CC BY
4УДК 581.143.6:633.521
О.А. Орловская, В.И. Сакович, В.А. Лемеш, Л.В. Хотылева
эмбриогенез и регенерация растений из гипокотильных
сегментов межсортовых гибридов льна
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Лен принадлежит к одной из важнейших сельскохозяйственных культур комплексного использования. Лен-долгунец экономически важен для Беларуси, поскольку является основной и очень ценной технической культурой, практически единственным источником натуральных волокон для производства отечественных бытовых тканей. Льняное масло - незаменимый компонент лакокрасочной, парфюмерной и многих других отраслей. Для повышения эффективности льноводства ведутся интенсивные разработки новых способов повышения урожая волокна у льна-долгунца и семян у льна масличного. Использование биотехнологических методов культивирования клеток и тканей in vitro, позволяет расширить спектр генетического разнообразия, ускоренно получить выровненный материал, быстро размножить и, в конечном итоге, в сжатые
сроки создать качественно новые, конкурентоспособные сорта [1-3]. Перспективность использования клеточной селекции для улучшения растений не вызывает сомнений, однако практическое использование культуры клеток и тканей у льна в настоящее время ограничено. Необходимо учитывать, что регенерация побегов является сложным процессом, который зависит от генотипа, гормонального состава среды, физиологического возраста и происхождения экспланта, условий культивирования и многих других факторов [4-7]. Нами проведена оценка и оптимизация условий, влияющих на регенерацию побегов из гипокотиль-ных сегментов межсортовых гибридов льна в культуре in vitro для разработки ускоренных методов вегетативного размножения ценных генотипов льна, а также для проведения генетической трансформации этой культуры.
В качестве материала для исследования использовали гибриды льна-долгунца Прамень х Оршанский 2, Прамень х К-65, Прамень х М-12, Прамень х Нива, Прамень х Вита и гибриды масличного льна Gold Flax х Лирина, Gold Flax х Ручеек. Необходимо отметить, что при создании межсортовых гибридов льна-долгунца в качестве компонентов скрещивания выступали сорта, которые согласно полученным ранее данным обладают высокой регене-рационной способностью [8].
Семена гибридов стерилизовали 30 с в 70% этаноле, затем 7 мин в растворе диацида и 3-4 раза промывали в автоклавированной воде по 10 мин. Стерилизованные семена проращивали в чашках Петри на питательной безгормо-
лы и методы
нальной среде, содержащей половинный набор макросолей среды MS [9], 0,8% агара, 3%, сахарозы, рН 5,7 в течение 1-2 суток в темноте, а затем переносили в световую камеру. Спустя 3-5 дней сегменты гипокотиля переносили на питательную среду MS с добавлением 1 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) и 0,05 мг/л НУК (а-нафтилуксусная кислота). Культуру инкубировали при температуре 23°С и 16-часовом фотопериоде. Нами изучена регенерационная способность гипокотильных сегментов разного возраста (6- и 13-суточные), величины (2-3, 4-6 и 7-10 мм) и из различных частей проростка (верхней, средней). Эффективность каллусообразования оценивали как отношение числа эксплантов, образующих каллус,
к общему числу эксплантов. Измеряли также размер (диаметр) каллусов: мелкие (до 3 мм), средние (3-6 мм), крупные (более 6 мм). Эффективность регенерации определяли через 5 недель после начала культивирования как отношение количества побегов (более 8 мм длиной) к общему количеству эксплантов.
Регенерированные побеги длиной 2,5-3,5 см
впоследствии укореняли на питательной среде с уменьшенным содержанием основных минеральных элементов (0,5 MS) и сниженной концентрацией сахарозы до 1%. Также изучали влияние а-нафтилуксусной кислоты (0,1 мг/л) и комплекса витаминов по Гамборгу на укоренение побегов межсортовых гибридов льна, полученных на гипокотильных сегментах.
Результаты и обсуждения
Влияние возраста экспланта. Для определения оптимального для регенерации возраста экспланта различных генотипов льна, гипоко-тили срезали с 6- и 13-суточных проростков. У всех изученных генотипов отмечена высокая частота калуссогенеза независимо от возраста экспланта (Табл. 1). Регенерационная способность, как правило, уменьшалась с увеличением возраста гипокотильного сегмента. Особенно ярко данная тенденция проявилась у комбинации Прамень х Оршанский 2. Так, при культи-
вировании 6-суточных проростков эффективность регенерации у этого гибрида составила 55,6%, а из 13-суточных эксплантов не удалось получить ни одного побега. Только у одной гибридной комбинации Прамень х М-12 частота побегообразования, напротив, возрастала с увеличением возраста гипокотильных сегментов (Табл. 1). Таким образом, лучшей способностью к регенерации обладали экспланты, срезанные с 6-суточных проростков, которые использовались в наших дальнейших экспериментах.
Таблица 1
Эффективность каллусообразования и регенерации на гипокотильных сегментах межсортовых гибридов льна в зависимости от возраста экспланта
Комбинация скрещивания 6-суточные экспланты 13-суточные экспланты
Эффективность каллусообразования, % Эффективность регенерации, % Эффективность каллусооб-разования, % Эффективность регенерации, %
Прамень х Оршанский 2 100 55,6 100 0
Прамень х М-12 100 43,8 100 83,7
Прамень х К-65 100 57,9 100 56,3
Прамень х Нива 100 188,9 100 106,7
Прамень х Вита 100 29,6 100 7,1
Gold Flax х Лирина 100 48,0 100 23,6
Gold Flax х Ручеек 100 86,5 100 70,3
Влияние величины экспланта. На следующем этапе исследования изучали способность к каллусообразованию и регенерации побегов в зависимости от величины экспланта. С этой целью использовали 6-суточные экспланты ги-покотилей размером 2-3 мм, 4-6 мм и 7-10 мм. В ходе эксперимента выявлена способность к каллусообразованию для всех генотипов, но частота каллусогенеза и интенсивность роста
каллуса у них различалась. Высокая эффективность каллусообразования характерна для гибридных комбинаций Прамень х Оршанский 2, Прамень х К-65, Прамень х Нива, Прамень х Вита, Gold Flax х Лирина (Табл. 2). Необходимо отметить, что у данных генотипов каллусы формировались одинаково хорошо на эксплан-тах разной величины, а у гибридов Прамень х М-12 и Gold Flax х Ручеек на сегментах гипо-
котиля длиной 2-3 мм процесс каллусогенеза протекал с низкой частотой (4,71 и 23,4% соответственно). Экспланты размером 2-3 мм комбинации Прамень х М-12 продуцирова-
В результате проведенного исследования выявлена зависимость между величиной экспланта и эффективностью регенерации. Частота регенерации возрастала с увеличением размера гипокотильного сегмента у всех изученных гибридных комбинаций, т.е. больше всего регенерантов формировалось на эксплантах длиной 7-10 мм (Рис. 1). Наибольшая эффективность регенерации на сегментах гипокотиля этого размера отмечена для комбинации Прамень х Нива (188,9%). Сегменты длиной 2-3 мм продуцировали меньше всего побегов. Исключение составила только комбинация Прамень х Оршан-
ли только мелкие каллусы, в то время как на сегментах гипокотиля остальных изученных гибридов таких каллусов обнаружено меньше всего (Табл. 2).
ский 2, у которой частота регенерации была наименьшей в варианте с 4-6 мм экспланта-ми (Рис. 1).
Влияние места инициации. Известно, что важным фактором регулирования морфогенеза у тканей в условиях in vitro является место инициации экспланта, а также ориентация его на питательной среде. Соответствующие манипуляции с эксплантом могут значительно увеличить эффективность регенерации. В наших исследованиях использовались 7-10 мм экспланты льна, инициированные как из верхней, так и средней части гипокотиля.
Таблица 2
Эффективность каллусообразования на гипокотильных сегментах межсортовых гибридов льна в зависимости от величины экспланта
Комбинация скрещивания Длина гипокотильных сегментов, мм Кол-во эксплантов, шт. Кол-во эксплантов, образующих каллус, шт. Эффективность каллусообразо-вания, % Размер каллусов, шт.
мелкие средние крупные
Прамень х Оршанский 2 2-3 92 92 100 7 56 29
4-6 35 35 100 4 16 15
7-10 45 45 100 5 15 25
Прамень х М-12 2-3 85 4 4,7 4 0 0
4-6 58 58 100 8 27 23
7-10 47 47 100 1 22 24
Прамень х К-65 2-3 66 66 100 5 40 21
4-6 52 49 94,2 3 27 19
7-10 38 38 100 0 19 19
Прамень х Нива 2-3 123 99 80,5 12 66 21
4-6 55 55 100 3 38 14
7-10 18 18 100 0 15 3
Прамень х Вита 2-3 152 143 94,1 11 108 24
4-6 88 88 100 5 55 28
7-10 52 52 100 1 41 10
Gold Flax х Лирина 2-3 77 77 100 2 49 26
4-6 44 44 100 0 24 20
7-10 25 25 100 0 14 11
Gold Flax х Ручеек 2-3 94 22 23,4 4 12 6
4-6 62 62 100 7 35 20
7-10 52 52 100 0 29 23
S Я Я л ft <u Я
¡2 <u ft -С
н о о я
х
S £
(U
m
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20
1
2
3
4
■ эксплант длиной 2-3 мм □ эксплант длиной 4-6 мм
■ эксплант длиной 7-10 мм
7
генотип
Рис. 1. Эффективность регенерации на гипокотильных сегментах межсортовых гибридов льна в зависимости от величины экспланта (%). 1- Прамень х Оршанский 2,
2- Прамень х М-12,
3- Прамень х К-65,
4- Прамень х Нива,
5- Прамень х Вита,
6 - Gold Flax х Лирина,
7 - Gold Flax х Ручеек.
0
5
6
Таблица 3
Эффективность каллусообразования и регенерации на верхних и средних сегментах
гипокотиля межсортовых гибридов льна
Верхние сегменты гипокотиля Средние сегменты гипокотиля
Комбинация скрещивания Эффективность каллусооб- Эффективность регенерации, % Эффективность каллусооб- Эффективность регенерации, %
разования, % разования, %
Прамень х Оршанский 2 100 63,6 100 47,8
Прамень х М-12 100 45,5 96,2 44,0
Прамень х К-65 100 62,5 100 54,6
Прамень х Нива 100 200,0 100 175,0
Прамень х Вита 100 38,5 100 22,5
Gold Flax х Лирина 100 64,3 100 27,3
Gold Flax х Ручеек 100 96,15 100 65,4
У всех гибридов процессы дедифферен-циации проходили довольно быстро, и уже через неделю после начала культивирования на эксплантах как с верхней, так и средней частей проростка формировался плотный светло-зеленый каллус. При анализе реге-нерационной способности исследуемого материала установили, что каллусы верхних сегментов гипокотиля продуцировали больше регенерантов, чем каллусы средних сегментов (Табл. 3). Наиболее четко данная зависимость прослеживалась для масличного льна. Так, для комбинации Gold Flax х Лирина эффективность регенерации на верхних сегментах экспланта составила 64,3%, а
на средних - 27,3%, для гибрида Gold Flax х Ручеек 96,15% и 65,4% соответственно. Для гибридов, созданных с участием льна-долгунца, способность к побегообразованию на верхних и средних частях гипокотиля отличалась не так значительно (Табл. 3).
Влияние генотипа. Проведенные эксперименты выявили зависимость способности к регенерации на гипокотильных сегментах льна от возраста, величины и места инициации экс-планта. Наибольшее количество побегов получено на 6-суточных сегментах длиной 7-10 мм и эксплантах из верхней части гипокотиля. Кроме того, эффективность регенерации зависела от генотипа (Рис. 2).
250
200
ft <u К
g 150 л
о к
х ?
Й 50
(U
m
0
In 1 rl t 1
Рис. 2. Эффективность регенерации на гипокотильных сегментах межсортовых гибридов льна в зависимости от генотипа (%). 1- Прамень х Оршанский 2, \2- Прамень х М-12,
3- Прамень х К-65,
4- Прамень х Нива,
5- Прамень х Вита,
6 - Gold Flax х Лирина,
7 - Gold Flax х Ручеек.
□ эксплант длиной 7-10 мм ■ апикальный сегмент гипокотиля
1
2
3
4
5
6
7
Так, на 7-10 мм сегментах гипокотиля данный показатель варьировал от 29,6% до 188,9%. Как видно из рисунка 2, наибольшая частота регенерации отмечена для комбинации Прамень х Нива. Среди гибридного материала масличного льна можно выделить комбинацию Gold Flax х Ручеек (86,6%). Наилучшая эффективность регенерации у данных генотипов сохранялась и при длине экспланта 4-6 мм (58,2% и 45,2% соответственно).
При изучении способности гипокотильных сегментов льна к регенерации побегов в зависимости от места инициации также четко прослеживалась роль генотипа. Самую высокую частоту побегообразования (200%) наблюдали на апикальных сегментах проростка гибрида Прамень х Нива, а самую низкую - Прамень х Вита (38,5%). Необходимо отметить, что во всех экспериментах (изучение влияния возраста, размера и места инициации экспланта на эффективность регенерации) комбинация Прамень х Нива демонстрировала наибольшую способность к образованию побегов, а
Прамень х Вита - наименьшую.
Последующее изучение укоренения побегов льна, полученных на сегментах гипокотиля, показало зависимость ризогенеза от генотипа. Процесс образования корней лучше всего протекал у гибрида Прамень х Нива, созданного на основе льна-долгунца (30,2%). Частота укоренения у лучшего по данному показателю межсортового гибрида масличного льна Gold Flax х Ручеек составила 26,5%. Известно, что такие микроэлементы, как бор, молибден, а также тиамин играют важную роль в процессе индукции образования побегов и корней. Нами было изучено влияние а- нафтилуксусной кислоты (0,1 мг/л) и комплекса витаминов по Гамборгу на укоренение побегов межсортовых гибридов льна (Табл. 4).
Проведенные исследования показали, что наилучшее укоренение побегов получено при использовании питательной среды, содержащей макро- и микросоли среды MS в половинной концентрации, сахарозу в концентрации 1% и агар - 8%.
Таблица 4
Влияние минерального состава питательной среды и а-нафтилуксусной кислоты на укоренение побегов межсортовых гибридов льна
Питательная среда Частота укоренения, %
0,5 MS 35,5
0,5 MS + НУК 4,8
0,5 MS + витамины по Гамборгу 16,3
Практически все регенеранты в этом случае имели по 3-5 корней, что было достаточно для
хорошей адаптации при пересадке в почву. Добавление к данной среде НУК в концентрации 1 мг/л отрицательно сказывалось на образовании корней у побегов межсортовых гибридов льна. Частота укоренения в данном случае была наименьшей (Табл. 4). Культивирование по-
бегов на среде 0,5 MS, содержащей витамины по Гамборгу, позволило получить 16,3% укорененных регенерантов. Можно отметить, что витамины способствуют формированию более жизнеспособных побегов, которые лучше адаптируются к обычным условиям роста.
Заключение
Проведенные исследования подтвердили, что процессы каллусогенеза, регенерации и укоренения в культуре in vitro зависят от генотипа исходного материала. Установлено, что сегменты гипокотиля различного возраста, величины и из разных частей проростка обладают неодинаковой способностью к регенерации. Наибольшее количество побегов получено на 6-суточных сегментах длиной 7-10 мм и эксплантах из верхней части гипокотиля. Питательная среда, содержащая основные питательные элементы в половинной кон-
центрации, сахарозу в концентрации 10 г/л и агар - 8 г/л является наиболее эффективной, для укоренения побегов, в сравнении с другими средами, изученными нами. В результате проведенного эксперимента выделены генотипы с высокой регенерационной способностью и подобраны оптимальные условия для получения регенерантов льна из гипокотиль-ных сегментов. Полученные данные используются нами в дальнейших исследованиях по проведению генетической трансформации L. usitatissimum Ь.
Список использованных источников
1. Pretova, A. Haploid formation in maize, barley, flax, and potato / A. Pretova, B. Obert, Z. Bartosova // Protoplasma. - 2006. - Vol. 228, № 1. - P. 107-114.
2. Steiss, R. Development of linseed for industrial purposes via pedigree-selection and haploid technique / R. Steiss, A. Schuster, W. Freidt // Industrial Crops Products. - 1998. - Vol.7, № 3. -P. 303-309.
3. Поляков, А. В. Биотехнология в селекции льна / А. В. Поляков. - Тверь, 2000. - 180 с.
4. Regeneration of flax (Linum usitatissimum L.) plants from anther culture and somatic tissue with increased resistance to Fusarium oxysporum/ I. Rutkowska-Krause [et al.] // Plant Cell Rep. - 2003. - Vol.22, № 2. - P.110-116.
5. Evtimova, M. Flax Improvement by biotechnology means / M. Evtimova, M. Vlahova, A. Atanassov // Journal of Natural Fibers. - 2005. -
Vol. 2, № 2. - P. 17-34.
6. Flax anther culture: effect of genotype, cold treatment and media / B. Obert [et al.] // Plant Cell tissue Organ Cult. - 2004. - Vol. 79. -P. 233-238.
7. Shoots and embrio-like structures regenerated from cultured flax (Linum usitatissimum L.) hy-pocotyls segments / B. Dedicova [et al.] // J.Plant Physiol. - 2000. - Vol. 157, № 3. - P. 327-334.
8. Шут, М.В. Культура in vitro и регенерация растений льна-долгунца (Linum us-itatissimum L.), районированных в Беларуси / М.В. Шут //Весщ Нацыянальнай Акадэмп Навук Беларусь - 2005. - № 5, ч. 2. -С. 110-112.
9. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Scoog // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15, № 4. - P. 473-497.
Дата поступления статьи 9 апреля 2009 г.
