CC BY
4Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, М.В. Богданова
МОРФО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ПОПУЛЯЦИЙ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА (LINUM USITATISSIMUM L.), СФОРМИРОВАННЫХ НА ОСНОВЕ ЛОжНЫХ ТРАНСФОРМАНТОВ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Клетки в культуре in vitro отличаются по морфологии, биохимическим свойствам, физиологическому и генетическому состоянию. Разнообразие (вариабельность) среди клеточных линий или растений-регенерантов называют сомаклональной вариабельностью. Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены. Однако можно четко выделить зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде всего, от гетерогенности соматических клеток исходного экспланта, генетической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования in vitro, а также от генотипа и вида экспланта.
Исследования сомаклональной изменчивости льна в культуре in vitro немногочисленны. Rutkowska-Krause et al. установили, что длительность периода культивирования значительно увеличивает плоидность образующихся растений-регенерантов льна [1]. Естественный соматический мутагенез может быть усилен при культивировании организма в стрессовых условиях (повышенная или пониженная температура, засоление и др.). Есть сведения о получении форм, устойчивых к экстремальным факторам среды [2], засолению [3], стрессу [4], гербициду хлорсуль-фурону [5], а также появление альбиносных мутантов [6] в результате культивирования тканей льна in vitro.
Рост и развитие соматических клеток в культуре in vitro сами по себе могут рассматриваться как стресс (увеличение раневой поверхности, изменение гормонального баланса и др.), в результате которого усиливается частота и спектр генетической изменчивости (поли- и анеуплоидия, точковые мутации, передвижение мобильных элементов, соматический кроссинговер и др.).
А.В. Поляковым [7] проводилась оценка по-томств растений-регенерантов, полученных на основе сортов льна-долгунца Торжокский 4, Дашковский 2, Славный 82 и Белинка по основным хозяйственно ценным признакам. В результате исследования были выделены два растения-регенеранта сорта Торжокский 4, которые по числу коробочек на 20-180% и по числу семян с растения на 28,8-92,4% превосходили исходный сорт, и один регенерант сорта Белинка, превосходящий исходный сорт по содержанию волокна на 11-19,5%.
Любой вид генетической трансформации, как и культивирование в условиях in vitro, может являться причиной резкого всплеска изменчивости в культуре клеток и тканей. Случайное и ненаправленное встраивание чужеродной ДНК сопровождается каскадом изменений в геноме трансформируемых растительных эксплантов. Последствия воздействия генетической трансформации любого вида могут рассматриваться как сложный, многоуровневый биотический стресс. Особенность проявления стресса заключается в том, что растение, будучи лишенным пространственной подвижности, необходимой для поиска лучшего места обитания, компенсирует это повышенной геномной и физиологической «подвижностью», «пластичностью», позволяющей гибко приспосабливаться к стрессовым факторам различной природы [8]. Трансформируемое растение подвергается нескольким видам стрессового воздействия: 1) поранение; 2) контакт с патогенным микроорганизмом (при агробак-териальной трансформации); 3) культивирование in vitro; 4) собственно трансгенез, т.е. инсерция Т-ДНК в хозяйский геном. В ответ на любой вид стресса у растения происходит активация окислительных ферментов,
что может стать причиной целого спектра изменений в ДНК: от точечных мутаций до таких крупных изменений как аберрации и полиплоидия [9].
Одним из побочных эффектов трансгенеза является появление так называемых ложных трансформантов (в англоязычной литературе - «escapes»), растений, приспособившихся
к существованию на селективной среде с антибиотиком или гербицидом, но не содержащих в своем геноме чужеродной ДНК [10]. Такие генотипы уникальны и могут служить основой для создания новых сортов.
Цель данной работы состояла в изучении популяций растений-регенерантов, сформированных на основе ложных трансформантов.
Материалы и методы
В качестве исходного материала использовали сорта льна-долгунца белорусской селекции Старт (Могилевская ОС), Василек и Белита (РУП «Институт льна»). Условия экспериментов по агробактериальной и био-листической трансформации описаны нами ранее [11, 12].
Молекулярно-генетический анализ растений-регенерантов. ДНК выделяли из растений с помощью Genomic DNA Purification Kit («Fermentas») согласно инструкции производителя. Для изучения сомаклональной изменчивости использовали 10 пар праймеров (Lu2, Lu3, Lu4, Lu8, Lu13, Lu15, Lu17, Lu21, Lu23, Lu28) [13]. ПЦР выполняли по стандартному методу. Полученные ПЦР-продукты разделяли капиллярным гель-электрофорезом на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Appl. Bios., США).
Хромосомные препараты. При приготовлении хромосомных препаратов использовали технологию, адаптированную к мелкохромосомным растениям [14]. Кончики корешков длиной 1-1,5 см и обрабатывали 1^1 О-6 раствором интеркалятора ДНК
9-аминоакридином (1 мкг/мл, «Sigma», США) при температуре от 0 до 4 °C в течение 10 ч. Корни фиксировали в фиксаторе Карнуа 3: 1 (этанол : ледяная уксусная кислота) в течение суток. Окраска корешков производилась 1%-ным раствором ацетокармина, после чего готовились давленые препараты. Препараты анализировали на микроскопе Leica DM RXA2 с оптикой Leica PlanAPO.
Световая микроскопия поперечного среза стебля. Анатомическое строение стебля изучали на поперечных срезах, взятых на середине технической длины всех растений-регенерантов на стадии желтой спелости. Отрезки стеблей 2-3 см фиксировали в размягчительной смеси спирт : вода : глицерин (1:1:1). Подсчеты и измерения проводили с помощью светового микроскопа Amplival и винтового окуляр-микрометра. Использовали увеличение 15*16, единицы измерения -деление окуляр-микрометра.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи пакета анализа данных Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
По результатам молекулярно-генетического анализа нами были отобраны шесть ложных растений-трансформантов, не несущих трансгенной вставки. Все они успешно адаптировались к условиям ex vivo и выращивались в контролируемых условиях климатической камеры. Наблюдения за онтогенезом данных растений показали, что фенологические стадии роста (елочка, быстрый рост, бутонизация, цветение, спелость) были намного продолжительней, чем у исходных сортов. Так, бутонизация наступила только после 180 дней
роста растений, тогда как весь вегетационный период у родительских сортов максимально составляет 105 суток. Пять ложных трансформантов сформировали генеративные органы и дали семена (У-1, У-2, У-3 от исходного сорта Василек, В-1 от исходного сорта Белита, S-2 от исходного сорта Старт).
Известно, что условия выращивания в значительной степени влияют на формирование хозяйственно ценных признаков, поэтому показатели растений, выращенных в контролируемых условиях, не могут быть стабильными
при последующей репродукции. Однако для выделения форм с положительными свойствами проведение первичной оценки необходимо.
Основная продуктивная часть растений льна-долгунца - это стебель, содержащий от 20 до 30% волокна, ради которого и воз-делывается эта культура. Признаки качества
По данным анализа, самыми высокими (признак «общая высота растения») оказались растения V-1, V-2; минимальная величина этого показателя отмечена у растения S-2 (100 см) (табл. 1). В ряде исследований показано, что высота растений льна-долгунца в зависимости от сортовых особенностей и условий выращивания варьирует в достаточно широком диапазоне (от 70 до 125 см), а при благоприятных условиях может достигать 130-140 см [15, 16].
Техническая длина стебля льна-долгунца -важный показатель продуктивности, от величины которого зависит урожай волокна. У изучаемых форм техническая длина стебля значительно превысила аналогичный показатель исходных сортов (62-78 см) и составила для растения B-1 - 104 см, для растения V-3 -95 см, для растений V-1, V-2 - 92 см, для растения S-2 - 100 см (табл. 1). При промышленном производстве растения льна-долгунца с общей высотой 80-100 см гарантируют получение высокого урожая волокна и семян [17].
В сформировавшихся на всех растениях коробочках завязались семена. Семена растения S-2 оказались не всхожи. Популяции растений, полученных на основе V-1, V-2, V-3, B-1, были испытаны как в полевых условиях, так и в условиях in vitro.
волокна непосредственно зависят от внешних характеристик льняного стебля, в частности, от общей высоты растения, технической длины и толщины стебля в его средней части. В табл. 1 приведены результаты анализа морфологических признаков ложных трансформантов поколения R0.
Характеристика процессов каллусогенеза и морфогенеза гипокотильных эксплантов популяции растений льна-долгунца поколения R1
Данные о морфогенетической способности гипокотильных эксплантов потомства ложных трансформантов (поколение R1) представлены на рис. 1. Формирование каллуса и на гипокотильных эксплантах исследуемых растений, и на гипокотильных эксплантах исходных сортов проходило одинаково активно, однако количество эксплантов, продуцирующих побеги, значительно различалось. Так, регенерационная способность эксплантов популяций У-1, У-2, У-3 была примерно в 4 раза ниже, чем у эксплантов исходного сорта. Сравнительное изучение регенерацион-ной способности эксплантов популяции В-1 и исходного сорта Белита выявило ту же закономерность - регенерация исходного сорта была в 3 раза выше, чем в популяции В-1 (рис. 1).
Возможно, что описанные эффекты связаны с пролонгированным действием стресса (трансформации), что вызвало генетическую нестабильность растений поколения R1. Подтверждением данного предположения является обнаружение полиэмбрионии в популяциях У-1, У-2. При анализе семян контрольной группы (1000 семян исходного сорта Васи-
Таблица 1
Морфологические признаки ложных трансформантов, полученных на основе сортов
Василек, Белита, Старт ^0)
Образец Растение, шт Общая высота, см Техническая длина, см Кол-во коробочек, шт Кол-во семян в коробочке, шт
V-1 1 150 92 5 6,2±1,3
V-2 1 150 92 11 4,5±0,8
V-3 1 140 95 7 6,1±1,1
B-1 1 128 104 8 6,75±0,9
S-2 1 100 90 2 13±0,5
Рис. 1. Сравнение эффективности морфогенеза и регенерационной способности популяций растений
«escapes» (R1) и исходных сортов
180 160 140 120 100 80 60 40 20
1
I I ш ■ >
0 V-1 V-2 V-3 V В-3 В □морфогенетаческий потенциал ■ регенерационная способность
лек) ни одного близнецового сеянца нами не обнаружено. А.В. Поляковым было проанализировано более 600 000 проростков, относящихся к 125 образцам льна (лен-долгунец, межеумок, кудряш). Средняя частота поли-эмбрионии составила 0,034%. Отмечено, что наименьшая частота появления близнецов была у льна-долгунца (0,032%) [18]
Близнецовые сеянцы легко отбираются по двум зародышевым корешкам, развивающимся из прорастающего семени. Обнаруженные нами близнецовые проростки разъединялись, высаживались в горшочки и выращивались в контролируемых условиях климатической камеры. Наблюдения за онтогенезом выявили разницу в развитии близнецов. Замедленная скорость роста и развития служат контролем гаплоидного состояния проростка, однако, окончательное подтверждение уровня плоидности можно получить с помощью цитологического подсчета хромосом в соматических клетках кончика корешка. Анализ метафазных пластинок корневых чехликов установил, что одна пара близнецов составляла сочетание гаплоидного и диплоидного растения, другая - гаплоидного и гаплоидного растения. Причины спонтанной полиэмбрионии точно не установлены. Данные многих исследователей указывают на полигенную природу признака. Показано, что из полиэмбриональных семян льна могут формироваться близнецовые растения в следующих комбинациях сочетаний: диплоид-диплоид, диплоид-гаплоид, гаплоид-гаплоид [18, 19].
Морфологические признаки популяции растений R1
При наблюдении за потомством растений ложных трансформантов в полевых условиях отклонений в развитии при прохождении фенологических стадий обнаружено не было. Анализ морфологических признаков поколения R1 выявил снижение средних значений показателей «общая высота растения» (от 10,5 до 28,8%) и «техническая длина» (от 8,0 до 28,8%) по сравнению с аналогичными показателями растений R0, в то же время показатель «количество коробочек» вырос в среднем в 4 раза, что, по-видимому, связано как с условиями роста растений, так и со снижением влияния посттрансформационного стресса (табл. 1, табл. 2).
Сравнительный анализ морфологических признаков популяции растений льна-долгунца R1 показал достоверное превышение уровня исходных сортов по признакам «общая высота растения» и «техническая длина» в двух популяциях - У-3, В-1; по признаку «количество коробочек» - в популяции ^3 (табл. 2).
При сравнении вариации морфологических признаков оказалось, что исходные сорта более однородны, чем полученные популяции поколения R1. Значения стандартного отклонения (а) по всем анализируемым признакам в контрольных группах растений были ниже, чем в популяциях растений-регенерантов, за исключением а признака «техническая длина» в популяции У-1 (табл. 2). Для сравнения вариабельности различных признаков рассчитан коэффициент вариации (и), который дает
возможность сравнивать изменчивость признаков, выражающихся в различных единицах измерения, и устанавливать различия в степени изменчивости. При оценке результатов полевых испытаний первого года оказалось,
В исследованиях А.В. Полякова отмечено, что популяции растений-регенерантов первого поколения по высоте и технической длине стебля находятся на уровне исходного сорта или выше, а по числу коробочек и семян на уровне или ниже контроля [18]. В других работах показано, что в большинстве случаев происходит снижение средних значений по количественным признакам, но возможно появление форм с положительными свойствами [21, 22].
Полученные нами данные свидетельствуют о нестабильности первого поколения растений-регенерантов и необходимости проведения дальнейших испытаний созданных форм.
Анатомические особенности стебля популяции растений R1
Основная ценность стебля прядильных льнов - волокнистые пучки, которые относятся к механическим тканям, повышаю-
что признак «число коробочек» - наиболее изменчивая величина для всех исследуемых популяций (табл. 2), что может быть обусловлено как особенностями генотипа, так и особенностями самого признака [20].
щим устойчивость к полеганию, изгибам, переломам и т.п. Они состоят из плотно склеенных пектиновыми веществами элементарных волокон - длинных клеток веретенообразной формы с заостренными концами. Количество и качество волокна льна-долгунца определяется степенью развития волокнистой ткани, т.е. лубяных пучков, расположенных в корковой части стебля и состоящих из элементарных волокон. Анатомические методы оценки качества волокна в стеблях льна широко используются в селекции данной культуры.
Агротехнические приемы оказывают значительное влияние на качество получаемого льняного волокна. В частности, разреженный посев ведет к формированию растений с толстыми стеблями, которые содержат крупные лубяные пучки и волоконца, но качество получаемого волокна невысокое. При посеве всхожих семян 1600-1800 шт/м2 загущение угне-
Таблица 2
Морфологические признаки популяции растений R1
Параметр V (контроль) V-1 (R1) V-2 (R1) V-3 (R1) B (контроль) B-1 (R1)
Общая высота растения, см 113,7±3,2 106,8±3,9 117,3±2,9 125,3±2,9* 72,9±1,66 112,9±3,9*
с 7,81±2,7 7,8±2,75 10,1±2,07 9,1±2,05 6,5±1,18 13,4±2,84
и 0,07 ±0,02 0,1±0,02 0,1±0,02 0,07±0,02 0,09±0,01 0,1±0,02*
Техническая длина, см 80,2±3,1 77,0±1,73 81,9±2,31 87,4±3,25* 59,4±1,29 74,0±4,3*
с 7,52±1,2 3,5±1,22 7,9±1,62 10,41±2,33 5,0±0,92 14,6±3,11
и 0,09±0,01 0,1±0,01 0,1±0,01 0,12±0,02 0,08±0,01 0,2±0,04*
Количество семян в коробочке, шт. 27,2±2,9 26,7±4,15 27,5±4,37 43,4±4,04* - 23,5±3,12
с 7,33±2,9 8,3±2,93 15,1±3,08 12,94±2,89 - 10,6±2,26
и 0,27±0,1 0,3±0,11 0,5±0,11 0,29±0,07 - 0,4±0,09
Количество семян в коробочке, шт. 7,0±0,4 7,5±0,86 6,8±0,43 5,8±0,32 - 6,0±0,56
с 1,09±0,6 1,7±0,61 1,5 ±0,03 1,0±0,23 - 1,9±0,40
и 1,16±0,08 0,2±0,08 0,2±0,04 0,2±0,04 - 0,3±0,07
* - достоверно при p < 0,05
тает активность клеток камбия и усиливает деление клеток перицикла. Как следствие, образуется большое число смыкающихся между собой компактно расположенных в стебле лубяных клеток и повышается выход качественного технического волокна [17, 23].
Небольшое количество семян, полученных нами от ложных трансформантов R0, не позволило обеспечить требуемую густоту стеблестоя растений поколения R1. Для корректности интерпретации результатов посев контрольных растений намеренно проведен с нарушением норм высева семян.
При исследовании строения растений поколения R1 обнаружено, что диаметр стебля колебался от 6,0 до 11,2 деления окуляр-микрометра для популяции В-1; от 7,8 до 13,1 деления окуляр-микрометра для популяции V-!, У-2, У-3; для контрольных растений -
Количество волокнистых веществ в льняном стебле зависит от количества пучков на срезе и числа элементарных волокон в пучке. Проведенный нами анализ установил, что количество пучков на срезе было максимальным у растений популяции У-3 (39,5), что является хорошим показателем как по сравнению с контрольными растениями нашего эксперимента (32,5), так и по сравнению с сортами льна-долгунца в целом (25-39,4) [24, 25]. Элементарные волоконца у качественного волокна должны быть некрупные, выровненные по диаметру с толстыми стенками и с небольшим просветом. Растения популяций У-1, У-2, У-3, В-1 имели хорошо вызревшие клетки граненой формы в количестве от 21,9 до 23,1 штук в одном лубяном пучке (табл. 3). Среднее
6,7-10,1 деления окуляр-микрометра, что являлось прямым следствием малой густоты стояния растений. В норме диаметр стебля у возделываемых сортов льна-долгунца может колебаться от 3,7 до 7,4 деления окуляр-микрометра [24].
Известно, что хорошее по качеству волокно дают стебли, имеющие лубяные пучки правильной овальной или вытянутой формы с ровными краями без заливов и выступов. В целом анализируемые растения популяции У-1, У-2, У-3, В-1 характеризовались плотными хорошо сформированными пучками округлой, овальной и тангентальной формы. Проведенные анатомические исследования срезов средней части стебля в фазе желтой спелости позволили выявить особенности строения растений регенерантов популяций У-1, У-2, У-3, В-1 поколения R1 (табл. 3).
число элементарных волокон в пучке у контрольного растения сорта Василек - 23,9 шт. Наиболее волокнистыми оказались растения популяций У-2 и У-3 (873,6 шт.). Наименьшее число волокон на срезе зафиксировано у растений популяции В-1 (752,0 шт.) (табл. 3). Показано, что в зависимости от генотипа значение данного признака может варьировать от 545 [25] до 1124 [24].
Диаметр клеток по растениям у анализируемых образцов колебался от 21,0 (В-1) до 86,0 (У (контроль), У-3) делений окуляр-микрометра и в среднем составил 51,5 (У-1), 47,5 (У-2), 48,9 (У-3), что сравнимо с популяцией контрольных растений (50,7 У (контроль)) (табл. 3). С.Ф.Тихвинский и др. предложили судить о качестве волокна в единичных
Таблица 3
Показатели анатомического строения стебля растений популяций поколения R1
Популяция Число пучков на срезе Число элементарных волокон на срезе Среднее число элементарных волокон в пучке Диаметр элементарного волокна Диаметр просвета элементарного волокна
У (контроль) 32,5±0,7 778,2±22,3 23,9±0,2 50,7±1,6 14,2±0,9
У-1 (Я1) 38,0±0,7* 831,5±53,4 21,9±1,7 51,4±2,1 14,8±1,7
У-2 (Я1) 37,8±1,1* 873,6±37,0* 23,1±0,6 47,5±0,9 14,4±0,7
У-3 (Я1) 39,5±0,9* 873,6±26,1* 21,1±0,2 48,9±0,8 14,6±0,6
В-1 (Я1) 35,6±1,1 752,0±32,6 22,8±0,4 45,1±0,9 14,2±0,6
* - достоверно при р < 0,05
стеблях льна по коэффициенту вариации диаметра элементарных волоконец в одном типичном лубяном пучке [26]. Чем больше коэффициент вариации, тем короче элементарные волоконца, так как в этом случае в плоскость среза попадают их узкие концы и варьирование возрастает. Качество волокна в образцах с короткими волоконцами хуже из-за обрывности при прядении.
С помощью метода двухвыборочного ^теста с различными дисперсиями получена информация об изменчивости диаметра элементарных волокон в пучке у популяций, сформированных на основе ложных трансформантов, и исходного сорта льна-долгунца (рис. 2).
Коэффициент изменчивости колебался от 9% до 26% в популяции У-1, от 11% до 31% в популяции У-2, от 13% до 37% в популяции V3. У растений контрольной группы данный показатель варьировал в пределах 12-25%. В среднем коэффициент изменчивости в популяциях и в контрольной группе растений был практически одинаков (26%, 23%, 23%
Молекулярно-генетический анализ популяции растений R1
Сомаклональные изменения могут иметь как наследственную генетическую природу, так и являться длительными модификациями. До недавнего времени большинство работ, посвященных изучению сомаклональной вариабельности, было связано с описанием морфологических и цитоге-нетических изменений у растений-регенерантов, а генетическая природа таких изменений оставалась неясной. В последнее время для исследования сомаклональной изменчивости широко используются молекулярные маркеры, основан-
и 24% соответственно). Анализ полученных данных доказывает влияние агротехники (густота стеблестоя) на показатель «диаметр элементарных волокон» растений льна-долгунца.
Таким образом, первичная оценка мор-фоанатомических показателей выявила недостаточную стабильность растений в популяциях V-!, ^2, ^3, В-1, полученных на основе ложных трансформантов, как следствие пролонгированного действия посттрансформационного стресса и нарушения агротехники (густота стеблестоя). Однако можно предположить, что растения данных популяций обладают качественным волокном, поскольку сформировали волокна граненой формы с небольшим внутренним просветом и в достаточно большом количестве в одном лубяном пучке [24, 25, 26]. Кроме того, растения популяций ^2, ^3 достоверно превзошли уровень исходного сорта по числу элементарных волокон на срезе на 12,2%.
ные на ПЦР, с помощью которых можно выявить изменения в нуклеотидной последовательности ДНК растений-регенерантов. Установлено, что уже на ранних этапах культивирования in vitro тканей кукурузы происходят перестройки генома, проявляющиеся в полиморфизме продуктов RAPD-ПЦР [28]. При сравнении спектров дига-плоидной линии яровой мягкой пшеницы Ю580R и полученных из нее гаметоклонов (ЛГВ3-692-3-5, ЛГВ2-92-2, ЛГВ1-92-2) выявлено 13 полиморфных RAPD-фрагментов, что подтверждает гипотезу возникновения генетических измене-
-•-V-1 —■—V-2 V-3 • V(K)
Рис. 2. Коэффициент изменчивости диаметра элементарных волокон в пучке
ний в результате культивирования in vitro [29].
Применение молекулярных методов на разных этапах культивирования клеток дает возможность отслеживать генетическую изменчивость и делать предположения о времени и природе возникновения мутаций. С помощью RAPD- и ISSR- анализа были обнаружены изменения ДНК у сомаклонов гороха в зависимости от продолжительности культивирования каллусов и исходного генотипа. Уровень изменчивости для регенерантов гороха, полученных из каллусов после 8 месяцев культивирования, варьировал в зависимости от генотипа от 0 до 5,6%, а для регенерантов, полученных после десяти лет культивирования - от 0,7 до 9,6%. Для шести из двадцати полиморфных фрагментов по базе данных GenBank была выявлена гомология с известными последовательностями хло-ропластного генома ДНК гороха, ретротранспо-зонами гороха Ту 3 copia и Ogre; а также была найдена гомология с митохондриальной ДНК растительного генома [21].
Недостаточно высокая разрешающая способность RAPD-метода при анализе полиморфизма близкородственных генотипов льна-долгунца обусловила выбор нами ми-кросателлитного анализа как высоковоспро-изводимого, более точного и информативного. Важной особенностью микросателлитов является то, что они быстрее, чем остальная ДНК, подвергаются «динамичным мутациям», которые приводят к появлению аллелей с различным количеством повторяющихся единиц [30]. Как следствие, микросателлиты очень полиморфны. Высокий полиморфизм в сочетании с повсеместным распространением и мультиаллелизмом обуславливает их широкое применение в качестве эффективного способа изучения фенотипической и генотипической изменчивости [31].
Для проведения SSR-анализа растений популяции R1 нами отобрано 10 пар наиболее информативных праймеров, описанных ранее [13, 32]. Все пары праймеров дали четкую картину амплификации. Данные маркеры выявляли от 1 до 4 аллелей, всего идентифицировано 24 аллеля размером от 165 до 378 пн. Восемь пар микросателлитных праймеров (Lu2, Lu3, Lu4, Lu8, Lu15, Lu17, Lu21, Lu28) амплифицировали от одного до четырех аллелей. Фрагменты соответствующих размеров обнаружены как в образцах популяций V-1, V-2,
V-3, B-1, так и в исходных сортах, т.е. полиморфизм по данным локусам не был обнаружен. Две пары праймеров (Lu13, Lu23) выявили полиморфизм в исследуемых генотипах.
Микросателлитный праймер Lu13 амплифици-ровал два аллеля 346 пн и 378 пн. В популяциях V-1, V-2, V-3, как и в исходном сорте Василек, встречался аллель 378 пн. Однако в популяции V-3 выявлен дополнительный аллель размером 346 пн (рис. 3а). Растения популяции B-1 по данному локусу не отличались от исходного сорта Белита по обнаруженным аллелям размером 346 пн и 378 пн.
Микросателлитный праймер Lu23 амплифи-цировал два аллеля 257 пн и 318 пн. У растений контрольной группы (исходный сорт Белита) данный маркер выявил оба аллеля, однако в популяции B-1 обнаружен только аллель размером 318 пн (рис. 3в). Для анализируемых образцов популяций V-1, V-2, V-3, как и для исходного сорта Василек, был характерен аллель 257 пн. Появление нового аллеля 318 пн обнаружено в популяциях V-2 и V-3 (рис. 3б).
Таким образом, полиморфизм микросателлит-ной ДНК был установлен у образцов V-2, B-1 по одному локусу (Lu23), а у образца V-3 по двум локусам (Lu13, Lu23), который проявлялся в появлении второго аллеля (3 случая), а также в отсутствии аллеля ожидаемого размера (1 случай). Подавляющая доля мутаций в микросателлитных локусах возникает за счет специфической ошибки репликации ДНК в районе микросателлита -проскальзывания (англ. slippage), что приводит к появлению аллеля нового размера. В то же время часть микросателлитных мутаций может изменять количество повторов как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения (на два и более повторов). Мутационные изменения, затрагивающие размеры микросателлитных кластеров и число микросателлитных звеньев, изменяют такие важные молекулярно-биологические и биохимические характеристики как нуклеотид-ный состав, GC-содержание локусов, энергию Гиббса образования ДНК/ДНК-дуплекса, соотношение молекулярных масс 5'-3' и 3'-5' последовательностей.
Таким образом, метод SSR-анализа позволил нам обнаружить изменения в геноме потомства растений «escapes» льна-долгунца и выявить их отличия по генетической структуре от исходных форм.
сорт Василек
сорт Василек
сорт Белита
популяция У-3
популяция У-3
популяция В-1
Рис. 3. Результаты амплификации ДНК растений с SSR праймерами
Морфологические признаки популяции растений К2
Несмотря на то, что использование сомакло-нальных вариаций в селекции предложено в 80-х годах прошлого века [33], на их основе создано очень мало сортов, что вероятно, связано с длительной нестабильностью семенных потомств растений-регенерантов. Для селекционного использования сомаклонов необходима достоверная информация о стабильности полученных хозяйственных признаков и уровне онтогенетической адаптации новых форм.
В 2011 году проходили полевые испытания семенного потомства растений-регенерантов Я1. Отмечено, что в популяции Я2 от исходного сорта Белита продолжительность вегетации растений сократилась на 7-10 дней по сравнению с контролем. В популяции Я2 от исходного сорта Василек продолжительность вегетации оставалась на уровне контрольных растений.
Анализ морфологических признаков поколения Я2 выявил увеличение средних значений показателей «общая высота растения», «техническая длина», «число коробочек» и «число семян» для популяций У-1, У-2, В-1 по сравнению с соответствующими группами контрольных растений (табл. 4). В популяции У-3 наблюдалось недостоверное снижение средних показа-
телей по признакам «общая высота растения» (на 2,3%) и «техническая длина» (на 1,7%) по сравнению с контролем (табл. 4). Сравнение вариации морфологических признаков показало, что в популяции растений поколения Я2 произошла значительная стабилизация анализируемых признаков как по сравнению с первым годом полевых испытаний популяций, так и по сравнению с исходными сортами.
Значения стандартного отклонения по признакам «общая высота растения», «техническая длина», «количество коробочек», «количество семян» в поколении Я2 были ниже, чем в поколении Ю, за исключением а признака «количество семян» в популяции У-3, что свидетельствует о постепенной стабилизации и выравнивании материала (табл. 2, табл. 3). Можно заметить, что количество коробочек во всех популяциях при испытаниях первого года было в 2-3 раза больше, чем при испытаниях второго года, что является следствием разря-женности посева в 2010 году и образования мощных ветвистых растений.
При сравнительном анализе популяций растений-регенерантов и исходных форм установлено, что значения а по всем анализируемым признакам в популяции В-1 (И2) были ниже, чем в контроле (В). В популяции У-1 (И2) значения стан-
дартного отклонения были ниже, чем в контроле по двум признакам «общая высота растения» и «техническая длина». В популяциях V-2 (R2), V-3 (R2) значения о были ниже, чем в контроле только по одному признаку - «общая высота».
Для исследуемых признаков рассчитан коэффициент вариации, который показал, что признак «число коробочек» при испытании в течении двух лет проявил наибольшую изменчивость во всех исследуемых популяциях (табл. 4), что подтверждает предположение об особенности данного признака. Коэффициенты вариации (и) также служат показателями экологической стабильности, то есть способности растений к адаптации. При изучении изменчивости признаков многолетника эспарцета песчаного (Onobrychis arenaria) установлено, что сомакло-
нальные растения с небольшим варьированием морфологических признаков были устойчивы к погодным изменениям и из года в год сохраняли вегетативную мощь, в то время как у растений с высоким варьированием наблюдалось значительное снижение морфологических параметров на протяжении жизненного цикла [34]. Результаты второго года полевых испытаний созданных образцов показали, что изменчивость признака «общая высота растения» в популяциях V-1, У-3, В-1 достоверно ниже, чем у исходных сортов, и можно предположить, что данный признак относительно стабилизировался. Следует отметить, что для популяции В-1 (Я2) характерна меньшая изменчивость и по всем остальным признакам, что свидетельствует о сбалансированности сформировавшегося генотипа (табл. 4).
Таблица 4
Морфологические признаки популяции растений R2
Параметр V (контроль) V-1 (R1) V-2 (R1) V-3 (R1) B (контроль) B-1 (R1)
Общая высота растения, см 118,8±1,9 129,9±0,72* 126,3±1,32* 116,1±1,10 105,6±2,55 119,6±1,02*
с 6,25±1,4 2,28±0,51 4,16±0,93 3,48±0,78 8,07±1,80 3,24±0.72
и 0,05±0,01 0,01±0,003* 0,03±0,007 0,03±0,007* 0,08±0,02 0,03±0,006*
Техническая длина, см 103,3±1,3 109,8±0,99* 109,4±1,36* 101,5±2,17 89,7±2,11 104,9±1,52*
с 4,14±0,92 3,12±0,70 4,30±0,96 6,85±1,53 6,67±1,49 4,79±1,07
и 0,04±0,01 0,03±0,006 0,04±0,009 0,07±0,01 0,07±0,02 0,05±0,01
Количество семян в коробочке, шт 5,7±0,39 12,1±0,64* 11,5±1,46* 9,2±0,74* 7,0±0,84 7,5±0,62
с 1,25±0,28 2,02±0,45 4,62±1,03 2,35±0,52 2,67±0,60 1,96±0,44
и 0,15±0,03 0,17±0,04 0,40±0,09* 0,25±0,057* 0,38±0,08 0,26±0,06
Количество семян в коробочке, шт 8,1±0,38 8,8±0,35 9,2±0,29* 8,9±0,46 6,9±0,41 8,6±0,52*
с 1,19±0,26 1,13±0,25 0,92±0,20 1,45±0,32 1,29±0,29 1,65±0,37
и 0,15±0,03 0,13±0,03 0,10±0,02 0,16±0,04 0,19±0,04 0,19±0,04
* - достоверно при p < 0,05
Заключение
Таким образом, для поколения R1 ложных трансформантов льна-долгунца характерны нестабильность признаков вегетативного и генеративного развития. Во втором поколении (Я2) происходит стабилизация признаков «общая высота растения», «техническая длина», «количество коробочек», «количество
семян». Генетическая трансформация, являясь стрессовым фактором, расширяет спектр генетической изменчивости льна-долгунца, выявляемой с помощью микросателлитного анализа, и в сочетании с индивидуальным отбором позволяет получить новый материал для селекции.
Список использов
1. Rutkowska-Krause, I. Regeneration of flax (Linum usitatissimum L.) plants from another culture and somatic tissue with increased resistance to Fusarium oxysporum / I. Rutkowska-Krause, G. Mankowska, M. Lukaszewicz, J. Szopa // Plant Cell Rep. - 2003. - V. 22. - P. 110-116.
2. Marshall, G. Somaclonal variation in Linum usitatissimum L. / G. Marshall, P. Courduries // Proceedings European Regional Workshop on Flax «Flax as a fibre and oil bearing crop». - Brno, Czechoslovakia, 18-20 June 1991. - P. 143-154.
3. McHughen, A.A Tissue culture derived salttolerant line of flax (Linum usitatissimum L.) / A. McHughen, M. Swartz // J. Plant Physiol. -1984. - V. 117. - P. 109-117.
4. O'Connor, B. Differential stress tolerance and cross adaptation in a somaclonal variant of flax / B. O'Connor, A. Robertson, L. Gusta // J. Plant Physiol. - 1991. - V. 139. - P. 32-36.
5. Jordan, M. Selection of chlorsulfuron-resistance in flax (Linum usitatissimum L.) cell cultures / M. Jordan, A. McHughen // J. Plant Physiol. - 1987. - V. 133. - P. 333-338.
6. Bretagne-Sagnard, B. Induced albina mutations as a tool for genetic analysis and cell biology in flax (Linum usitatissimum L.) / B. Bretagne-Sagnard, G. Fouilloux, Y. Chupeau // J. Exp. Bot. - 1996. - V.47. - P. 189-194.
7. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна. - Тверь, 2000. - 180 с.
8. Walbot, V. The plasticity of the plant genome - is it a requirement for success? / V. Walbot, C. Cullis // Plant Mol. Biol. Rep. -1983. - V 1. - P. 3-11.
9. Gaspar, T. Concepts in plant stress physiology. Application to plant tissue cultures / T. Gaspar, T. Franck, B. Bisbis, B. Bisbis, C. Kevers, L. Jouve, J. Hausman, Dommes // J. Plant Growth Regulation. - 2002. - V 37. - P. 263-285.
10. Jordan, M. Transformed callus does not necessarily regenerate transformed shoots / M. Jordan, A. McHughen // Plant Cell Rep. -1988. - V. 7. - P.285-287.
11. Лемеш, В.А. Создание генетически модифицированных растений льна (Linum usitatissimum L.) методом агробактериальной трансформации / В.А. Лемеш, Е.В. Гузенко, А.И. Емец, О.А. Баер, Г.Я. Баер, Е.Н. Шиша, Я.Б. Блюм, Н.А. Картель // Молекулярная и прикладная генетика. Сб. науч. тр. Институт
нных источников
генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол А.В. Кильчевский [и др.]. - Минск: Право и экономика, 2009. - Т. 9. - С. 139-145.
12. Лемеш, В.А. Создание генетически модифицированных растений льна (Linum usitatissimum L.) методом биолистической трансформации / В.А. Лемеш, Е.В. Гузенко, А.И. Емец, О.А. Баер, Г.Я. Баер, Е.Н. Шиша, Я.Б. Блюм, НА. Картель // Весщ НАН Беларусь Сер. бiял навук. - 2010. - №1. - С.18-23.
13. C. Roose-Amsaleg, E. Cariou-Pham, D. Vautrin, R. Tavernier, M. Solignac. Polymorphic microsatellite loci in Linum usitatissimum L. // Molecular Ecology Notes. - 2006. - 6. - P. 796-799.
14. Муравенко, О. Исследование хромосомной организации геномов мелкохромосомных растений / О. Муравенко, А. Зеленин // Генетика. - 2009. - Т. 45. - №11. - С. 1516-1529.
15. Ebskamp, J.M. Engineering flax and hemp for an alternative to cotton // Trends Biotech-nol. - 2002. Vol. 20. - №6. - P. 229-230.
16. Morvan, C. Building flax fibers: more than one brick in the walls / C. Morvan, C. Andeme-Onzighi, R. Girault // Plant. Physiol. Biochem. -2003. - Vol. 41. - №11-12. - P. 935-944.
17. Лен: энциклопеция / сост. Л.В. Ловчая; под ред И.А. Голуба. - Минск: Беларус. энцыкл. iмя П. Броую, 2009. - 168 с.
18. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна: Монография. Издание второе. - М., 2010. - 201с.
19. Obert, B. Doubled haploid production in Flax (Linum usitatissimum L.) / B. Obert, Z. Zackova, J. Samaj,A. Pretova // Biotechnology Advances. - 2009. - V. 27. - P. 371-375.
20. Рокицкий, П.Ф. Биологическая статистика. - Изд. 3-е, испр. - Минск: Вышэйш. школа, 1973. - 320 с.
21. Кузнецова, О.И. Молекулярно-генети-ческий анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха : автореф. дис. ... канд. биол.наук : / О.И. Кузнецова. - М., 2005. - 19 с.
22. Полонецкая, Л.М. Сравнительный анализ стабильности и генотипической изме-нивости признаков продуктивности популяций льна-долгунца Linum usitatissimum L, сформированных на основе регенерантов соматического происхождения / Л.М. Полонецкая, В.И. Сакович, Л.В. Хотылева //
Современные проблемы генетики: мат-лы междунар. науч. конф., Минск, 17-18 ноября 2005 г.: в 2 ч. / Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси; редколл.: А.В. Кильчевский, [и др.]. - Минск, 2005. - Ч. 1. - С. 184
23. Семенова, Е.Ф. Анатомо-морфологи-ческие особенности стебля в онтогенезе растений льна сорта Санлин и оценка его технического качества / Е.Ф. Семенова, АН. Чебураева, Т.М. Фадеева, Н А. Мороз-кина // Сел. биол. - 2007. - №5. - С.94-99.
24. Генетика, физиология и биохимия льна / В.В. Титок и др., под общ ред. Л.В. Хотылевой. - Минск: Беларус. навука, 2010. - 220 с.
25. Федосова, Н.М. Особенности анатомического строения стеблей льна-межеумка // Вест. ВНИИЛК. - 2003. - №1. - С. 17-21.
26. Тихвинский, С.Ф. Методы оценки качества льняного волокна на первых этапах селекции / С.Ф. Тихвинский, С.В. Доронин, Е.В. Дудина, И.Н. Бабинцева // Экономика производства и квалиметрия лубоволокнистых материалов. Вестник. -2003. - С.73-75.
27. Сафина, Н.З. Источники высокого качества волокна для селекции льна-долгунца, выделенные с использованием анатомического метода: автореферат дис. канд. сельскохозяйственных наук: 06.01.05 / Все-рос. науч.-исслед. ин-т растениеводства им. Н.И. Вавилова. - Санкт-Петербург: РАСХН, 2003. - 16 с.
28. Андреев, И.О. Генетические эффекты культивирования in vitro тканей кукурузы / И.О. Андреев, Е.В. Спиридонова, Д.Н. Майда-нюк, В.А. Кунах // Физиол. и биохим. культур. растений. - 2009. - Т. 41. - №6. - С. 487-495.
29. Беккужина, С.С. Гаплоидные технологии в ускоренном создании исходных форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засухе и Septoria nodorum BERK // автореф. дисс. д.б.н. - М., 2011. - 42 с.
30. Gao, L.F. One hundred and one new microsatellite loci derived from ESTs (EST-SSRs) in bread wheat // Theor. Appl. Genet. -2004. - V. 108. - P. 1392-1400.
31. Gupta, P.K. The development and use of microsatellite markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat / P.K. Gupta, R.K. Varshney // Euphytica. -2000. - V.113. - P.163-185.
32. Рачинская, О.А. Межсортовой полиморфизм геномов льна (Linum usitatissimum L.) по молекулярно-цитогенетическим маркерам / О.А. Рачинская, О.В. Муравенко, Н.Л. Большева и др. // Генетика. - 2011. - Т. 47. - №1. - С.1-11.
33. Larkin, P.J. Somaclonal variation - a novel source of variability from cell cultures for plant improvement / P.J. Larkin, W.R. Scowcroff // Theor. Appl. Genet. - 1981. - V. 60. - P. 197-214.
34. Рожанская, О.А. Создание исходного материала для селекции кормовых культур в условиях Сибири с помощью методов биотехнологии : автореф. дис. ... д-ра биол. наук : / О.А. Рожанская. - Новосибирск, 2007. - 129 с.
Дата поступления статьи 18 ноября 2011 г.
