и могут использоваться для определения болезнеустойчивости, генетических модификаций (например, гербицидо-устойчивости) и т.п. Наиболее целесообразно применение молекулярных маркеров у видов со слабыми межсортовыми различиями (лен, рапс и др.).
Методы идентификации по ДНК-маркерам обладают рядом преимуществ. Они в значительно большей степени позволяют выявить объективные различия между исследуемыми образцами и, следовательно, их разрешающая способность существенно выше. Молекулярные методы применимы на любых стадиях развития растения, начиная с семян, и незаменимы в спорных случаях, когда традиционные подходы не позволяют достоверно различить исследуемые образцы. Данные, полученные с помощью анализа ДНК, наряду с информацией о родословной и ключевых полигенных признаках агрономического значения, наиболее объективны для описания и регистрации сортов. Важно и то, что современные технологические разработки позволяют найти ДНК-маркеры для оценки соответствия новых сортов критериям ООС-теста. В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси на основе данных о полиморфизме разных микроса-теллитных локусов составлена панель из одиннадцати пар SSR-праймеров для микросателлитных локусов, позволяющая проводить генотипирование образцов льна, сложно различимых или неотличимых друг от друга при морфологическом анализе, и предложена система надежной молекулярно-генетической паспортизации сортов (116, 117). В результате микросател-литного анализа низко- и высоколиноленовых сортов выявлен микроса-теллитный аллель LU8207, который может быть использован в качестве SSR-маркера низколиноленовых форм льна масличного (43).
Таким образом, современный алгоритм селекционно-генетического улучшения льна сочетает традиционные и молекулярные методы и может быть сведен к следующим этапам: скрининг хозяйственно ценных признаков исходного материала в различных экологических условиях; молеку-лярно-генетический анализ выделившихся источников хозяйственно ценных признаков; гибридизация и отборы на основе математических моделей (QTL-анализ, кластерный анализ и пр.); оценка выделившихся линий по методикам DUS UPOV (distinctness, uniformity, stability, International Union for the Protection of New Varieties of Plants); регистрация нового сорта с генетическим паспортом в национальной или международной системе охраны селекционных достижений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Синская Е.Н. Классификация льна как исходного материала для селекции и его эволюция. В сб.: Сборник работ по биологии развития и физиологии льна. М., 1954: 5-45.
2. Сизов И.А. Лен. М.-Л., 1955.
3. Gill K.S. Linseed. Indian Council of Agricultural Research, New Dehli, 1987.
4. Кутузова С.Н. Генетика льна. В сб.: Генетика культурных растений (лен, картофель, морковь, зеленые культуры, гладиолус, яблоня, люцерна). СПб, 1998: 6-52.
5. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. Т. 1. Сорта растений (официальное издание). М., 2014.
6. Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. Режим доступа: http://fenix.fao.org/faostat/beta/en/#data/QC. Без даты.
7. Ре нард К.Г. Лен-долгунец. М.-Л, 1923.
8. Писарев В.Е. Основные моменты в селекции льна. В сб.: Теоретические основы селекции растений. М.-Л., 1937, 5: 503-544.
9. De H a a n H. Flax breeding and flax varieties in the Netherlands. Euphytica, 1952, 1: 212-218.
10. Fouilloux G. Breeding flax methods. In: Flax: Breeding and Utilisation /G. Marshall (ed.). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London, 1988: 14-25.
11. Salas G., Friedt W. Comparison of pedigree selection and single seed descent for oil yield in linseed (Linum usitatissimum L). Euphytica, 1995, 83: 25-32.
12. Павлова Л.Н. Этапы развития селекционной работы по льну-долгунцу: достижения и основные направления. В сб.: Научные достижения — льноводству. Тверь, 2010: 39-45.
13. Технические культуры /Под ред. Я.В. Губанова. М., 1986.
14. Kvavadze E., Bar-Yosef O., Belfer-Cohen A., Boaretto E., Jakeli N., Matskievich Z., Meshveliani T. 30,000 year-old wild flax fibers. Science, 2009, 325(5946): 1359 (doi: 10.1126/science.1175404).
15. Pavelek М. Status of the Czech national flax collection and management of the International Flax Data Base within the framework of the FAO/ESCORENA Flax and other Bast Plants Network. Flax Genetic resources in Europe, 2001: 25-31.
16. Рожмина Т.А., Жучен ко А.А. (мл.), Ущаповский И.В., Курчакова Л.Н., Баскаков В.А., Киселева Т.С. Национальная коллекция русского льна и основные направления использования генофонда культуры в селекционном процессе. Селекция, семеноводство, агротехника, экономика и первичная обработка льна-долгунца (науч. тр. ВНИИЛ, Торжок), 2002, 1(30): 72-82.
17. Diederichsen A., Richards K. Cultivated flax and the genus Linum L. In: The genus Linum. London—NY, 2003: 44.
18. Жучен ко А.А., Рожмина Т.А., Понажев В.П., Павлова Л.Н., Тихомирова В.Я., Сорокина О.Ю., Павлов Е.И., Поздняков Б.А., У с а н о в а З.И., Бр ач Н.Б. Эколого-генетические основы селекции льна-долгунца. Тверь, 2009.
19. Лен Беларуси /Под ред. И.А. Голуба. Минск, 2003.
20. У щ а п о в с ки й И.В. Биологические, технологические и организационные аспекты формирования конкурентоспособной льнопродукции. В сб: Состояние и перспективы развития льноводства в Сибири. Томск, 2007: 11-15.
21. Хамутовский П.Р., Хамутовская Е.М., Балашенко Д.В. Результаты селекции и характеристика новых сортов льна-долгунца РУП «Могилевская ОСХОС НАН Беларуси». В сб.: Льноводство: реалии и перспективы. Могилев, 2013: 40-43.
22. П а в л о в а Л.Н. Новые сорта льна-долгунца — важный ресурс получения высококачественной продукции. В сб.: Машинно-технологическая модернизация льняного агропромышленного комплекса на инновационной основе. Тверь, 2014: 29-29.
23. Ущаповский И.В., Лемеш В.А., Богданова М.В. Интеграция традиционных и молекулярных методов селекции на культуре льна. Мат. Межд. науч.-прак. конф. ФГБ-НУ ВНИИМЛ «Инновационные разработки для производства льна». Тверь, 2015: 42-45.
24. Логинов М.И., Кабанец В.М., Ситник В.П. Этапы развития и итоги селекции льна-долгунца в Украине. В сб.: Научные достижения — льноводству. Тверь, 2010: 57-63.
25. Кубрак С.В., Хоты лева Л.В. Использование трансгрессивной изменчивости для получения новых форм льна-долгунца с улучшенными показателями продуктивности и качества волокна. В сб.: Льноводство: реалии и перспективы. Могилев, 2013: 85-88.
26. Ущаповский И.В., Жученко А.А. (мл.). Доместикация и особенности рекомби-национной системы льна. В сб.: Роль льна в улучшении среды обитания и активном долголетии человека. Тверь, 2012: 19-26.
27. Жученко А.А., Рожмина Т.А. Мобилизация генетических ресурсов льна. М., 2000.
28. Брач Н.Б., Кутузова С.Н., Пороховинова Е.А. Источники хозяйственно-ценных признаков в коллекции льна ВИР. В сб.: Проблемы повышения технологического качества льна-долгунца. Торжок, 2005: 96-102.
29. Кутузова С.Н., Брач Н.Б., Пороховинова Е.А., Павлов А.В., Шаров И.Я. Проблема селекции льна-долгунца и исходный материал для их решения в коллекции ВИР. В сб.: Научные достижения — льноводству. Тверь, 2010: 28-35.
30. Кутузова С.Н., Брач Н.Б., Пороховинова Е.А., Шаров И.Я., Павлов А.В. Сравнительная характеристика сортов льна-долгунца, районированных с 1932 по 2000 гг. В сб: Проблемы повышения технологического качества льна-долгунца. Торжок, 2005: 40-48.
31. D ie d e ri c hs e n A., K u s t e rs P.M., K e s s l e r D., B a i na s Z., G u g e l R.K. Assembling a core collection from the flax world collection maintained by Plant Gene Resources of Canada. Genet. Resour. Crop Evol., 2013, 60(4): 1479-1485 (doi: 10.1007/s10722-012-9936-1).
32. Иванова Е.В., Маслинская М.Е., Андроник Е.Л. Стратегия изучения генофонда льна в Беларуси. В сб.: Льноводство: реалии и перспективы. Могилев, 2013: 47-51.
33. Soto-Cerda B.J., Duguid S.D., Booker H.M., Rowland G.G., Diederichsen A., Cloutier S. Association mapping of seed quality traits using the flax (Linum usitatissimum L.) core collection. Theoretical and Applied Genetics (TAG), 2014, 127(4): 881896 (doi: 10.1007/s00122-014-2264-4).
34. Л е м е ш В.А. Молекулярный анализ гетерогенности белорусских сортов и ландрас льна. Доклады Национальной академии наук Беларуси, 2007, 51(6): 78-81.
35. Лемеш В.А., Богданова М.В., Гузенко Е.В., Грушецкая З.Е., Саматад-зе Т.Е., Рачинская О.А., Муравенко О.В. Генетический полиморфизм сортов льна (Linum usitatissimum L.) в зависимости от периода селекции. Молекулярная и при-
кладная генетика, 2013,15: 75-86.
36. B a с e l i s K. Experimental mutagenesis in fiber flax breeding. Biologija, 2001, 1: 40-43.
37. Логинов М.И., Кандыба Н.Н., Логинов А.М. Экспериментальный мутагенез и его роль в создании сортов льна-долунца с высоким качеством волокна. В сб.: Проблемы повышения технологического качества льна-долгунца. Торжок, 2005: 116-122.
38. Ущаповский И.В., Доурлейн Й., Якобсен Э. Особенности генерирования генотипической изменчивости при химическом мутагенезе у льна. В сб.: Итоги и перспективы развития селекции, семеноводства, совершенствования технологий возделывания и первичной переработки льна-долгунца. Торжок, 2000: 58-60.
39. Ущаповский И.В. К вопросу о формировании фонда отбора в селекции льна. В сб.: Льноводство: реалии и перспективы. Могилев, 2013: 347-360.
40. Rowland G.G. An EMS-induced low-linolenic-acid mutant in McGregor flax (Linum usitatissimum L.). Can. J. Plant Sci., 1991, 71(2): 393-396.
41. Green A.G., Marshall D.R. Isolation of induced mutants in linseed (Linum usitatissimum) having reduced linolenic acid content. Euphytica, 1984, 33(2): 321-328 (doi: 10.1007/BF00021128).
42. Tonnet M.L., Green A.G. Characterization of the seed and leaf lipids of high and low linolenic acid flax genotypes. Arch. Biochem. Biophys., 1987, 252(2): 646-654 (doi: 10.1016/0003-9861(87)90070-1).
43. Лях В.А., Сорока А.И. Ботанические и цитогенетические особенности видов рода Linum L. и биотехнологические пути работы с ними. Запорожье, 2008.
44. Богданова М.В. Молекулярно-генетический полиморфизм сортов и ландрас льна посевного (Linum usitatissimum L.). Автореф. канд. дис. Минск, 2014.
45. Dietrich K. Uber die Kulturen von Embryonenausserhalb des Samens. Flora, 1924, 17: 379-417.
46. Laibach F. Das Taubwerden von Bastardsamen und die Kunstliche aufzucht von fruh absterbenden Bastardembryonen. Z. Bot., 1925, 17: 417-459.
47. Link G.K., Eggers V. Mode, site and time of initiation of hypocotyledonary bud primordial in Linum usitatissimum L. Bot. Gaz., 1946, 107(4): 441-454.
48. Ibrahim R.K. Media for growth of flax tissue culture. Can. J. Bot., 1971, 49(2): 295-298.
49. Liau S., Ibrahim R.K. Biochemical differentiation in flax tissue culture — phenolic compounds. Can. J. Bot., 1973, 51(4): 820-823.
50. Gamborg O.L., Shyluk J.P. Tissue culture, protoplasts and morphogenesis in flax. Bot. Gaz., 1976, 137(4): 301-306.
51. Pretova A., Williams E.G. Direct somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of flax (Linum usitatissimum L.). Plant Physiol., 1986, 126(2-3): 155-161 (doi: 10.1016/S0176-1617(86)80016-5).
52. Cunha A., Ferreira M.F. Somatic embryogenesis, organogenesis and callus growth kinetics of flax. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 1996, 47(1): 1-8 (doi: 10.1007/BF02318959).
53. Ling H.Q., Binding H. Improvement of plant regeneration from Linum protoplasts by the induction of somatic embryogenesis. J. Plant. Physiol., 1992, 139(4): 422-426 (doi: 10.1016/S0176-1617(11)80488-8).
54. Cunha A., Ferreira M.F. Differences in free sterols content and composition associated with somatic embryogenesis, shoot organogenesis and calli growth of flax. Plant Sci., 1997, 124(1): 97-105 (doi: 10.1016/S0168-9452(97)04587-1).
55. Janowicz J., Niemann J., Wojciechowski A. The effect of growth regulators on the regeneration ability of flax (Linum usitatissimum L.) hypocotyl explants in in vitro culture. BioTechnologia, 2012, 93(2): 135-138 (doi: 10.5114/bta.2012.46578).
56. Ru t k o w s k a - K r au s e I., Mankowska G., Lukaszewicz M., Szopa J. Regeneration of flax (Linum usitatissimum L.) plants from anther culture and somatic tissue with increased resistance to Fusarium oxysporum. Plant Cell Rep., 2003, 22(2): 110-116 (doi: 10.1007/s00299-003-0662-1).
57. Bonell M.L., Las sag a S.L. Genetic analysis of the response of linseed (Linum usitatissimum L.) somatic tissue to in vitro cultivation. Euphytica, 2002, 125(3): 367-372 (doi: 10.1023/A:1016013609068).
58. Sun H., Fu W. Induction of pollen plants in flax (Linum usitatissimum L.) and preliminary observations on performance of their progenies. Acta Genet. Sin., 1981, 8(4): 369-374.
59. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна. Тверь, 2000.
60. Nichterlein K., Umbach H., Friedt W. Investigation on androgenesis in breeding of linseed (Linum usitatissimum L.). Vortr. Pflanzenzuchtg, 1989, 15(1): 13-25.
61. Пролетова Н.В. К методике получения in vitro растений-регенерантов льна-долгунца, устойчивых к антракнозу. В сб.: Научные достижения — льноводству. Тверь, 2010: 136-144.
62. Пролетова Н.В., Лошакова Н.И., Поляков А.В. Получение растений-регенерантов льна-долгунца, устойчивых к фузариозному увяданию, методами in vitro (культура пыльников, клеточная селекция): Метод. реком. Торжок, 2008.
63. Ущаповский И.В., Виноградова Е.Г., Као Т.А., Нгуен Т.М.Х. Генотипи-ческая гетерогенность по устойчивости к стрессовым факторам в культуре гипокотильных сегментов льна (Linum usitatissimum L.). В сб.: Проблемы повышения технологического качества льна-долгунца. Торжок, 2005: 123-130.
64. В и н о г р а д о в а Е.Г. Возможность получения методами клеточной селекции форм
льна-долгунца, устойчивых к токсичным ионам алюминия. В сб.: Научные достижения — льноводству. Торжок, 2010: 147-150.
65. Basiran N., Armitage P., Scott R.J., Draper J. Genetic transformation of flax (Linum usitatissimum) by Agrobacterium tumefaciens: regeneration of transformed shoots via a callus phase. Plant Cell Rep., 1987, 6(5): 396-399 (doi: 10.1007/BF00269571).
66. Zhan X.C., Jones D.A., Kerr A. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Mol. Biol., 1988, 11(5): 551-559 (doi: 10.1007/BF00017455).
67. Jordan M.C., McHughen A. Glyphosate tolerant flax plants from Agrobacterium mediated gene transfer. Plant Cell Rep., 1988, 7(4): 281-284 (doi: 10.1007/BF00272543).
68. M c H u g h e n A. Agrobacterium mediated transfer of chlorsulfuron resistance to commercial flax cultivars. Plant Cell Rep., 1989, 8(8): 445-449 (doi: 10.1007/BF00269045).
69. McHughen A., Holm F. Herbicide resistant transgenic flax field test — agronomic performance in normal and sulfonylurea containing soils. Euphytica, 1991, 55(1): 49-56 (doi: 10.1007/BF00022559).
70. McSheffrey S.A., McHughen A., Devine M.D. Characterization of transgenic sulfonylurea-resistant flax (Linum usitatissimum). Theor. Appl. Genet., 1992, 84(3): 480-486 (doi: 10.1007/BF00229510).
71. McHughen A., Holm F. Development and preliminary field testing of a glufosinate-ammonium tolerant transgenic flax. Can. J. Plant Sci., 1995, 75(1): 117-120.
72. Wrobel-Kwiatkowska M., Lorenc- Kukui a K., Starzycki M., Oszmianski J., Kepczynska E., Szop a J. Expression of B-1,3-glucanase in flax causes increased resistance to fungi. Physiol. Mol. Plant Pathol., 2004, 65(5): 245-256 (doi: 10.1016/j.pmpp.2005.02.008).
73. Marshall G., Courduries P. Somaclonal variation in Linum usitatissimum L. Proc. European Regional Workshop on Flax «Flax as a fibre and oil bearing crop». Brno, Czechoslovakia, 1991: 143-154.
74. McHughen A., Swartz M. A tissue culture derived salttolerant line of flax (Linum usitatissimum). J. Plant Physiol., 1984, 117(2): 109-117 (doi: 10.1016/S0176-1617(84)80023-1).
75. O'Connor B.J., Robertson A.J., Gust a L.V. Differential stress tolerance and cross adaptation in a somaclonal variant of flax. J. Plant Physiol., 1991, 139(1): 32-36 (doi: 10.1016/S0176-1617(11)80160-4).
76. Jordan M.C., McHughen A. Selection of chlorsulfuron resistance in flax (Linum usitatissimum) cell cultures. J. Plant Physiol., 1987, 131(3-4): 333-338 (doi: 10.1016/S0176-1617(87)80172-4).
77. Гузенко Е.В., Лемеш В.А., Богданова М.В. Морфогенетический полиморфизм популяций льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), сформированных на основе ложных трансформантов. Молекулярная и прикладная генетика, 2012, 13: 7-18.
78. Рачинская О.А., Лемеш В.А., Муравенко О.В., Юркевич О.Ю., Гузенко Е.В., Большева Н.Л., Богданова М.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Малышев С.В., Шостак Н.Г., Хеллер К., Хотылева Л.В., Зеленин А.В. Полиморфизм генома льна посевного по молекулярно-цитогенетическим маркерам. Генетика, 2011, 47(1): 65-75.
79. Юренкова С.И., Хотылева Л.В. Использование изоферментных маркеров в оценке генетического разнообразия сортов льна-долгунца. В сб.: Итоги и перспективы развития селекции, семеноводства, совершенствования технологии возделывания и первичной переработки льна-долгунца. Торжок, 2000: 48-49.
80. Fu Y.B., Rowland G.G., Duguid S.D., Richards K.W. RAPD analysis of 54 North American flax cultivars. Crop Science, 2003, 43(4): 1510-1515 (doi: 10.2135/cropsci2003.1510).
81. Лемеш В.А., Богданова М.В., Хотылева Л.В. RAPD-анализ межвидовой генетической изменчивости и филогенетических связей видов льна (род Linum L.). Доклады НАН Беларуси, 2006, 50(2): 51-54.
82. Truksa M., MacKenzie S.L., Qiu X. Molecular analysis of flax 2S storage protein conlinin and seed specific activity of its promoter. Plant Physiol. Biochem., 2003, 41(2): 141147 (doi: 10.1016/S0981-9428(02)00022-0).
83. Venglat P., Xiang D., Qiu S., Stone S.L., Tibiche C., Cram D., Alting-Mees M., Nowak J., Cloutier S., Deyholos M., Bekkaoui F., Sharpe A., Wang E., Rowland G., Selvaraj G., D a 11 a R. Gene expression analysis of flax seed development. BMC Plant Biol., 2011, 11: 74 (doi: 10.1186/1471-2229-11-74).
84. Кутузова С.Н., Гаврилюк И.П., Эгги Э.Э. Перспективы использования белковых маркеров в уточнении систематики и эволюции рода Linum L. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1999, 156: 29-39.
85. Evtimova M., Vlahova M., Atanassov A. Flax improvement by biotechnology means. Journal of Natural Fibers, 2005, 2(2): .
86. Sammour R.H. Proteins of linseed (Linum usitatissimum L.), extraction and characterization by electrophoresis. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 1999, 40: 121-126.
87. M a n s b y E., D i a z O., Von Bothmer R. Preliminary study of genetic diversity in Swedish flax (Linum usitatissimum). Genet. Resour. Crop Evol., 2000, 47: 417-424 (doi: 10.1023/A: 1008721528588).
88. Ray C. Cytological studies on the flax genus (Linum). Am. J. Bot., 1944, 31: 241-248.
89. Lewis W.H. A hexaploid Linum (Lineceaceae) from eastern Ethiopia. Sida, 1964, 1: 383-384.
90. Harris B.D. Chromosome numbers and evolution in North American species of Linum. Am. J. Bot., 1968, 55(10): 1197-1204.
91. Chennaveeraiah M.S., Joshi K.K. Karyotypes in cultivated and wild species of Linum. Cytologia, 1983, 48: 833-841.
92. Муравенко О.В., Амосова А.В., Саматадзе Т.Е., Попов К.В., Зеленин А.В. Сравнительное исследование геномов двух видов льна по рисункам С-окраски хромосом. Генетика, 2001, 37(3): 332-335.
93. Cullis C.A. Mechanisms and control of rapid genomic changes in flax. Annals Bot., 2005, 95(1): 201-206 (doi: 10.1093/aob/mci013).
94. Goldsbrough P.B., Ellis T.H.N., Cullis C.A. Organization of the 5S RNA genes in flax. Nucl. Acids Res., 1981, 9(22): 5895-5904.
95. Schneeberger R.G., Creissen G.P., Cullis C.A. Chromosomal and molecular analysis of 5S RNA gene organization in the flax, Linum usitatissimum. Gene, 1989, 83(1): 7584 (doi: 10.1016/0378-1119(89)90405-8).
96. Pruitt R.E., Mayerowitz E.M. Characterization of the genome of Arabidopsis thaliana. J. Mol. Biol., 1986, 187(2): 169-183 (doi: 10.1016/0022-2836(86)90226-3).
97. Evans G.C. The Quantitative analysis of plant growth. Oxford, 1972.
98. Wang Z., Hobson N., Galindo L., Zhu S., Shi D., McDill J., Yang L., Hawkins S., Neutelings G., Datla R., Lambert G., Galbraith D.W., Grassa C.J., Geraldes A., Cronk Q.C., Cullis C., Dash P.K., Kumar P.A., Cloutier S., Sharpe A.G., Wong G.K., Wang J., Deyholos M.K. The genome of flax (Linum usitatissimum) assembled de novo from short shotgun sequence reads. The Plant Journal, 2012, 72(3): 461-473 (doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05093.x).
99. You F.M., Kumar S., Banik M., Cloutier S. Ordering draft genome sequence of flax (Linum usitatissimum). Plant and Animal Genome XXI Conference. San Diego, 2013. Режим доступа: https://pag.confex.com/pag/xxi/webprogram/Paper4988.html. Дата обращения: 5.09.2013.
100. Cloutier S., Ragupathy R., Niu Z., Duguid S. SSR-based linkage map offlax (Linum usitatissimum L.) and mapping of QTLs underlying fatty acid composition traits. Mol. Breed., 2011, 13(4): 437-451 (doi: 10.1007/s11032-010-9494-1).
101. Ragupathy R., Rathinavelu R., Cloutier S. Physical mapping and BAC-end sequence analysis provide initial insights into the flax (Linum usitatissimum L.) genome. BMC Genomics, 12: 217 (doi: 10.1186/1471-2164-12-217).
102. Cloutier S., Miranda E., Ward K., Radovanovic N., Reimer E., Walichnowski A., Datla R., Rowland G., Duguid S., Ragupathy R. Simple sequence repeat marker development from bacterial artificial chromosome end sequences and expressed sequence tags of flax (Linum usitatissimum L.). Theor. Appl. Genet., 2012, 13(4): 685694 (doi: 10.1007/s00122-012-1860-4).
103. Fu Y.B. Geographic patterns of RAPD variation in cultivated flax. Crop Sci., 2005, 45(3): 1084-1089 (doi: 10.2135/cropsci2004.0345).
104. Vromans J. Molecular genetic studies in flax (Linum usitatissimum L.). PhD thesis. Wageningen University, The Netherlands, 2006.
105. Zohary D., Hopf M. Domestication of plants in the Old World: the origin and spread of cultivated plants in West Asia, Europe and the Nile Valley. Oxford University Press, Oxford, 2000.
106. Varshney R.K., Glaszmann J.C., Leung H., Ribaut J.M. More genomic resources for less-studied crops. Trends. Biotechnol., 2010, 28(9): 452-460 (doi: 10.1016/j.tibtech.2010.06.007).
107. Dholakia B.B., Ammiraju J.S., Santra D.K., Singh H., Katti M.V., Lagu M.D., Tamhankar S.A., Rao V.S., Gupta V.S., Dhaliwal H.S., Ranjekar P.K. Molecular marker analysis of protein content using PCR-based markers in wheat. Biochem. Genet., 2001, 39(9-10): 325-338.
108. Thiel T., Michalek W., Varshney R., Graner A. Exploiting EST databases for the development and characterization of genederived SSR-markers in barley (Hordeum vulgare L.). Theor. Appl. Genet., 2003, 106(3): 411-422 (doi: 10.1007/s00122-002-1031-0).
109. Tian A.G., Wang J., Cui P., Han Y.J., Xu H., Cong L.J., Huang X.G., Wang X.L., Jiao Y.Z., Wang B.J., Wang Y.J., Zhang J.S., Chen S.Y. Characterization of soybean genomic features by analysis of its expressed sequence tags. Theor. Appl. Genet., 2004, 108(5): 903-913 (doi: 10.1007/s00122-003-1499-2).
110. Yu J., Bernardo R. Changes in genetic variance during advanced cycle breeding in maize. Crop Sci., 2004, 44(2): 405-410 (doi: 10.2135/cropsci2004.4050).
111. Gong Y.M., Xu S.C., Mao W.H., Hu Q.Z., Zhang G.W., Ding J., Li Y.D. Developing new SSR markers from ESTs of pea (Pisum sativum L.). J. Zhejiang Univ. Sci. B., 2010, 11(9): 702-707 (doi: 10.1631/jzus.B1000004).
112. Yu J., Dixit А., Ma K.H., Chung J.W., Park Y.J. A study on relative abundance, composition and length variation of microsatellites in 18 underutilized crop species. Genet. Resour. Crop. Evol., 2006, 56(2): 237-246 (doi: 10.1007/s10722-008-9359-1).
113. Eujayl I., Sorrells M., Baum M., Wolters P., Powell W. Assessment of genotypic variation among cultivated durum wheat based on EST-SSRs and genomic SSRs. Euphytica, 2001, 119(1-2): 39-43 (doi: 10.1023/A:1017537720475).
114. Han Z.G., Guo W.Z., Song X.L., Zhang T.Z. Genetic mapping of EST-derived
microsatellites from the diploid Gossypium arboretum in allotetraploid cotton. Mol. Genet. Ge-Genomics, 2004, 272(3): 308-327 (doi: 10.1007/s00438-004-1059-8).
115. Hisano H., Sato S., Isobe S., Sasamoto S., Wada T., Matsuno A., F u j i s h i r o T., Y a m a d a M., N a k a y a m a S., N a k a m u r a Y., W a t a n a b e S., Harada K., Tabata S. Characterization of the soybean genome using EST-derived microsatellite markers. DNA Res., 2007, 14(6): 271-281 (doi: 10.1093/dnares/dsm025).
116. Лемеш В.А., Богданова М.В., Семашко Т.В., Бейня В.А., Кильчевский А.В., Хотылева Л.В. Полиморфизм микросателлитных локусовльна (Linum usitatissimum L.) как основа генетической паспортизации сортов. Доклады НАН Беларуси, 2013, 57(2): 74-78.
117. Лемеш В.А., Богданова М.В., Хотылева Л.В. Полиморфизм микросателлитных локусов сортов льна масличного. Доклады НАН Беларуси, 2012, 56(4): 77-82.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ механизации льноводства, Поступила в редакцию 170041 Россия, г. Тверь, Комсомольский пр., 17/56, 27 ноября 2015 года
e-mail: vniptiml@mail.ru;
2ГНУ Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, 220072 Республика Беларусь, г. Минск, ул. Академическая, 27, e-mail: V.Lemesh@igc.bas-net.by, mw.bogdanova@gmail.com, E.Guzenko@igc.bas-net.by
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2016, V. 51, № 5, pp. 602-616
PARTICULARITY OF BREEDING AND PERSPECTIVES ON THE USE OF MOLECULAR GENETIC METHODS IN FLAX (Linum usitatissimum L.) GENETICS AND BREEDING RESEARCH (review)
I.V. Ushchapovskii1, V.V. Lemesh2, M.V. Bogdanova2, E.V. Guzenko2
1All-Russian Research Institute for Mechanization of Flax Cultivation, Federal Agency of Scientific Organizations, 17/56, Komsomol'skii prosp., Tver, 170041 Russia, e-mail vniptiml@mail.ru;
2Institute of Genetics and Cytology of NAS of Belarus, 27, vul. Akademicheskaya, Minsk, 220072 Republic of
Belarus, e-mail V.Lemesh@igc.bas-net.by, mw.bogdanova@gmail.com, E.Guzenko@igc.bas-net.by
Received November 27, 2015 doi: 10.15389/agrobiology.2016.5.602eng
Abstract
Breeding and genetic researches of flax (Linum usitatissimum L.) started more than 100 years ago, but their relevance does not decrease. More than 200 cultivars of this culture are offered in the international seed market for oil and fiber production with yearly amount of the harvested area about one million hectares and 0.3 million hectares, respectively. Different agro-climatic conditions in the countries, which flax has been cultivated, and the progress in technologies of processing and new ways of application of products made of the fibers and other parts of the flax plant determine the necessity to accelerate breeding process. Now duration of breeding work for creating a new variety is up to 10-15 years. The dominating method for flax breeding is intraspecific hybridization with the subsequent selections. Basic part of breeding work is ecological trials and intensive use in the crossing the best new cultivars, old popular varieties («kriazhee»), local samples and breeding forms (S.N. Kutuzova et al., 2010; A. Diedrechsen et al., 2013). Prebreeding work focuses on the overcoming of limits of traditional hybridization methods by using some peculiarities of combinative variability (L.N. Pavlova, 2010). Recombination inducing can be resulted by using the stress conditions for a flax plant (hybrid) growing (A.A. Zhuchenko Jr. et al., 2009). Use physical (y-radiation) and chemical (nitrosomethylurea, ethyleneimine, dimethylsulphate) mutagens considerably raises an output of mutant forms of linseed and flaxseed which possess economically valuable traits (M.I. Loginov et al., 2005; I.V. Uschapovsky, 2013). The article examines the examples of the use of cell and tissue culture techniques that extend somaclonal variability and allow to produce flax lines with desirable properties, including disease-resistance (fusariosis, anthracnose) (V.A. Lyakh et al., 2008; N.V. Proletova et al., 2010). The review describes DNA marking technology which allows us to group genetic material of flax according to its genetic proximity and to optimize matching the genotypes to crossbreeding in view of saving the maximum genetic diversity (Y.B. Fu et al., 2003; V.A. Lemesh et al., 2006). SSR-analysis is examined as the perspective direction for genetic identification of flax lines and cultivars (V.A. Lemesh et al., 2013), identifications of inter- and intraspecific genetic linkages (J. Vromans, 2006), possible linkages between molecular markers and economically important traits (V.A. Lemesh et al., 2012) and establishments of linkages groups between marker pairs (S. Cloutier, 2012). The directions of possible integration of traditional breeding methods and methods of molecular biology for creation of new flax cultivars with the set of the parameters of economically important traits are considered.
Keywords: fiber flax, linseed, breeding, hybridization, selection, mutagenesis, tissue culture, genetic variability, primers, markers, SSR, PCR.
