CC BY
4УДК 633.521:581.4:604.6
В.А. Лемеш, Е.В. Гузенко, Е.В. железнякова
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ЛИНИЙ «ЛОжНЫХ ТРАНСФОРМАНТОВ» ЛЬНА-ДОЛГУНЦА (LINUM USITATISSIMUM L.)
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Стрессовое воздействие является механизмом, запускающим процессы, вызывающие резкий рост числа мутаций и других геномных перестроек. В клетках растений, культивируемых in vitro, происходят генные мутации, частота которых достаточно велика и может быть использована для повышения генетического разнообразия культивируемых растений. Проведенный молекулярно-генетический анализ с помощью RAPD-, ISSR-, SSR-, IRAP-, REMAP-маркеров позволил зафиксировать изменения в геноме потомства растений «ложных трансформантов» льна-долгунца и выявить отличия их генетической структуры от исходных форм.
Ключевые слова: лен-долгунец, «ложные трансформанты», сомаклональная изменчивость, молекулярные маркеры.
Введение
Условия внешней среды могут вызывать весьма существенные генотипические изменения, имеющие в определенной степени направленный характер и передающиеся по наследству. Особенность проявления стресса заключается в том, что растение, будучи лишенным пространственной подвижности, необходимой для поиска лучшего места обитания, компенсирует это повышенной геномной и физиологической «подвижностью», «пластичностью», позволяющей гибко приспосабливаться к стрессовым факторам различной природы [1].
Лен относится к растениям, обладающим «пластичным» геномом. Существуют экспериментальные данные, указывающие на сложность системы генетического контроля у льна, в частности условия окружающей среды (лимитирующие факторы) оказывают значительное влияние на аллельную структуру генов, контролирующих количественные признаки. Показано, что при выращивании одного поколения растений льна в разных контролируемых стрессовых условиях (несбалансированность минеральных удобрений №Р:К, специфический температурный режим и др.) появляются стабильные линии — генотро-фы, отличающиеся одна от другой и от исходной линии не только по ряду морфологических и биохимических признаков, но и по общему количеству ядерной ДНК, по числу генов, кодирующих 25S, 18S и 5S рибосомные РНК [2-6].
Существенное влияние на геномную изменчивость оказывают стрессовые условия культивирования in vitro. Феномен сомакло-нальной изменчивости растений представляет собой резкое повышение наследственной вариабельности культивируемых клеток и тканей, выявляемой в потомстве растений-регенерантов. Результаты генетического анализа сомаклональных вариантов однозначно доказывают мутационную природу возникающих in vitro изменений. На основе сома-клональной изменчивости получены линии льна, устойчивые к экстремальным факторам среды [7-10], гербициду хлорсульфурону [11], грибным заболеваниям [12], алюмоустойчи-вые формы [13].
Последствия воздействия генетической трансформации любого вида также могут рассматриваться как сложный, многоуровневый биотический стресс. Трансформируемое растение подвергается нескольким видам стрессового воздействия: поранение, контакт с патогенным микроорганизмом (при агро-бактериальной трансформации), длительное культивирование in vitro, собственно транс-генез, т.е. инсерция Т-ДНК в геном растения-реципиента.
Случайное и ненаправленное встраивание чужеродной ДНК сопровождается каскадом изменений в геноме трансформируемых растительных эксплантов. По последним данным,
встраивание любых фрагментов Т-ДНК, даже если нарушена ее структура, приводит к изменениям в геноме растения-хозяина [14].
В ответ на любой вид стресса у растения происходит активация окислительных ферментов, что может стать причиной целого спектра изменений в ДНК [15]. При анализе первичных трансформантов льна на устойчивость к глифосату H. Jordan и A. McHughen впервые обнаружили растения, приспособившиеся к существованию на селективной среде, но не содержащие в своем геноме чужеродной ДНК [16]. Такие растения были названы "escapes" или «ложными трансформантами». Можно предположить, что «ложные трансформанты», выжившие под влиянием многих стрессовых факторов, обладают повышенной физиологической «подвижностью» и «пластичностью», расширяют спектр генетической изменчивости и могут быть полезны для создания форм с ценным сочетанием признаков.
Цель данной работы состояла в проведении молекулярно-генетического анализа с помощью различных маркерных систем сома-клональных линий льна-долгунца («ложных трансформантов»), которые были получены как побочный эффект агробактериальной и биобаллистической трансформации растений двух сортов льна-долгунца Белита и Василек.
Материалы и методы
В качестве материала для исследований использованы четыре линии «ложных трансформантов» (EsB-1, EsV-1, EsV-2, EsV-3), полученные ранее в ходе экспериментов по генетической трансформации сортов льна-долгунца белорусской селекции Белита и Василек [17].
Выделение ДНК проводили как из индивидуальных растений, так и из общей выборки растений одной формы с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) согласно инструкции производителя.
Реакционная смесь для амплификации с IRAP-праймерами объемом 25 мкл содержала 1х ПЦР-буфер, по 0,5 пмоль каждого прай-мера, 0,25 мМ dNTP mix, 2 мМ MgCl2, 1 ед. Taq-полимеразы и 20 нг матричной ДНК. Для проведения IRAP-анализа использовались 6 праймеров [18, 19]. ПЦР проводили на ам-плификаторе BioRad. Программа для ампли-
фикации: 1 цикл - 95 °С 2 мин, 2-40 цикл - 30 с при 94 °С, 30 с при Tm - 51-59 °С (температура отжига зависела от используемого прайме-ра) и 1 мин 30 с при 72 °С, 41 цикл - финальная элонгация при 72 °С в течение 7 мин.
Для RAPD-анализа использовали олигону-клеотидные праймеры серии UBC (University of British Columbia): 73, 101, 127, 153, 180, 239, 243, 244, 248, 292, 336, 337, 348, 365, 396, 417, 458, 499, 542, 569, 574, 586, 601, 731, 790. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 20 нг геномной ДНК, 0,2 мкМ праймера, 200 мкМ каждого dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2,5 мМ МgCl2 и 1,5 ед. Taq-полимеразы в инкубационном буфере. ПЦР проводили в следующих условиях: цикл 1 - 5 мин при 95 °С; циклы 2 - 35 (40), 1 (20 с) мин при 95 °С, 1 (20 с) мин при 30-36 °С и 2 (1 мин 20 с) мин при 72 °С; цикл 36 - 7 мин при 72 °С.
Реакционная смесь для ISSR-анализа объемом 25 мкл содержала 20 нг матричной ДНК, 0,2 мкМ праймера, 0,25 мМ dNTP mix, 4 мМ MgCl2 1 ед. Taq-полимеразы. ПЦР проводили в следующих условиях: 1 цикл - 3 мин при 94 °С; циклы 2-35, 60 с при 94 °С, 30 с при 51-56 С, 30 с при 72 °С, затем следовал финальный шаг - 3 мин при 72 °С. Для проведения данного анализа использовались 15 прай-меров [18, 20].
Полученные продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле с добавлением этидиум бромида, документировали с помощью системы Bio-Rad GelDoc 2000. Размеры амплифицированных фрагментов определяли по маркеру молекулярной массы 100 bp (Thermo Scientific) или 1 kb DNA ladder (BRL).
Результаты и обсуждение
Изучение сомаклональной изменчивости может представлять интерес как в фундаментальных исследованиях в качестве модели эволюции и дивергенции генов в популяции, так и в практической селекции как доступный источник генетического разнообразия. С этой целью используют комплексный подход, включающий различные методы изучения и анализа.
При морфологическом анализе растений-регенерантов можно обнаружить лишь те изменения, которые имеют фенотипическое проявление. Анализ генетических ресурсов
растений с использованием молекулярных маркеров позволяет выявлять скрытую изменчивость и тем самым целенаправленно подходить к более точной дифференциации и идентификации коллекционных образцов, в том числе и выявлению ценных генотипов.
На сегодняшний день одним из наиболее доступных и быстрых способов обнаружить вариабельность, а затем выяснить природу сомаклональной изменчивости является применение молекулярных методов, основанных на полимеразной цепной реакции и создание с их помощью маркеров ДНК, отличающих сомаклоны от исходного генотипа. Генетическая природа сомаклональных изменений может быть успешно установлена с помощью различных маркерных систем анализа ДНК.
RAPD-анализ, ISSR-анализ достаточно часто используются для исследований сомакло-нальной изменчивости [21-25].
Sala et al. использовали RAMP вместе с RAPD, AFLP и SSR для анализа трансгенных растений Orisa sativa L., Populus, Saccharum officinarum L., полученных посредством культуры клеток и трансгенного Arabidopsis thaliana L., полученного с помощью методики «макания цветка». Авторы обнаружили полиморфизм во всех исследуемых популяциях, причем вариации спектров амплификации наблюдались как у регенерантов, отличающихся по морфологическим признакам от исходного растения, так и у регенерантов, внешне идентичных исходному генотипу. В результате авторы пришли к выводу, что причиной полиморфизма среди трансгенных растений может быть как сомаклональная изменчивость, так и реакция на введение чужеродных генов [21].
На примере выращиваемых в культуре in vitro в течение двух лет каллусов сахарного тростника было показано, что RAPD-спектры таких регенерантов значительно более полиморфны, чем спектры регенерантов, полученных из молодых эмбриональных культур [23]. Для каллусной ткани солодки голой, длительно культивируемой в условиях in vitro (10 лет), RAPD-метод показал изменения в тотальной ДНК, а ПДРФ-анализ обнаружил полиморфизм в профилях митохондриальной ДНК [24]. Аналогичный метод был успешно использован для выявления полиморфизма сомаклонов персика, регенерированных из эмбриональной
культуры [25]. Для исследования географического распространения и полиморфизма канадского льна [27], а также для оценки уровня генетического разнообразия сортов льна и ландрас [26] был применен RAPD-анализ.
Включенные в наше исследование линии растений «ложных трансформантов» льна-долгунца, имеющие фенотипические различия по общей высоте растения, технической длине и др., отличались по RAPD-спектрам между собой и от родительских сортов. Три RAPD-праймера (UBC 542, UBC 574, UBC 731) из 25 включенных в исследование зафиксировали полиморфизм (рис. 1), который проявился и в возникновении новых неродительских RAPD-фрагментов, и в потере родительских фрагментов ДНК. Всего с использованием этих трех праймеров было ам-плифицировано около 145 локусов, из них 76 оказались полиморфными, что составило 52,4%. Размер амплифицируемых фрагментов - от 200 до 2000 п.н. Наибольшая степень полиморфизма, по данным RAPD-анализа, обнаружена у линий EsB-1, EsV-3.
В работах по исследованию регенерантов из каллусной культуры риса (Oryza sativa var. indica) RAPD-анализ применялся для маркирования 8-ми сомаклональных семей растений, имеющих фенотипические различия, такие как повышенная засухоустойчивость, измененная биомасса, длина стебля и др., а также 4-х сомаклональных семей, не отличающихся по фенотипическим признакам от родительской формы. Показано, что все анализируемые растения значительно отличались по своим спектрам ДНК как между собой, так и от родительских растений: 28 из 45 амплифицированных RAPD-фрагментов у сома-клонов были полиморфными, включая потерю родительских фрагментов ДНК и возникновение новых, неродительских RAPD-фрагментов [28].
Аналогичные исследования были проведены на сомаклональных вариантах гороха (Pisum sativum). RAPD-анализ исходного сорта и его стабильных сомаклональных регенерантов выявил полиморфизм ДНК как между сомакло-нами, так и между сомаклонами и исходным сортом гороха. Степень различий между сортами была сравнима со степенью межсортовой дивергенции. При этом выявлен специфический фрагмент ДНК, характерный только для спектров регенерантов и отсутствующий в RAPD-спектре исходного сорта [29].
Vk Bk B1 V1 V2 V3 M
Рис. 1. RAPD профили амплификации ДНК исходных сортов Белита (В(к)), Василек (V(k)) и линий растений
«ложных трансформантов» с праймером иВС 542
ISSR-метод, по мнению некоторых авторов, обладает большей воспроизводимостью по сравнению с ЯЛРБ [30]. С помощью ЯЛРБ-и ISSR-анализа были обнаружены изменения ДНК у сомаклонов гороха [31].
В нашей работе было использовано 15 ISSR-праймеров, три из них (ОВС 811, ЦВС 835, иВС 809) выявили полиморфизм ДНК как между линиями растений «ложных трансформантов», так и отличие от родительских сортов. Полиморфизм ДНК, как и в случае использования ЯЛРО-праймеров, проявился в возникновении новых, неродительских фрагментов и потере родительских фрагментов ДНК (рис. 2). Всего
Vk Bk B1 V1 V2 V3 M
-
—— ) .—
Рис. 2. ISSR-профили амплификации ДНК исходных сортов Белита (В(к)), Василек (У(к)) и линий растений «ложных трансформантов» с праймером иВС 835
амплифицировано 130 локусов, 34 из которых оказались полиморфными, что составило 26%. Размер амплифицируемых фрагментов - от 250 до 2500 п.н.
Наибольшая степень полиморфизма по данным ISSR-анализа обнаружена у линии EsV-1.
Метод микросателлитного анализа широко применяется для анализа полиморфизма близкородственных генотипов. Для выявления возможных изменений в геноме растений «ложных трансформантов» проведен SSR-анализ внутрилинейного и межлинейного ДНК-полиморфизма. Молекулярно-генетический анализ с помощью 10 информативных прай-меров [32, 33] не обнаружил различий между индивидуальными растениями внутри линий «ложных трансформантов», что подтвердило генетическую однородность данных форм. При сравнении микросателлитных профилей амплификации линий «ложных трансформантов» и контрольных сортов установлен полиморфизм по шести локусам Lu2, Lu13, Lu17, Lu21, Lu23, Lu28, при этом обнаружены отличия аллельного состава как между линиями, так и между линиями и контрольными сортами [34]. Подавляющая доля мутаций в микросателлитных локусах возникает за счет специфической ошибки репликации ДНК в районе микросателлита - проскальзывания (англ. slippage), что приводит к появлению аллеля нового размера. В то же время часть микро-сателлитных мутаций может изменять количество повторов как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения (на два и более повторов). Мутационные изменения, затрагивающие размеры микросателлитных кластеров и число микросателлитных звеньев, изменяют такие важные молекулярно-биологические и биохимические характеристики как нуклео-тидный состав, GC-содержание локусов, энергию Гиббса образования ДНК/ДНК-дуплекса, соотношение молекулярных масс 5'-3' и 3'-5' последовательностей. Полиморфизм микро-сателлитной ДНК установлен у образцов популяции EsV-2 и EsB-1 по локусу Lu23, у образцов популяции V-3 - по локусам Lu13, Lu23 [17].
IRAP - метод амплификации геномной ДНК между близкорасположенными последовательностями ретротранспозонов. Для генотипирования этих последовательностей
используют специально сконструированные праймеры PawS. Первоначально с помощью данных праймеров выявляли умеренные повторы ДНК ржи - семейство R173. Позднее было установлено, что данное семейство умеренно повторяющихся последовательностей имеется и в других видах растений - у картофеля, риса, пшеницы, а продукт ПЦР-амплификации геномной ДНК является стабильным генетическим IRAP-маркером. Полиморфизм в данном случае обусловлен либо мутацией в участке связывания прай-мера, либо уникальным биологическим процессом - ретротранспозицией, в результате встраивания ретротранспозона в новый участок геномной ДНК без потери первоначального участка [3 5-41 ].
Полиморфизм линий «ложных трансформантов» льна-долгунца установлен с помощью пяти IRAP-праймеров из семи, взятых в исследование. Всего было амплифициро-вано 238 локусов, из них 58 оказались полиморфными, что составило 24,4%. Полиморфизм, выявленный с помощью праймеров 1833, 1899, 1854 и 1845, составил 30, 30, 24 и 37 локусов, 1826, 1846 и IRAP - 43, 44 и 30 соответственно. Размер амплифицируемых фрагментов не превышал 2000 п.н. Максимальный уровень вариабельности показан для праймера 1826. Обнаружены отличия как между родительской формой и линиями, так и межлинейный полиморфизм. Линия EsB-1 отличалась от исходного сорта Белита по семи полиморфным локусам, у линии EsV-1 в отличие от исходного сорта Василек было выявлено 11 полиморфных фрагментов, у линии EsV-2 - 7 полиморфных фрагментов, у линии EsV-3 - 10 полиморфных фрагментов по сравнению с исходным сортом.
Метод REMAP аналогичен IRAP-методу, но вместе с праймерами к ретротранспо-зонам используются микросателлитные праймеры - двух-, трех- или четырехбазо-вые, например, (NN)n, (NNN)n или (NNNN) n [42, 43]. REMAP-анализ линий «ложных трансформантов» выявил меньшее количество полиморфизмов по сравнению с IRAP-анализом. Из восьми использованных в исследовании праймеров только 4 установили различия. Линия EsB-1 отличалась от кон-
трольного исходного сорта Белита по амплификации с праймерами ГОАР+иВС807, ЖАР+иВС808, ЖАР+иВС811. Выявлено 4 полиморфных локуса. Линия EsV-1 отличалась от исходного сорта Василек по амплификации с праймерами ГОАР+иВС807, ГОАР+иВС809. Выявлено 2 новых фрагмента по сравнению с ПЦР-продуктом исходного сорта. Линии EsV-2, EsV-3 не отличались от исходного сорта Василек по продуктам амплификации с использованными КЕМАР-праймерами. Наибольшая степень полиморфизма по данным КЕМАР-анализа обнаружена у линии EsВ-1.
Vk Bk B1 V1 V2 V3 M
^-- — — — — —
Рис. 3. ШАР-профили амплификации ДНК исходных сортов Белита (В(к)), Василек ^(к)) и линий растений «ложных трансформантов» с праймером 1846
Рис. 4. КЕМАР-профили амплификации ДНК исходных сортов Белита (В(к)), Василек ^(к)) и линий растений «ложных трансформантов» с ИЕМАР-праймерами ШАР и иВС 811
Заключение
Стрессовое воздействие является механизмом, запускающим процессы, вызывающие резкий рост числа мутаций и других геномных перестроек. Сохранение клетками генетической стабильности может рассматриваться лишь как исключение. В клетках растений, культивируемых in vitro, происходят генные мутации, частота которых достаточно велика и может быть использована для повышения генетического разнообразия культивируемых растений. Проведенный молекулярно-генетический анализ с помощью RAPD-, ISSR-, SSR-, IRAP-, REMAP-маркеров позволил зафиксировать изменения в геноме потомства растений «ложных трансформантов» льна-долгунца и выявить отличия их генетической структуры от исходных форм. Наибольший полиморфизм выявлен у линии EsB-1, созданной на основе растения, прошедшего процедуру агробактериальной генетической трансформации. Можно предположить, что такие этапы данной методики, как длительное культивирование в условиях in vitro и контакт с патогенным микроорганизмом, приводят к усилению геномной изменчивости.
Изучение полиморфизма ДНК с использованием нового типа молекулярно-генетических маркеров, основанных на изучении фрагментов ДНК, фланкированных участком фланга ретротранспозона и его инвертированным повтором, представляет интерес в плане геноти-пирования растений. Исходя из полученных данных, IRAP-анализ наиболее эффективен для выявления сомаклональной изменчивости у растений «ложных транформантов» льна-долгунца.
Таким образом, геном реагирует на повреждающие (стрессовые) воздействия включением геномных же механизмов, приводящих к реконструкции генома клетки. Значительная часть возникших в результате этого изменений может иметь адаптивное значение, поэтому растения «ложные трансформанты», выжившие под влиянием многих стрессовых факторов, по-видимому, обладают повышенной физиологической «подвижностью» и «пластичностью», расширяют спектр генетической изменчивости и могут быть полезны для создания форм с ценным сочетанием признаков.
Список использованных источников
1. Walbot, V. The plasticity of the plant genome - is it a requirement for success? / V. Walbot, C. Cullis // Plant Mol. Biol. Rep. -1983. - Vol. 1. - P. 3-11.
2. Associated nuclear changes in the induction of flax / G.M. Evans [et al.] // Nature. - 1966. -Vol. 212. - P. 697-699.
3. Cullis, C.A. DNA sequence organization in the flax genome / C.A. Cullis // Biochimica et Biophysica Acta. - 1981. - Vol. 652, N 1. - P. 1-15.
4. RAPD polymorphism detected among the flax genotrophs / C.A. Cullis [et al.] // Plant Mol. Biol. - 1999. - Vol. 41, N 6. - P. 795-800.
5. Durrant, A. An unstable gene in flax /
A. Durrant, D.B. Nicholas // Heridity. - 1970. -Vol. 25, N 4. - P. 513-527.
6. Organization of the 5S RNA genes in flax / P.B. Goldsbrough [et al.] // Nucl. Acids Res. -1981. - Vol. 9, N 22. - P. 5895-5904.
7. Генотипическая гетерогенность по устойчивости к стрессовым факторам в культуре гипокотильных сегментов льна (Linum usitatissimum L.) / И.В. Ущаповский [и др.] // Проблемы повышения технологического качества льна-долгунца: Мат. междунар. научно-практич. конф. Торжок, 2-3 ноября 2004г. / ВНИИЛ. - Торжок, 2005. - С. 123-130.
8. Somaclonal variation in Linum usitatissimum L. / G. Marshall [et al.] // Flax as a fibre and oil bearing crop: Proceedings European Regional Workshop on Flax, Brno, Czechoslovakia, 18-20 June, 1991. - Brno, 1991. P. 143-154.
9. A tissue culture derived salttolerant line of flax (Linum usitatissimum) / A. McHughen [et al.] // J. Plant Physiol. - 1984. - Vol. 117, № 2. - P. 109-117.
10. Differential stress tolerance and cross adaptation in a somaclonal variant of flax /
B.J. O'Connor [et al.] // J. Plant Physiol. -1991. - Vol. 139, № 1. - P. 32-36.
11. Selection of chlorsulfuronresistance in flax (Linum usitatissimum) cell cultures / M.C. Jordan [et al.] // J. Plant Physiol. - 1987. -Vol. 133. - P. 333-338.
12. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна / А.В. Поляков // Тверь. - 2000. - 180 с.
13. Виноградова, Е.Г. Возможность получения методами клеточной селекции форм льна-долгунца, устойчивых к токсичным
ионам алюминия / Е.Г. Виноградова // Научные достижения - льноводству: Мат. научно-практич. конф., посвящ. 80-летию ВНИИ льна. / ВНИИЛ. - Торжок, 2010. - С. 147-150.
14. Т-ДНК-индуцированные мутации у трансгенных растений / Е.В. Дейнеко [и др.] // Генетика. - 2007. - Т. 43, № 1, - С. 5-17.
15. Concepts in plant stress physiology. Application to plant tissue cultures / T. Gaspar [et al.] // J. Plant Growth Regulation. - 2002. -Vol. 37. - P. 263-285.
16. Transformed callus does not necessarily regenerate transformed shoots / M. Jordan [et al.] // Plant Cell Rep. - 1988b. - Vol. 7, N 4. -P. 285-287.
17. Генетическая трансформация льна / В.А Лемеш [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - 2014. -Т. 18. - С. 20-30.
18. Variability of Linum usitatissimum L. based on molecular markers / J. Ziarovska [et al.] // ARPN Journal of agricultural and biological science. - 2012. - Vol. 7, № 1. - P. 50-58.
19. Retrotransposon-based molecular markers for analysis of genetic diversity within the genus Linum / N.V. Melnicova [et al.] // BioMed Research International. - Vol. 2014. - 14 p.
20. Relatedness of Indian Flax Genotypes (Linum usitatissimum L.): An Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) Primer Assay / Ashwini V. Rajwade [et al.] // Mol Biotechnol. - 2010. -Vol. 45. - P. 161-170.
21. Somaclonal variation in transgenic plants / F. Sala [et al.] // Acta Hortic. - 2000. -Vol. 530. - P. 411-419.
22. RFLP analysis of Zea mays callus cultures and their regenerated plants / P.T.H. Brown, E. Gobel, H. Lorz // Theor. Appl. Genet. -Vol. 81. - P. 227-232.
23. The development of sequence-tagged sites (STSs) in Lolium perenne L.: the application of primer sets derived from other genera. / C. Taylor [et al.] // TAG. - 2001. - Vol. 103. -P. 648-658.
24. Чибиряев, С.В. Влияние длительного культивирования in vitro на морфофизио-логические характеристики и генетическую стабильность линий каллусной ткани солодки голой : автореф. дис. ... канд. биол. наук : 03.00.12 / С.В. Чибиряев; Изд-во Баш. гос. ун-та. - Уфа, 2002. - 19 с.
25. RAPD analysis of somaclonal variants derived from embryo callus cultures of peach / G. Hashmi [et al.] // Plant Cell Reports. - 1997. -Vol. 16. - P. 624-627.
26. Analysis of 54 North American Flax Cultivars / Y.B. Fu [et al.] // Crop Science. -2003. - Vol. 43, N 4. - Р. 1510-1515.
27. Geographic patterns of RAPD variation in cultivated flax / Y.B. Fu // Crop Science. -2005. - Vol. 45, N 3. - Р. 1084-1089.
28. RAPD polymorphisms among variant and phenotypically normal rice (Oryza sativa var. indica) somaclonal progenies. / I.D. Godwin [et al.] // Plant Cell Reports. - 1997. - Vol. 16. -P. 320-324.
29. RAPD-анализ сомаклональной и межсортовой изменчивости гороха. / З.Г. Кокаева [и др.] // ДАН. - 1997. - Т. 355, № 1. - С. 134-136.
30. Определение генетического полиморфизма и филогененических связей у представителей рода Lycopersion (Tourn) Mill методом маркирования межмикросателитных последовательностей (ISSR) / Е.З. Кочиева [и др.] // Генетика. - 2002. - Т. 38, № 8. -С. 1133-1142.
31. Кузнецова, О.И. Молекулярно-генети-ческий анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха : автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.15 / О.И. Кузнецова; МГУ им. М.В. Ломоносова - М., 2005. - 19 с.
32. Polymorphic microsatellite loci in Linum usitatissimum / C. Roose-Amsaleg [et al.] // Molecular Ecology Notes. - 2006. - Vol. 6. -P. 796-799.
33. Межсортовой полиморфизм геномов льна (Linum usitatissimum L.) по молекулярно-цитогенетическим маркерам / О.А. Рачинская [и др.] // Генетика. - 2011. - Т. 47, № 1. - С. 1-11.
34. Гузенко, Е.В. Морфо-генетический полиморфизм популяций льна-долгунца (Li-num usitatissimum L.), сформированных на основе ложных трансформантов / Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, М.В. Богданова // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. -2012. - Т. 13. - С. 1-14.
35. Боронникова, С.В. Использование IRAP-метода для анализа генетической изменчивости популяций ресурсных и редких видов растений. / С.В. Боронникова, Р.Н. Календарь // Генетика. - 2010. - Т. 46. - № 1. - С. 44-50.
36. Боронникова, С.В. Генетическая паспортизация популяций редких видов растений рода Adonis c использованием ISSR- и IRAP-маркеров / Боронникова С.В. // Известия ТСХА. - 2009. - № 1. - С. 83-89.
37. Rogowsky, P.M. Polymerase chain reaction based mapping of rye involving repeated DNA sequences / P.M. Rogowsky, K.W. Shepherd, P. Lan-gridge // Genome. - 1992. - Vol. 35. - P. 621-626.
38. Хавкин, Э.Е. ДНК генотипирование растений Brassica и Solanum / Э.Е. Хавкин // 3 Моск. Межд. Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития. - 2007. - С. 304.
39. Kumar, A. Plant retrotransposons / A. Kumar, J. Bennetzen // Annual Rev. Genetics. - 1999. - Vol. 33. - P. 479-532.
40. Евгеньев, М.Б. Мобильные элементы и эволюция генома / М.Б. Евгеньев // Молекулярная биология. - 2007. - Т. 41. - № 2. -С. 234-245.
41. Guidet, F. Cloning and characterization of a new rye-specific repeated sequence / F. Guidet, P. Rogowsky, C. Taylor // Genome. -1991. -Vol. 34. - P. 81-87.
42. IRAP and REMAP: Two new retrotrans-poson-based DNA fingerprinting techniques / R. Kalendar [et al.] // Theoretical and Applied Genetics. - 1999. - Vol. 98. - Р. 704-711.
43. Kalendar, R. IRAP and REMAP for ret-rotransposon-based genotyping and fingerprinting / R. Kalendar, A.H. Schulman // Nature Protocols. - 2006. - Vol. 1, N 5. - Р. 2478-2484.
V.A. Lemesh, E.V. Guzenko, E.V. Zheleznyakova
GENETIC POLYMORPHISM OF FLAX (LINUM USITATISSIMUM L.)
"ESCAPES" LINES
Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus Minsk BY-220072, Republic of Belarus
Stress exposure is the mechanism that initiates the processes leading to a sharp increase in the number of mutations and other genomic rearrangements. Gene mutations occur in the plant cells cultivated in vitro, their frequency is quite high and can be used to increase the genetic diversity of cultivated plants. The molecular genetic analysis carried out by RAPD-, ISSR-, SSR-, IRAP-, REMAP-markers allowed to identify changes in the genome of the offspring plants of "escapes" of fiber flax, and differences in their genetic structure of the original forms.
Key words: flax, escapes, somaclonal variation, molecular markers.
Дата поступления статьи 13 сентября 2016 г.
