CC BY
0
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
В качестве контрольной группы — 72 донора крови и ее компонентов. Выделение ДНК проводили из 5—10 мл крови и костного мозга с использованием стандартной солевой экстракции и с помощью набора реагентов «АтрЬЗепэ» (Россия) и в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и чистоту ДНК оценивали спектрофотометрически. Мутацию ЛАК2 У617Р количественно определяли с помощью «Набора реагентов для обнаружения мутации У617¥ О/Т гена ЛАК2» («Синтол», Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Полиморфизмы С1691А в гене ¥5 (мутация Лейдена), 020210А и Т165М в гене ¥2, С677Т и А1298С в гене МТОТК и (675)40/50 в гене РА1-1 с помощью разработанной нами мультиплексной аллель-специфической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (АС-
ПЦР-РВ).
Результаты и обсуждение. У 86% пациентов с МПЗ (группа № 1) была обнаружена мутация в гене ЛАК2. В контрольной группе (№ 2) мутации в гене ЛАК2 не обнаружено. Распределение частот мутаций 01691А в гене Р5 (мутация Лейдена), 020210А и Т165М в гене ¥2, С677Т и А1298С в гене МТОТК и (675)40/50 в гене РА1-1 в группах № 1 и 2 представлено в таблице. В группе № 1 частота гетерозиготной мутации в гене Р5 составила 8,9%. Это более чем в 6 раз превышает аналогичное значение в группе № 2. В 1,74 раза частота гомозиготной мутации (675)40/50 в гене РА1-1 в группе № 1 оказалась больше, чем в группе № 2. Частоты гетерозиготной мутации Т165М в гене ¥2 у пациентов и доноров крови составили 28,9% и 4,4% соответственно. Таким образом, частоты
мутаций генов Р5, Р2 и РА11 статистически значимо различаются у пациентов с тромбозами, ассоциированными с МПЗ, и доноров крови и ее компонентов.
Заключение. Информация о наличии маркеров наследственной тромбофилии может иметь прогностическое значение для оценки риска тромботических осложнений у пациентов с МПЗ с мутацией ЛАК2 У617Р
Таблица. Встречаемость мутаций в генах тромбофилии у пациентов с МПЗ и тромбозами (группа № 1) и доноров крови и ее компонентов
группа № 2)
Мутация Вид мутации Частота мутации в группе №, % ODR/P
1 2
F 5 G1691A гетерозиготная 8,9% (4/45] 1,4(1/71) ODR=6,8 (0,7-63,2) PFisher= 0,07
гомозиготная 0 0
MTHFRC677T гетерозиготная 1^8% (8/45) 49,3% (35/71)
гомозиготная 6,7% (3/45] 8,5% (6/71) P,2=0,002
MTHFRA1298C гетерозиготная 60% (27/45) 46,5% (33/71)
гомозиготная 4,4% (2/45) 5,6% (4/71) P,2=0,4
PAI 1 (-675)4G/5G гетерозиготная 3^8% (17/45) 62% (44/71)
гомозиготная 44,4% (20/45) 25,4(18/71) P,2=0,04
F2G20210A гетерозиготная 4,4% (2/45) 2,8% (2/71)
гомозиготная 2,2% (1/45) 0 PP=0,4
F2T165M гетерозиготная 28,9% (13/45) 26,8% (19/71)
гомозиготная 4,4% (2/45) 7,0% (5/71) P/=0,8
Макаров М. С.
ВЛИЯНИЕ РАЗНЫХ ДОЗ ТИКАГРЕЛОРА НА АКТИВНОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы»
Введение. Препараты-антиагреганты широко используются для предотвращения развития тромботических осложнений. Антитромботический эффект антиагрегантов достигается путем снижения способности тромбоцитов к активации на фоне сохранения их структурной целостности. Подбор эффективной дозы ан-тиагреганта имеет большое значение для клинической практики. В настоящее время все большее распространение получает препарат прямого действия тикагрелор, однако обоснование необходимых дозировок проводится без подробного исследования структурной целостности и функциональной активности тромбоцитов
Цель работы. Исследовать влияние разных доз тикагрелора на морфофункциональные характеристики тромбоцитов человека.
Материалы и методы. Исследовали тромбоциты венозной крови, взятойу 30 доноров компонентов крови. Анализ тромбоцитов проводили с помощью морфофункционального метода, включающего окрашивание тромбоцитов витальными флуорохромны-ми красителями с последующим их анализом во флуоресцентном микроскопе (Патент РФ № 2485502). В работе исследовали тромбоциты в присутствии 5—100 мг/л тикагрелора. Оценивали мор-фофункциональную активность тромбоцитов (МФАТ), в баллах (норма 35—60 баллов); долю тромбоцитов с гранулами, не адгези-рующих на стекле (%); долю тромбоцитов, способных в процессе адгезии формировать обширную ламеллу (%).
Результаты и обсуждение. Дозы 5 и 10 мг/л тикагрелора не оказывали видимого действия на адгезивную активность тромбоцитов — практически все биологически полноценные тромбоциты с гранулами активно адгезировали на стекле и формировали
ламеллу. При 15 мг/л доля адгезирующих клеток с ламеллой значительно снижалась и составила 27,5±1,9%, доля клеток, не способных адгезировать, — 34,6±2,3% соответственно. В опытах с 25 и 30 мг/л тикагрелора рост ламеллы полностью отсутствовал, одновременно с этим свыше 50% тромбоцитов с гранулами не контактировали со стеклом. Наиболее заметным этот эффект был в опытах с 30 мг/л, где доля тромбоцитов, не адгезирующих на стекле, составила 78,4±2,2%. В присутствии 35 мг/л тикагрелора доля тромбоцитов с гранулами, не способных адгезировать на стекле, значимо не отличалась от аналогичного показателя при 25 пг/мл (53,1±2,5%), при этом 10% тромбоцитов формировали ламеллу, т.е. эффект ингибирования роста ламеллы был уже меньше, чем при 25—30 мг/л тикагрелора. В условиях 5—35 мг/л тикагрелора уровень МФАТ тромбоцитов соответствовал норме. При дозах тикагрелора 50—100 мг/мл еще до контакта со стеклом в тромбоцитах с гранулами наблюдалось изменение морфологии, снижение МФАТ, т.е. 50—100 мг/л тикагрелора вызывали повреждение тромбоцитов с гранулами. При этом более 80% тромбоцитов с гранулами могли адгезировать на стекле, у 20—30% тромбоцитов с гранулами формировалась ламелла. Таким образом, избыточные дозы тикагрелора уже не оказывают желаемого блокирующего действия на тромбоциты и могут быть токсичными для тромбоцитов.
Заключение. Для блокировки адгезивной активности тромбоцитов без нарушения их структурной целостности наиболее эффективной является доза 30 мг/л тикагрелора. При концентрации тикагрелора 50 мг/л эффективность препарата резко снижается, одновременно с этим происходит повреждение структуры тромбоцитов.
Макунина Э. А., Соловьев М. В., Фирсова М. В., Шерстнев А. А., Абакумова А. В., Мамаева Е. А., Старцев А. А., Сурин В. Л.,
Ковригина А. М., Менделеева Л. П.
СОПОСТАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА MAGE-C1 И БЕЛКА MAGE-Cl У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ
В ДЕБЮТЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. В настоящее время сохраняется необходимость течения множественной миеломы (ММ) и мониторинга отве-в поиске оптимизированных инструментов для прогнозирования та на терапию. Аберрантная экспрессия гена MAGE-C1 и белка
| ГЕМАТОЛОГИЯ И ТРАНСФУЗИОЛОГИЯ | RUSSIAN JOURNAL OF HEMATOLOGY AND TRANSFUSIOLOGY (GEMATOLOGIYA I TRANSFUSIOLOGIYA) | 2022; ТОМ 67; №2 |
mage-cl активно изучается в качестве нового маркера опухолевой активности ММ.
Цель работы. Определить экспрессию гена MAGE-C1 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и белка mage-cl иммуногистохимическим (ИГХ) методом и сопоставить результаты двух методов.
Материалы и методы. В проспективное исследование с февраля 2019 г. по ноябрь 2021 г. включено 32 больных ММ (18 мужчин, 14 женщин) в возрасте от 35 до 68 лет (медиана 57). Диагноз устанавливали согласно критериям IMWG. Всем больным в дебюте заболевания определялиуровень экспрессии гена MAGE-C1 методом ПЦР-РВ в образцах костного мозга, обогащенного CD138+ клетками, а также экспрессию белка mage-cl в трепанбиоптатах костного мозга ИГХ-методом. Срок наблюдения составил от 1 до 26 месяцев (медиана 18). В качестве контроля использовались данные, полученные при исследовании костного мозга и трепанобиоптатов 7 здоровых доноров. Максимальное значение экспрессии гена MAGE-CI у доноров составило 0,06 (2ACt). При проведении ИГХ-исследованияу 5 доноров не было выявлено плазматических клеток (ПК), экспрессирующих белок mage-cl, у двух других были выявлены единичные ПК с экспрессией данного белка.
Результаты и обсуждение. В качестве порогового значения экспрессии гена MAGE-C1 принят показатель >0,06 (2ACt). У 8 (25%) больных документирован уровень экспрессии гена MAGE-C1 ниже порогового, у 24 (75%) определялось надпороговое значение экспрессии (0,08—9,44; 2ACt). При определении степени экспрессии белка mage-cl также были выделены 2 группы больных: с низким значением экспрессии (<5% от всех ПК, п=8) и надпорого-вой экспрессией (>5% от всех ПК, п=24). Кроме того, у 26 больных определена внутриклеточная локализация белка mage-cl: цитоплазматическая — в 24 об -разцах биоптатов и ядерно-цитоплазматическая ■— в 2 образцах (рис.). У больных с низкой экспрессией белка mage-cl медиана экспрессии гена MAGE-C1
приближалась к пороговому уровню, разброс значений от 0,002 до 0,97 (2ACt). При надпороговой экспрессии белка mage-cl медиана экспрессии гена MAGE-C1 достигала 0,53 (2ACt), разброс значений от 0,002 до 9,44 (2ACt), р<0,05.
Заключение. В рамках проведенного анализаудалось определить, что результаты двух методов сопоставимы. Для дальнейших исследований возможно использование более доступного в клинической практике метода ИГХ. Кроме того, ИГХ-метод позволяет определить внутриклеточную локализацию белка mage-cl, что указывает на целесообразность дальнейшего изучения, поскольку может рассматриваться в качестве дополнительного критерия опухолевой активности.
Макунина Э. А., Соловьев М. В., Фирсова М. В., Старцев А. А., Абакумова А. В., Мамаева Е. А., Хышова В. А., Гальцева И. В.,
Сурин В. Л., Менделеева Л. П.
ЗАВИСИМОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ОТВЕТА ОТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА MAGE-C1 У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. Предполагается, что патологическая экспрессия гена MAGE-Cl способствует выживанию аберрантных плазматических клеток, защищая их от лекарственного апоптоза, и может выступать в качестве перспективного маркера рефрактерности при множественной миеломе (ММ).
Цель работы. Определить экспрессию гена MAGE-C1 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) у больных ММ и оценить корреляцию экспрессии с клинико-лабораторными параметрами и ответом на терапию бортезомиб-содер-жащими курсами.
Материалы и методы. 85 больным ММ (38 мужчин, 47 женщин) в возрасте от 35 до 82 лет (медиана 58) с февраля 2019 г. по ноябрь 2021 г. были определены значения экспрессии гена MAGE-C1 методом ПЦР-РВ в образцах костного мозга, обогащенного CD138+ клетками. Диагностику ММ и оценку ответа после 6 курсов терапии трехкомпонент-ными схемами, включающими бортезо-миб, производили согласно критериям IMWG. Стадия по ISS определена как I у 25 (29,5%) больных, II У 29 (34%), III
у 31 (36,5%). Высокий цитогенетический риск документирован у 23 больных, костные плазмоцитомы — у 39, миеломная нефропа-тия ■—у 20. Медиана длительности наблюдения составила 11 мес. (4—30 мес.). В качестве контроля исследовались аналогичные кост-номозговые клетки 7 доноров, максимальное значение экспрессии MAGE-Cl у которых составило 0,06(2ACt). В зависимости
< 100
Î 10
0 <
1 1
î
£
s 0.1
s
0
1 0.01
s
« 0.001
X m
to.0001
0,04 (0,0004-2,69)
X
0,35 (0,0003-14,12)
«
О* *
v>V <v*V
Рис. 1. Корреляционная зависимость активности ЛДГ от экспрессии гена MAGE-C1, р=0,0001
