CC BY
9УДК 633.52:577.21:632.165
В.А. Лемеш1, Е.В. Гузенко1, А.И. Емец2, О.А. Баер2, Г.Я. Баер2, Е.Н. Шиша., Я.Б. Блюм2, Н.А.Картель1
создание генетически модифицированных
растений льна (LINUM USITATISSIMUM l.) методом агробактериальной трансформации
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины Украина, 04123, г. Киев, ул.Осиповского, 2а
Введение
Генетическая инженерия растений является составной частью современной сельскохозяйственной биотехнологии. Создание принципиально новых методов практического использования клеток и тканей растений привело к бурному развитию этого направления. Разработаны эффективные клеточные технологии, позволяющие осуществлять быстрое размножение ценных сортов и линий растений, оздоравливать растительный материал, повышать эффективность отдаленной гибридизации, отбирать на клеточном уровне ценные формы и регенерировать их из клеток и тканей растения. Генетическая инженерия позволяет значительно расширить возможности существующих методов селекции. Использование генетической трансформации растений в практических целях приводит к получению генотипов с новыми или улучшенными агрономическими характеристиками.
Лен - ценная техническая культура двойного назначения, выращиваемая для получения волокна и масла. Целлюлозные микрофибриллы, составляющие 70% льняного волокна, являются основным механическим элементом клеточной стенки и их ориентация зависит от ориентации кортикальных микротрубочек клеток [1]. Микротрубочки вовлечены в регуляцию клеточного деления, транспорта везикул и органелл, морфогенеза и подвижности клеток [2]. Это высококонсервативные филаментные структуры, в состав которых входит белок ту-булин. Трансгенные растения льна с интегрированным в их геном чужеродным геном, со-
держащим тубулин, могут служить удобным объектом для изучения роли микротрубочек в процессах формирования и отложения целлюлозных фибрилл в клеточной стенке, а также особенностей организации кортикальных микротрубочек в клетках сортов льна-долгунца, характеризующихся различной устойчивостью к полеганию.
Использованная в данной работе для тран-формации растений льна генетическая конструкция представляет собой плазмиду, которая содержит химерный ген белка ци-тоскелета тубулин, слитый с репортерным геном GFP (green fluorescent protein - зеленый флюоресцентный белок или белок зеленой флюоресценции). GFP был обнаружен в 1962 г. у люминесцирующей медузы Aequorea victoria [3], клонирован в 1992 г. Prasher и соавт. [4], и уже через несколько лет началось активное использование этого гена как репортерного в работах с самыми разными про- и эукариотическими организмами. В настоящее время ген GFP применяется в сотнях работ во всем мире, и число их стремительно нарастает. Столь быстрый рост вызван особыми свойствами белка GFP, а именно его способностью флюоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при облучении длинноволновым УФ. Эта флюоресценция обусловлена непосредственно белком, для ее проявления не требуется субстратов или кофакторов. Благодаря этому свойству ген GFP является очень перспективным репортерным геном, позволяющим проводить разнообраз-
ные прижизненные (недеструктивные) исследования с трансгенными организмами.
Несмотря на то, что введение льна в культуру in vitro и первые опыты по созданию трансгенных растений льна масличного состоялись около 25 лет назад, до сих пор получение
трансгенных линий льна-долгунца остается трудновыполнимой задачей. Целью данного исследования была разработка протоколов создания генетически модифицированных растений льна-долгунца и льна масличного методом агробактериальной трансформации.
Материалы и методы
В качестве исходного материала использовали 17 генотипов льна: 11 сортов льна-долгунца районированных в Беларуси, 5 сортов, переданных в госсортоиспытание, 1 сорт льна масличного (Канада) (Табл. 1).
Оценка морфогенетического потенциала сортов льна. Стерилизованные семена проращивали на агаре (8 г/л) при 230 C и 16-ти часовом фотопериоде. Эксплантами служили ги-покотили 7-суточных проростков длиной 3 - 5 мм. Для индукции морфогенеза использовали среду MS 5519, дополненную фитогормонами: 1 мг/л BAP (6-Benzyl-aminopurine) и 0,05 мг/л NAA (a-Naphthalene-acetic acid), приготовленную на питьевой воде, pH 5,7-5,8. Гипокотили инкубировали при температуре 230 C и 16-ти часовом фотопериоде. Морфогенетический потенциал культуры оценивали как отношение количества каллусов с регенерационными структурами к общему количеству эксплантов, образовавших каллус. Эффективность регенерации определяли через 5 недель после начала культивирования как отношение количества побегов (более 5 мм длиной) к общему количеству эксплантов. Для оценки результатов использовали не менее 30 эксплантов каждого генотипа с трехкратным повторением. Регенерированные побеги длиной не менее 2 см укореняли на безгормональной среде MS0404, содержащей половинный набор макросолей и витаминов, а также агар (7 г/л) и сахарозу (10 г/л), pH 5,7-5,8.
Агробактериальная трансформация. В экспериментах использовали Agrobacterium tumefaciens [LBA 4404 (pBI121)], Т-ДНК которой содержала химерный ген GFP-TUA6 под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV). В качестве селективного маркерного гена конструкция содержала nptII ген, который обеспечивает устойчивость к канамицину (Рис. 2) [5]. Конструкция была любезно предоставлена
Dr. T.Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology, Japan). Ночную культуру агро-бактерии наращивали в 20 мл жидкой среды LB, дополненной канамицином в концентрации 50мг/л на качалке (180 об/мин) в течение 24 часов при 280С в темноте. Затем агробак-териальную суспензию разбавляли в 3 раза жидкой безгормональной средой MS и инкубировали в тех же условиях в течение 3 -4 часов. Полученную суспензию применяли для инфицирования.
В экспериментах по трансформации использовали гипокотили 5-ти дневных проростков, выращенных в асептических условиях (температура 240С, освещенность 4000 - 5000 люкс при 16/8 (свет/темнота) фотопериоде). За 2 суток до инфицирования гипокотильные экспланты длиной 4-6 мм помещали для инициации каллуса на поверхность агаризованной среды MS5519, дополненную фитогормонами 1 мг/л BAP (6-Benzyl-aminopurine) и 0,05 мг/л NAA (a-Naphthalene-acetic acid) pH 5,8. Затем экспланты переносили в подготовленную бактериальную суспензию и выдерживали 1 час, периодически перемешивая. Подсушенные на фильтровальной бумаге гипокотили переносили в те же чашки Петри, в которых проходило прекультивирование. Сокультиви-рование проводили в темноте в течение суток в условиях термальной комнаты. После этого экспланты отмывали от бактерий жидкой MS средой, подсушивали и переносили на агари-зированную среду MS5519, дополненную фи-тогормонами 1 мг/л BAP и 0,05 мг/л NAA, а также антибиотиками канамицином (100 мг/л) и цефотаксимом (500 мг/л). После трех недель культивирования на селективной среде экс-планты переносили на среду для морфогенеза, дополненную фитогормонами 1 мг/л BAP и 0,05 мг/л NAA. Сформировавшиеся зеленые побеги размещали на среде для ризогенеза (безгормональная среда MS0404, содержащая
половинный набор макро- и микросолей). Растения с хорошо развитыми функциональными корнями пересаживали в стерилизованный грунт в условия влажной камеры.
Молекулярно-генетический анализ. Для выделения тотальной ДНК из предположительно трансгенных растений использовали комплект реагентов «ДНК-сорб-С» (Россия). Для идентификации присутствия химерного гена GFP-TUA6 использовали праймеры к последовательности 35S-промотора СаМУ, а именно 5,-GCTCCTACAAAШCCATCA-3, и 5,-GATAGШGGATШШCGTCA-3\ ампли-
фицирующие фрагмент величиной 194 пн. Реакцию проводили на амплификаторе BioRad с применением «горячего старта» в следующих условиях: 930С - пауза, шаг 1 - 2 мин при 930 С; шаг 2 - 42 цикла, 10 сек при 930 С, 25 сек при 610 С и 25 сек при 720 С; шаг 3 - 1 мин при 720 С. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1,8% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и документировали с помощью системы Bio-Rad GelDoc2000. Размеры амплифицированных фрагментов определяли, используя в качестве маркера GeneRulerTM100 bp Plus DNA ladder (Fermentas).
Таблица 1
Перечень использованных генотипов льна в качестве исходного материала
Генотипы Группа спелости Наименование
Районированные сорта льна-долгунца Раннеспелые Вита
Весна
Лето
Старт
Среднеспелые Дашковский
Нива
Сюрприз
Позднеспелые Василек
Форт
Могилевский
Прамень
Сорта льна-долгунца в Госсортоиспытании Раннеспелые Левит-1
Лида
Среднеспелые Ива
Хваля
Позднеспелые Белита
Сорт льна масличного Gold Flax
LB
RB
35S sm-GFP AG TUA6
Рис. 2. Схема конструкции pBI121 с химерным геном GFP-TUA6 [5]
Результаты и обсуждение
Известно, что эффективность трансформации чужеродными генами в значительной степени зависит от выбранного генотипа, который определяет частоту образования мор-фогенного каллуса, эффективность регенерации проростков, выживаемость растительной ткани после проведения трансформации и воздействия селективных сред. Следовательно, до проведения генетической трансформации необходимо оценить морфогенетический потенциал и регенерационную способность генотипов.
Для получения культуры клеток и тканей анализируемых генотипов нами в качестве эксплантов были выбраны гипокотили 7-ми суточных проростков как наиболее подхо-
На отобранных отзывчивых образцах нами проведена серия экспериментов по трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens методом кокультивации. Основа системы генетической трансформации состоит в эффективной доставке векторных конструкций в клетки-мишени, компетентные к регенерации растений. Однако проникновение чужеродной ДНК приводит к повреждениям в клетке-хозяине, и степень выживаемости растительной ткани при трансформации и селективном воздействии среды снижается. Наши исследования показали, что эффективность инокуляции гипокотильных сегментов и последующая регенерация также зависит от генотипа [12, 13]. Через 2-3 недели после проведения трансформации при селекции на среде с канамицином (100 мг/л) по краям среза
дящий материал для успешной инициации каллуса, органогенеза и эмбриогенеза у L. usitatissimum [6, 7, 8, 9]. Проведенная оценка морфогенетического потенциала и реге-нерационной способности 16 сортов льна-долгунца разных групп спелости и 1 сорта льна масличного выявила существенную зависимость от генотипа. Показано, что ре-генерационная способность у сортов более 45% считается высокой и такие сорта предпочтительней использовать в программах с применением методов биотехнологии и генетической инженерии [10, 11]. Установленный нами уровень регенерации позволил отобрать наиболее отзывчивые генотипы для проведения трансформации (Табл. 2).
экспланта и на его поверхности наблюдалось образование каллуса, который имел ярко-зеленую окраску. Для наблюдения динамики транзиент-ной и стабильной экспрессии в клетках в используемую конструкцию введен репортерный ген gfp, позволяющий производить in vivo оценку экспрессии трансгена. Проведенный анализ новообразований с помощью конфокального микроскопа подтвердил инкорпорацию GFP-меченного тубулина в клетки каллуса.
Несмотря на легкость получения каллусных тканей, получить побеги льна после проведения трансформации не всегда удается. В таблице 3 представлены результаты эффективности морфогенеза и регенерации отзывчивых сортов после проведения агробактериальной трансформации.
Таблица 2
Эффективность регенерации отзывчивых сортов
№ Образец Морфогенетический потенциал (%) Регенерационная способность (%)
1 Старт 47,5 64,8
2 Нива 88,0 54,3
3 Дашковский 97,0 23,3
4 Василек 53,9 70,6
5 Могилевский 87,0 43,5
6 Прамень 95,0 46,2
7 Gold Flax 77 196,2
8 Левит-1 43,0 70,5
9 Белита 58,0 137,3
Темным цветом выделены наиболее отзывчивые сорта.
Таблица 3
Оценка эффективности морфогенеза и регенерации после проведения агробактериальной трансформации
№ Образец Число эксплантов Число выживших эксплантов Число эксплантов, образовавших каллус Число побегов
1 Дашковский 54 54 13 -
2 Нива 158 158 95 6
3 Могилевский 327 207 186 6
4 Прамень 218 151 120 3
5 Василек 274 229 162 65
6 Старт 273 221 203 21
7 Левит-1 191 191 109 8
8 Белита 163 80 55 6
Темным цветом выделены наиболее отзывчивые сорта.
Наибольшее число побегов первичных 3 трансформантов в данных условиях культи- I вирования регенерировали сорта Василек и с Старт, трансформированные каллусы сорта с Прамень регенерировали наименьшее число ( побегов. В данных условиях культивирования у сорта Дашковский побеги регенериро- с вать не удалось. с Проведен молекулярно-генетический ана- н лиз с помощью ПЦР 31 первичного транс- ( форманта на наличие последовательности в
35S-промотора СаMV в их геноме. При амплификации с использованием специфических праймеров были получены фрагменты, соответствующие позитивному контролю (плазмида рВ1121) в 30 случаях.
На рисунках 1, 2 представлены электро-фореграммы разделения продуктов амплификации геномной ДНК предположительно трансгенных растений. Интеграция гена GFP-TUA6 показана во всех проанализированных образцах.
Рис.1. Электрофореграмма амплификации геномной ДНК льна сортообразца Белита. 1 - 9 пробы ДНК льна сортообразца Белита, прошедшего агробактериальную трансформацию, 10 - положительный контроль ДНК плазмиды рВ1121, 11- контрольное растение сорта Белита, 12 - отрицательный контроль ПЦР, М - маркер
молекулярной массы 100 Ьр
Рис.2. Электрофореграмма амплификации геномной ДНК льна сорта Gold Flax. 1 - контрольное растение, 2 -8 пробы ДНК сорта льна масличного Gold Flax, прошедшего агробактериальную трансформацию, 9 - отрицательный контроль выделения ДНК, 10 - положительный контроль ДНК плазмиды pBI121, 11- отрицательный
контроль ПЦР, M - маркер молекулярной массы 100 bp
Известные на сегодняшний день протоколы ведения культуры in vitro позволяют достаточно легко получать каллусную ткань и регенерировать побеги у льна. Однако, корнеобразо-вание (ризогенез) и последующая адаптация к почвенным условиям до сих пор остаются трудно выполнимыми этапами из-за низкой адаптационной способности как регенерантов данной культуры, так и трансформантов [15, 16]. При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах происходит постепенное накопление веществ токсического действия (фенольные соединения), что приводит к формированию растений с измененной морфологией [17]. Возможно накопление этилена, вызывающего эпинастию и хлороз [17, 18]. Вместе с тем, наблюдаются такие нежелательные эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и, как следствие, уменьшение способности растений к укоренению.
Нами была предпринята попытка усовершенствовать методику получения корней у
регенерантов и первичных трансформантов льна путем создания определенных условий культивирования, стимулирующих ризогенез. Регенерировавшие побеги длиной более 2 см переносили на среду для ризогенеза (MS с половинным набором макро- и микросолей), при этом побеги льна не заглублялись в питательную среду, а культивировались на границе - питательная среда/воздух. Использование данного метода позволило сократить сроки образования корней до 10 - 20 дней, повысить эффективность ризогенеза, а также облегчить адаптацию побегов к условиям ex vitro.
Таким образом, с помощью метода агро-бактериальной генетической трансформации нами получены полноценные растения сорта льна-долгунца Белита и сорта льна масличного Gold Flax, несущие генетическую конструкцию GFP-TUA6. Встраивание химерного гена подтверждено с помощью ПЦР В условиях ex vitro адаптацию прошли 2 растения. Получены семена трансгенной линии сорта Белита Т
Работа финансировалась БРФФИ (грант Б07К-081).
Список использованных источников
1. Baskin, T.I. Anisotropic expansion of the растений: интеграция функций клетки / plant cell wall / T.I Baskin // Annu. Rev. Cell Я.Б. Блюм // Биотехнология / Под ред. Ю.Ю. Dev. Biol. - 2005. - Vol.21. - P. 203-222. Глебы, - М: ВИНИТИ АН СССР. - 1988. -
2. Блюм, Я.Б. Организация цитоскелета Т. 9: Итоги науки и техники. - С. 166-277. протопластов и соматические гибриды 3. Action of cyanide on Cypridina luciferin /
F.H. Johnson [et al.] //J. Cell. Comp. Physiol. -1962. - Vol. 60 - P. 85-104.
4. Green fluorescent protein as a marker for gene expression / M. Chalfie [et al.] // Science. -1994. - Vol.263/5148. - P. 802-805.
5. Visualisation of microtubules in living cells of transgenic Arabidopsis thaliana L. / K. Ueda [et al.] // Protoplasma. - 1999. - Vol.206. -P. 201-206.
6. Improved flax regeneration from hypocotyls using thidiazuron as a cytokinin source / B. Bretagne [et al.] // Plant Cell Rep. - 1994. -Vol.14. - P. 120-124.
7. Shoots and embryo-like structures regenerated from cultured flax (Linum usitatissimum L.) hypocotyl segments/ B. Dedicova [et al.] // J. Plant. Physiol. - 2000. - Vol.157. - P. 327-334.
8. Improved flax regeneration from hypocotyls using thidiazuron as a cytokinin source / B. Bretague [et al.] // Plant Cell Rep. -1994. - Vol.14. - P. 120-124.
9. Somatic embryogenesis in flax / D. Tejavathi [et al.] // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 2000. -Vol. 63. - P. 155-159.
10. Шут, М.В. Культура in vitro и регенерация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), районированных в Беларуси / М.В. Шут // Весщ НАНБ - 2005.- Т.2, № 5. - С. 110-112.
11. Введение в культуру in vitro и регенерационная способность сортов льна-долгунца с различной устойчивостью к полеганию / О.А. Баер [и др.] // Физиол. биохим. культ. растений. - 2004. - Т. 36, № 1. - С. 48-54.
12. Гузенко, Е.В. Трансформация различных генотипов льна-долгунца с помощью Agrobac-terium tumefaciens: предварительные результаты /Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, А.И. Емец,Я.Б.Блюм, Н.А. Картель // Факторы экспериментальной эволюции организмов: материалы IV междунар. науч. конф., Алушта, 22-26 сентября 2008 г./, К.: Логос; редкол.: И.Р.Бариляк [и др.]. - Алушта, 2008. - С. 268 - 273.
13. Гузенко, Е.В. Получение трансгенных растений льна-долгунца, несущих химерный ген GFP-TUA6 / Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, Г.Я. Баер, О.А. Баер, А.И. Емец, Я.Б. Блюм, Н.А. артель. // Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты: материалы междунар. науч. конф., Минск, 3-6 декабря 2008 г. / Минск. гос. ун-т; редкол.: Н.П.Максимова [и др.]. - Минск, 2008. - С. 62-64.
14. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна / А.В. Поляков. - Тверь. 2000. - 251 с.
15. Flax / A. Pretova [et al.] // Biotechnology in Agriculture and Forestry. - 2007.- Vol.6. -P. 129-140.
16. Кузьмина, Н. Культуры растительных клеток / Н. Кузьмина // Основы биотехнологии [Электронный ресурс]. - 2005. - Режим доступа: http://www.biotechnolog.ru/. - Дата доступа: 17.04.2009.
17. Бабикова, А.В. Растение как объект биотехно-логии/ А.В. Бабикова, Т.Ю.Горпенченко, Ю.Н. Журавлев // Сб. науч. тр. Комаровские чтения. - Владивосток, 2007. - Вып. LV -С. 184-211.
Дата поступления статьи 30 марта 2009 г.
