CC BY
7
DOI: 10.17650/1818-8346-2022-17-2-51-59
с-)]
Сопоставление экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 у первичных больных множественной миеломой
Э.А. Макунина, л.П. Менделеева, В.л. Сурин, М.В. Соловьев, М.В. Фирсова, А.М. ковригина, А.А. Шерстнев, И.В. Гальцева, Ю.О. давыдова, С.М. куликов
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России; Россия, 125167Москва, Новый Зыковский проезд, 4
Контакты: Элеонора Анатольевна Макунина Makunina.ea@yandex.ru
cv
CV
«V «V
CS
CV CV
Введение. В настоящее время гематология является динамично развивающейся наукой ввиду углубленного изучения молекулярных механизмов той или иной болезни. Благодаря лучшему пониманию биологии онкогематологи-ческих заболеваний удается синтезировать новые препараты с таргетным механизмом действия, что благоприятно см сказывается на лечении пациентов. В частности, при множественной миеломе после введения в клиническую я практику ингибиторов протеасом, иммуномодулирующих препаратов отмечено улучшение показателей общей выживаемости. Однако характеристика механизмов, ответственных за трансформацию нормальных плазматических q клеток в злокачественные, все также затруднена, в связи с чем изучение патобиологических основ множественной миеломы на сегодняшний день является актуальной задачей.
Цель исследования - оценить возможное влияние экспрессии гена MAGE-C1 и наличия белка mage-c1 у больных с впервые выявленной множественной миеломой на противоопухолевый ответ бортезомибсодержащей терапии. Материалы и методы. В проспективное исследование были включены 33 больных множественной миеломой. Диагноз устанавливали в соответствии с критериями Международной рабочей группы по изучению ММ (IMWG, 2014). У 32 больных индукционный этап терапии состоял из бортезомибсодержащих курсов, 1 больной в схемы 1-й линии был включен леналидомид. Всем больным в дебюте заболевания определяли экспрессию гена MAGE-C1 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени в плазматических клетках пунктата костного мозга и белка mage-c1, определенного иммуногистохимическим методом в трепанобиоптате костного мозга. В качестве контроля исследовали материал костного мозга здоровых доноров.
Результаты. При оценке статистической взаимосвязи экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 выявлено, что при низких значениях экспрессии гена MAGE-C1 не наблюдалось высокой экспрессии белка mage-c1. При этом высокая экспрессия исследуемого гена всегда ассоциировалась с экспрессией белка выше нормальных значений. Анализ, направленный на поиск взаимосвязи между детекцией гена MAGE-C1 и белка mage-c1 и степенью противоопухолевого ответа после 6 курсов индукционной терапии показал, что наличие высокой экспрессии изучаемых параметров ассоциировалось с худшим ответом на бортезомибсодержащее лечение.
Заключение. В рамках проведенного анализа удалось подтвердить, что результаты 2 методов сопоставимы. Одно-факторный анализ продемонстрировал, что у больных со сниженными показателями экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 достижение противоопухолевого ответа на бортезомибсодержащие схемы достоверно выше, в то время как высокая экспрессия сопровождается рефрактерностью к бортезомибу.
Ключевые слова: множественная миелома, ген MAGE-C1, белок mage-c1
BY 4.0
Для цитирования: Макунина Э.А., Менделеева Л.П., Сурин В.Л. и др. Сопоставление экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 у первичных больных множественной миеломой. Онкогематология 2022;17(2):51-9. DOI: 10.17650/ 1818-8346-2022-17-2-51-59.
MAGE-C1 gene and mage-c1 protein expression comparison in primary multiple myeloma patients
E.A. Makunina, L.P. Mendeleeva, V.L. Surin, M. V. Soloviev, M. V. Firsova, A.M. Kovrigina, A.A. Sherstnev, I. V. Gal'tseva, Yu.O. Davydova, S.M. Kulikov
National Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia; 4 Novyy Zykovskiy Proezd, Moscow 125167, Russia Contacts: Eleonora Anatol'evna Makunina Makunina.ea@yandex.ru
cv cv
сч сч
ев
cv cv
cv cv
Background. Nowadays, hematology is a dynamically developing science due to the in-depth study of the molecular mechanisms of a particular disease. A better understanding of oncohematological diseases biology makes it possible to synthesize new targeted drugs, which have a favorable therapeutic effect. In particular, in multiple myeloma, after the introduction of proteasome inhibitors and immunomodulatory drugs into clinical practice, an improvement in overall survival was observed. However, characteristics of the mechanisms of transformation normal plasma cells into malignant ones are still difficult; therefore, the study of the pathobiological basis of multiple myeloma is currently an urgent task.
The objective: to evaluate the possible influence of MAGE-C1 gene expression and the presence of mage-c1 protein in patients with newly diagnosed multiple myeloma on the anti-tumor response after bortezomib-containing therapy. Materials and methods. A prospective study included 33 multiple myeloma patients. The diagnosis was established according to International Myeloma Working Group criteria (IMWG, 2014). In 32 patients the induction therapy included bortezomib-containing courses, in one patient lenalidomide was included in the first-line regimens. The MAGE-C1 gene expression by real-time polymerase chain reaction and mage-c1 protein by immunohistochemistry in plasma cells bone marrow, were determined for all patients at the debut of multiple myeloma. As a control group was examined the bone marrow material of healthy donors.
Results. When assessment the statistical relationship between the expression of MAGE-C1 gene and mage-c1 protein, it was found that there was no high expression of mage-c1 protein at low values of MAGE-C1 gene expression. At the same time, high expression of the gene was always associated with protein expression above normal values. The analysis aimed at finding the relationship between MAGE-C1 gene and mage-c1 protein detection and the degree of antitumor response after 6 courses of induction therapy showed that high expression of the studied parameters was associated with a worse response to bortezomib-containing treatment.
Conclusion. We confirmed that the results of the two methods were comparable. Single factor analysis showed that patients with decreased MAGE-C1 gene and mage-c1 protein expression levels achieved a significantly higher antitumor response to bortezomib-containing regimens, while high expression was accompanied by refractoriness to bortezomib.
Key words: multiple myeloma, MAGE-C1 gene, mage-c1 protein
For citation: Makunina E.A., Mendeleeva L.P., Surin V.L. et al. MAGE-C1 gene and mage-c1 protein expression compa-
rison in primary multiple myeloma patients. Onkogematologiya DOI: 10.17650/1818-8346-2022-17-2-51-59.
Oncohematology 2022;17(2):51-9. (In Russ.)
Введение
Множественная миелома (ММ) — В-клеточная опухоль, характеризующаяся клональной экспансией неопластических плазматических клеток (ПК) в костном мозге [1]. За последние десятилетия, в эпоху развития молекулярной биологии, диагностика и лечение ММ претерпели значительные изменения, в первую очередь за счет расширения возможностей изучения генетических трансформаций в опухолевых клетках и изменений костномозгового микроокружения, способствующих росту опухоли [2, 3].
Каждый новый этап интерпретации этих молекулярных открытий способствовал модификации и пересмотру диагностических критериев, которые на данный момент позволяют провести более раннее распознавание ММ и начало специфической терапии до появления признаков органного поражения (так называемого CRAB-синдрома) [4, 5]. Помимо этого, более глубокое понимание гетерогенности заболевания привело к разработке новых терапевтических стратегий, направленных на повышение общей и безрецидивной выживаемости.
Несмотря на то что у большинства пациентов достигается противоопухолевый ответ на фоне современных методов терапии, включающих инновационные таргетные препараты, а также высокие дозы мелфала-на и аутологичную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК), ММ остается неизлечимым заболеванием с медианой 5-летней выжива-
емости не более 50 % [4]. В связи с этим сохраняется необходимость поиска критериев прогноза и мониторинга ответа на терапию, так как убедительно доказано, что глубина ответа на терапию является одним из наиболее важных факторов эффективности применяемых схем лечения [5].
Уникальная группа генов, кодирующих опухоле-воспецифичные раково-тестикулярные антигены (РТА), активно изучается в качестве новых маркеров возможной рефрактерности заболевания и мишеней для иммунотерапии при некоторых видах злокачественных заболеваний, в том числе при ММ. Интерес к изучению РТА возник в 90-е годы прошлого столетия после идентификации меланома-ассоциированного антигена mage-a1 (melanoma antigen gene family member A1). Последующий поиск новых иммуногенных опухолевоассоциированных антигенов позволил выявить более 250 РТА [6—8]. Экспрессия РТА опосредована регуляцией таких механизмов, как метилирование ДНК и ацетилирование гистонов. Вместе с тем при многих опухолевых заболеваниях возникает нарушение эпигенетической регуляции, что может приводить к де-метилированию промоутера и вызывать гиперэкспрессию РТА [7, 9, 10].
Гены, кодирующие РТА, демонстрируют крайне ограниченную экспрессию в соматических клетках нормальных тканей, экспрессия регистрируется только в клетках яичка и плацентарных клетках, в то же время патологическая экспрессия наблюдается
в опухолевых клетках при многих злокачественных заболеваниях [11].
При гематологических заболеваниях экспрессия РТА является редким событием, однако изучение РТА позволило выявить ряд антигенов, составивших исключение [12, 13]. Примером такого исключения стал mage-c1 (melanoma antigen gene family member С1), наиболее часто экспрессируемый в аберрантных ПК при ММ [6, 11, 12, 14—16]. Mage-c1 кодируется геном, расположенным на длинном плече Х-хромосомы в ло-кусе Xq26-Xq27.2 [9].
Большой интерес вызывают немногочисленные публикации, позволяющие предположить, что экспрессия РТА может оказаться прогностическим фактором, определяющим эффективность химиотерапев-тического воздействия, использоваться в качестве дополнительного маркера неблагоприятного течения заболевания и раннего предиктора рецидива или прогрессии ММ.
Цель исследования — оценить возможное влияние экспрессии гена MAGE-C1, измеренной методом по-лимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) в ПК пунктата костного мозга, и наличия белка mage-c1, определенного иммуногистохимичес-ким (ИГХ) методом в трепанобиоптате костного мозга у больных с впервые выявленной ММ, на противоопухолевый ответ бортезомибсодержащей терапии.
Материалы и методы
В исследование были включены 33 пациента (18 мужчин и 15 женщин) в возрасте от 35 до 68 лет (медиана 57 лет) с впервые диагностированной ММ, получавших лечение в НМИЦ гематологии в период с марта 2019 г. по август 2021 г.
Диагноз симптоматической ММ устанавливали в соответствии с критериями Международной рабочей группы по изучению ММ (IMWG, 2014) [17]. У 9 больных стадию по системе Durie—Salmon оценивали как I—II, у 24 — как III. По Международной системе ста-дирования (ISS) у 21 больного зарегистрирована I— II стадия, у 12 — III. В миелограмме содержание ПК варьировало от 5 до 89 % (медиана 23 %), секреция парапротеина составила 2,1—51,2 г/л, белок Бенс-Джонса в моче (от следовых значений до 7,7 г/сут) определялся у 22 (66,7 %) больных. Высокий цитоге-нетический риск (t(4;14)(p16;q32), del17p) был документирован у 10 (30,3 %) больных, костные плаз-моцитомы — у 15 (45,5 %), миеломная нефропатия — у 10 (30,3 %). Срок наблюдения составил 1—26 мес (медиана 18 мес).
У 32 больных индукционный этап терапии состоял из бортезомибсодержащих курсов, 1 больной в связи с симптомами полинейропатии в дебюте заболевания в схемы 1-й линии был включен леналидомид. Проведение 2-й линии терапии с включением леналидомид-содержащих схем потребовалось 5 больным, 1 больному выполнено 3 линии терапии, в том числе с использо-
ванием только химиотерапевтических препаратов. Количество индукционных курсов составило от 1 до 10 (медиана 7). До начала системной терапии 1 больному провели локальную лучевую терапию на область костной плазмоцитомы левой подвздошной кости в суммарной очаговой дозе 50 Гр. Противоопухолевый ответ оценивали по критериям IMWG-2016 после 6 борте-зомибсодержащих курсов индукционной терапии.
Исследование экспрессии гена MAGE-C1 в образцах костного мозга, обогащенного CD138+-клетками, выполнили всем 33 больным ММ. В качестве контроля исследовали аналогичные костномозговые клетки 7 здоровых доноров. Первый этап работы включал выделение популяции мононуклеаров из цельной костномозговой взвеси, в последующем подвергшихся высокоактивной магнитной сепарации и обогащению CD138+-клетками с использованием моноклональ-ного антитела к CD138 MicroBeads human (Miltenyi Biotec, Германия). Анализ чистоты выделения моно-нуклеаров, обогащенных CD138+-клетками, проводили с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II, Beckton (BD, США). Медиана содержания монону-клеаров, обогащенных CD138+-клетками, составила 73,2 %.
Тотальную РНК выделяли с помощью лизиса в гу-анидин-изотиоцианатном буфере с последующей экстракцией смесью фенол — хлороформ. Количество РНК оценивали на спектрофотометре по значению А260. Чистоту образца определяли по соотношению А260/А280 (в пределах 1,8-2,0).
Уровень экспрессии гена MAGE-C1 оценивали методом ПЦР-РВ (прибор CFX96 Real-Time System) по разнице (ДО;) между пороговыми циклами от продукта гена домашнего хозяйства GAPDH и продукта исследуемого гена.
В качестве матрицы для ПЦР-РВ использовали комплементарную ДНК, полученную после проведения обратной транскрипции. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды, использованные в работе, синтезировали в компании «Синтол». Прямой и обратный праймеры соответственно представлены последовательностями tga-ggg-aca-cat-aca-tcc-taa-aag-c и ttg-tct-tct-ggg-aac-ctt-gac-tc для исследуемого гена MAGE-C1 и ggt-gaa-ggt-cgg-agt-caa-cg и tgg-gtg-gaa-tca-tat-tgg-aac-a для контрольного гена домашнего хозяйства GAPDH. Флуоресцентные зонды: к гену MAGE-C1 — (FAM)-ac-tgc-ctg-ggc-ctc-ctc-tgc-tgt-(BHQ1), к гену GAPDH — (ROX)-ct-ctg-gta-aag-tgg-ata-ttg-ttg-cca-tca-(BHQ2).
Значения ДО больных ММ сравнивали с диапазоном до; доноров. Для интерпретации результатов ПЦР-РВ в образцах значения ДО; были переведены в разы (2да). Полученные цифры отражают уровень экспрессии гена MAGE-C1 относительно уровня экспрессии гена домашнего хозяйства, т. е. итоговое значение уровня экспрессии MAGE-C1 не является абсолютным показателем.
CV CV
«V «V
ев
cv cv
сч сч
cv cv
«V «V
CS
cv cv
«V «V
Исследование ИГХ-методом экспрессии белка mage-c1 костного мозга было выполнено 33 больным ММ с применением панели антител anti-MAGE-C1 (клон EPR18067, Abcam, Великобритания). В качестве положительного контрольного образца использовали биопсийный материал ткани яичка, в качестве отрицательного контроля — материал трепанобиоптатов 7 здоровых доноров. Просмотр гистологических препаратов костного мозга и ткани яичка осуществляли с помощью микроскопа Leica DM4000B.
Для анализа данных использовали классические методы описательной статистики, частотного анализа (анализа таблиц сопряженности), однофакторного дисперсионного анализа. Критический уровень значимости p принят равным 0,05. Расчеты проводили в статистических пакетах GraphPad Prism 9 и SAS 9.4.
Результаты
Среднее значение экспрессии гена MAGE-C1 у 7 здоровых доноров составило 0,01 ± 0,007 (2ACt), при разбросе данных от 0,0003 до 0,06 (2ACt). На основании результатов ПЦР-РВ определили максимально допустимое для здоровых доноров пороговое значение экспрессии исследуемого гена, которое составило 0,06 (2ACt). Разброс значений экспрессии гена MAGE-C1 у 33 больных ММ находился в диапазоне от 0,002 до 9,44 (2ACt).
В зависимости от уровня экспрессии гена MAGE-C1 в мононуклеарах костного мозга больных ММ было сформировано 3 группы. В 1-ю группу отнесены 8 пациентов с нормальными показателями экспрессии (<0,06 (2ACt)), во 2-ю группу — 15 больных со средним уровнем экспрессии (0,07—1,47 (2ACt)), в 3-ю группу — 10 пациентов с высоким уровнем экспрессии исследуемого гена (>1,48 (2ACt)).
При ИГХ-исследовании трепанобиоптатов у 5 здоровых доноров ПК, экспрессирующих белок mage-c1, не выявлено, у 2 обнаружены единичные ПК, экспрес-сирующие данный белок. ИГХ-исследование костного мозга больных ММ позволило определить процент ПК, экспрессирующих белок mage-c1 в каждом тре-панобиоптате. Диапазон детекции белка mage-c1 в ПК варьировал от минимальных значений (<5 % клеток) до окрашивания практически всех ПК (рис. 1).
В зависимости от количества ПК, экспрессирующих белок mage-c1, было сформировано также 3 группы больных: 1-ю группу составили 8 больных с минимальной экспрессией белка mage-c1 (<5 % клеток), соответствующей норме, 2-ю группу — 10 больных со средним показателем экспрессии (<50 % клеток), 3-ю группу — остальные 15 больных, у которых наблюдалась высокая экспрессия исследуемого белка (доля ПК, экспрессирующих белок mage-c1, превышала 50 %). У 26 больных удалось определить внутриклеточную локализацию белка mage-c1: цитоплазматическую — в 24 (92,3 %) образцах биоптатов и ядерно-цитоплаз-матическую — в 2 (7,7 %) образцах.
Сопоставление частоты экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 у больных ММ в дебюте заболевания показало практически одинаковые результаты (табл. 1). При оценке статистической взаимосвязи экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 методом многомерного частотного распределения выявлено, что при нормальных показателях экспрессии гена MAGE-C1, соответствующих таковым у доноров, не наблюдалось высокой экспрессии белка mage-c1. При этом высокая экспрессия исследуемого гена всегда ассоциировалась с экспрессией белка выше нормальных значений. Взвешенный коэффициент согласия Каппа равен 0,4 с доверительным интервалом 0,17—0,61 (стандартная ошибка 0,11) (р = 0,002). Особо существенным является выделение группы больных с высокой экспрессией белка mage-c1, поскольку группы с нормальной и средней экспрессией не показали значимых различий (табл. 2).
Таблица 1. Сопоставление частоты экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 у больных множественной миеломой в дебюте заболевания (n = 33), n (%)
Table 1. Comparison of MAGE-C1 gene and mage-c1 protein expression frequency in multiple myeloma patients at the disease debut (n = 33), n (%)
Уровень экспрессии Ген MAGE-C1 Белок mage-c1
MAGE-C1 gene Mage-c1 protein
Expression level
Нормальный Normal 8(24,2) 8 (24,2)
Средний Medium 15 (45,5) 10 (30,3)
Высокий High 10 (30,3) 15 (45,5)
У больных с нормальными показателями экспрессии белка mage-c1 в ПК среднее значение экспрессии гена MAGE-C1 составило 0,33 ± 0,14 (2да), у больных со средними показателями экспрессии белка mage-с1 — 0,62 ± 0,34 (2да), при высокой экспрессии белка mage-c1 - 2,63 ± 0,75 (2А°) (рис. 2).
Противоопухолевый ответ после 6 бортезомибсо-держащих курсов был оценен у 29 больных. Полный ответ (ПО) был достигнут у 5 больных, очень хороший частичный ответ (ОХЧО) — у 12, частичный ответ (ЧО) — у 8, резистентность опухоли констатирована в 4 случаях.
Проведен анализ, направленный на поиск взаимосвязи между детекцией экспрессии гена MAGE-C1 и степенью противоопухолевого ответа после 6 курсов индукционной терапии. У 100 % больных с нормальными значениями экспрессии (<0,06 (2да)) достигнут >ЧО, у больных с экспрессией 0,07—1,47 (2да) >ЧО получен в 92 % случаев, при высокой экспрессии >1,48 (2да) частота общего ответа была несколько ниже и составила 70 %. При этом достижение более глубокого ответа (ПО + ОХЧО) в группах с нормальным и средним
Рис. 1. Гистологическая и иммуногистохимическая картины костного мозга больного А. (а, в) и больного З. (б, г) (у-200): а, б (окраска гематоксилином и эозином) — диффузная инфильтрация плазматических клеток со зрелой морфологией; в (окраска антителом к mage-c1) — практически все клетки плазмоклеточного инфильтрата экспрессируют белок mage-c1 (цитоплазматическая реакция); г (окраска антителом к mage-c1) — среди диффузного плазмоклеточного инфильтрата единичные клетки экспрессируют белок mage-c1 (ядерно-цитоплазматическая реакция) Fig. 1. Histological and immunohistochemicalpictures of bone marrow of patient A. (a, в) and patient Z. (б, г) (у200): а, б (hematoxylin and eosin staining) — diffuse infiltration of plasma cells with mature morphology; в (staining with antibody to mage-c1) — almost all cells of plasma cell infiltrate express protein mage-c1 (cytoplasmic reaction); г (staining with antibody to mage-c1) — among diffuse plasma cell infiltrate single cells express protein mage-c1 (nuclear-cytoplasmic reaction)
Таблица 2. Таблица сопряженности для 2 методов исследования: полимеразной цепной реакции в реальном времени и иммуногистохимического (n = 33) (p = 0,002), n (%)
Table 2. Concordance for two methods: real-time polymerase chain reaction and immunohistochemistry (n = 33) (p = 0.002), n (%)
Уровень экспрессии белка mage-c1 (ИГХ-метод) Уровень экспрессии гена MAGE-C1 (метод ПЦР-РВ) Всего больных
Expression level of mage-c1 protein (IHC) нормальный средний normal medium высокий Total number of patients
Нормальный 4 (50) 4 (26,7) Normal 0 8
Средний 4 (50) 4 (26,7) Medium 2 (20) 10
Hgh™ 0 7 (46,6) 8 (80) 15
Всего больных 8 и q 33 Total number of patients
Примечание. ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в реальном времени; ИГХ — иммуногистохимический. Note. qPCR-RT — real-time polymerase chain reaction; IHC — immunohistochemistry.
cv cv
сч сч
ев
cv cv
cv cv
J2 .о
ГЧ Ps|
с g
é I
s fc
m и к ^
s с
№ с s
и S
х *==
Э
о
-1
-2
Нормальная (n = S) I Normal (n = S)
Высокая (n = 15) / High (n = 15)
Экспрессия белка mage-c1 / Mage-c1 protein expression
Средняя (n = 10) I Medium (n = 10)
Рис. 2. Значения экспрессии гена MAGE-C1 (методом полимеразной цепной реакции в реальном времени) у больных множественной миеломой в дебюте заболевания в зависимости от экспрессии белка mage-c1 (иммуногистохимическим методом)
Fig. 2. MAGE-C1 gene expression values (real-time polymerase chain reaction) in multiple myeloma patients at the disease onset as a function of mage-c1 protein expression (immunohistochemistry)
Таблица 3. Частота противоопухолевого ответа на бортезомибсодержащие курсы у больных множественной миеломой в завжимости от экспрессии гена MAGE-C1 в дебюте заболевания (n = 29)
Table 3. Frequency of antitumor response to bortezomib-containing courses in multiple myeloma patients as a function of MAGE-C1 gene expression at disease onset (n = 29)
Уровень экспрессии гена MAGF.-C1 Число больных с соответствующим уровнем экспресии гена MAGE-C1 Частота достижения противоопухолевого ответа
Frequency of achieving an antitumor response
MAGE-C1 gene expression level Number of patients with the corresponding level of MAGE-C1 gene expression ПО + ОХЧО + ЧО, n/N (%) ПО + ОХЧО, n/N (%) CK + H.IMK n/N (%)
Нормальный Normal 7 7/7 (100) 5/7 (71)
Средний Medium 12 11/12 (92) 9/12 (75)
Высокий High 10 7/10 (70) 3/10 (30)
Примечание. Здесь и в табл. 4: ПО — полный ответ; ОХЧО — очень хороший частичный ответ; ЧО — частичный ответ. Note. Here and in table 4: CR — complete response; VGPR — very good partial response; PR — partial response.
значениями экспрессии гена MAGE-C1 документировано в 71 и 75 % случаев, тогда как у больных с высокой экспрессией частота глубокого ответа снижалась больше чем в 2 раза и составила всего 30 % (р = 0,09) (табл. 3).
При оценке глубины противоопухолевого ответа было обнаружено, что у больных, достигших ПО + ОХЧО, показатели экспрессии гена МАЭЕ-С1 в дебюте были значительно ниже, чем у больных с рефрактерным течением ММ (р = 0,02). Медиана экспрессии гена МАЭЕ-С1 у 16 больных, достигших ПО + ОХЧО, составила 0,16 (0,002—4,45; 2да), у 8 больных, достиг-
ших ЧО, - 1,06 (0,002-4,08; 2да), у 4 больных с рефрактерным течением - 5,1 (0,09-9,44; 2да).
При оценке связи экспрессии белка mage-c1 с достижением противоопухолевого ответа наблюдалась аналогичная тенденция. У всех больных, у которых в гистологическом препарате костного мозга выявляли менее 50 % ПК, экспрессирующих белок mage-c1, был получен общий ответ (>ЧО). В то же время в случае выявления практически тотального окрашивания ПК антителом к mage-c1 почти у трети пациентов диагностировали рефрактерность к бортезомибу. При этом достижение более глубокого ответа (ПО + ОХЧО)
Таблица 4. Частота противоопухолевого ответа на бортезомибсодержащие курсы у больных множественной миеломой в зависимости от экспрессии белка mage-c1 (n = 29)
Table 4. Frequency of antitumor response to bortezomib-containing courses in multiple myeloma patients depending on mage-c1 protein expression (n = 29)
Ур
Число эк
(ей
cv cv
cv cv
cs
Уровень экспрессии белка mage-c1
Expression level of mage-c1 protein
Нормальный Normal
Средний Medium
Высокий High
Число больных с соответствующей экспрессией белка mage-c1
Number of patients with corresponding expression of mage-c1 protein
5 10
Частота достижения противоопухолевого ответа
Frequency of achieving an antitumor response
ПО + ОХЧО + ЧО, n/N (%) ПО + ОХЧО, n/N (%)
14
CR + VGPR + PR, n/N (%)
5/5 (100) 10/10 (100) 10/14 (71)
4/5 (80) 6/10 (60) 5/14(36)
I
также значительно чаще документировали у больных с низкой экспрессией белка mage-c1 по сравнению с больными, отнесенными к группе высокой экспрессии (р = 0,08) (табл. 4).
Обсуждение
В опубликованных исследованиях экспрессия гена, кодирующего mage-c1, при ММ определяется в 5788,7 % случаев, может быть выявлена как в дебюте, так и в рецидиве заболевания. При ИГХ-исследовании белка mage-c1 в ПК определяется цитоплазматическая или ядерная реакция, а также возможен смешанный характер окрашивания [8-10, 14, 18-22].
В результате проведенного нами исследования наличие повышенной экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 выявлено у 76 % больных, что сопоставимо с данными других авторов. У 26 (78,8 %) больных, включенных в наше исследование, удалось определить внутриклеточную локализацию белка mage-c1: цито-плазматическую — у 24 и ядерно-цитоплазматичес-кую — у 2 больных.
Кроме этого, при изучении экспрессии гена MAGE-C1 и белка mage-c1 выявлена сопоставимость результатов использованных методов ПЦР-РВ и ИГХ. Таким образом, выбранные нами методы можно рассматривать как взаимозаменяемые и применять ИГХ трепанобио-птатов костного мозга в случае низкой клеточности пунктата костного мозга, что может составлять трудности для выполнения ПЦР-РВ.
M. Tinguely и соавт. представили данные о статистически достоверной корреляции повышенной про-лиферативной активности ПК со степенью экспрессии белка mage-c1 ИГХ-методом. При ядерной и смешанной формах экспрессии этого белка был документирован наиболее высокий пролиферативный индекс. Одновременно авторы обнаружили статистически значимую разницу показателей общей выживаемости в зависимости от локализации белка. У больных с ци-топлазматической локализацией mage-c1 отмечалась более высокая общая выживаемость, в отличие от пациентов, в ПК трепанобиоптатов костного мозга
которых выявлялось смешанное или внутриядерное окрашивание (медианы общей выживаемости 48 и 33 мес соответственно) [22].
В других публикациях также было обращено внимание на наличие прямой взаимосвязи между индексом пролиферативной активности и экспрессией белка mage-c1, что позволяло предположить согласованность между экспрессией этого белка и нарушением регуляции клеточного цикла. Авторы обсуждали гипотезу, что наличие экспрессии белка mage-c1 способствует выживанию аберрантных ПК, защищая их как от спонтанного, так и от лекарственного апоптоза [10, 14, 18, 19, 22, 23].
D. Atanackovic и соавт. изучали экспрессию гена MAGE-C1 и 3 других генов, кодирующих РТА, у больных ММ после индукционного этапа терапии, после ауто-ТГСК, а также после аллогенной трансплантации костного мозга (алло-ТКМ). У всех больных после индукционного этапа выявлялась экспрессия генов, кодирующих РТА, после выполненной ауто-ТГСК экспрессия сохранялась в 77 % случаев, в то время как после проведения алло-ТКМ — лишь у 40 % больных. При этом экспрессия гена MAGE-C1 стойко сохранялась в ПК, изменению подвергались только показатели данной экспрессии. Проанализировав результаты исследования экспрессии гена MAGE-C1 у больных после алло-ТКМ, авторы выявили, что при высоких показателях экспрессии резко снижалась частота достижения ПО и возрастал риск развития иммунохи-мического рецидива заболевания. При этом у части больных повышение уровня экспрессии гена MAGE-C1 опережало появление нарушений в стандартных лабораторных показателях, что позволяло расценивать изменения экспрессии гена в качестве предиктора последующего рецидива заболевания [18]. Аналогичные результаты были представлены и в исследовании E.M. Tyler и соавт. [19].
Кроме этого, D. Atanackovic и соавт. обратили внимание, что у 75 % больных с высоким уровнем экспрессии гена MAGE-C1 развитие рецидива было документировано в среднем в течение 14 мес после
CV CV
CV CV
cv cv
сч сч
es
алло-ТКМ. Среди больных с отсутствием экспрессии этого гена рецидив был констатирован только в 7 % случаев в течение 41 мес (р <0,001) [18].
Целью нашего исследования было определение экспрессии гена МЛЭЕ-С1 и белка mage-c1 в дебюте заболевания. Результаты работы позволили оценить связь экспрессии гена и белка с риском формирования резистентности опухоли. Низкие параметры экспрессии гена МЛЭЕ-С1 и белка mage-c1 ассоциировались с более высокой вероятностью достижения глубокого противоопухолевого ответа.
Полученные нами данные диктуют необходимость дальнейших исследований в этом направлении в целях поиска возможных предикторов, помогающих опре-
делить адекватную тактику терапии уже на этапе индукции.
Заключение
Несмотря на активное изучение генов, кодирующих РТА, результаты проведенных исследований не позволяют однозначно ответить на вопрос о биологической роли гена MAGE-C1 как в зародышевой линии, так и в опухолевых клетках. Дальнейшее исследование этих антигенов ставит перед собой задачу определить, являются ли они побочным продуктом клеточной трансформации или же их экспрессия представляет собой индикатор участия гена МЛЭЕ-С1 в молекулярном патогенезе ММ.
CV CV
«V «V
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Kryukov F., Nemec P., Radova L. et al. Centrosome associated genes pattern for risk sub-stratification in multiple myeloma. J Transl Med 2016;14(1):150. DOI: 10.1186/s12967-016-0906-9.
2. Prideaux S.M., Conway O'Brien E., Chevassut T.J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv Hematol 2014;2014:864058.
DOI: 10.1155/2014/864058.
3. Morgan G.J., Walker B.A., Davies F.E. The genetic architecture of multiple myeloma. Nat Rev Cancer 2012;12(5):335-48.
DOI: 10.1038/nrc3257.
4. Landgren O., Iskander K. Modern multiple myeloma therapy: deep, sustained treatment response and good clinical outcomes. J Intern Med 2017;281(4):365-82. DOI: 10.1111/joim.12590.
5. Cavo M., Rajkumar S.V., Palumbo A. et al. International Myeloma Working Group consensus approach to the treatment
of multiple myeloma patients who are candidates for autologous stem cell transplantation. Blood 2011;117(23):6063—73. DOI: 10.1182/blood-2011-02-297325.
6. Shires K., van Wyk T. The role of cancer/ testis antigens in multiple myeloma pathogenesis and their application
in disease monitoring and therapy. Crit Rev Oncol Hematol 2018;132:17-26. DOI: 10.1016/j.critrevonc.2018.09.010.
7. Simpson A.J.G. Caballero O.L., Jungbluth A. et al. Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. Nat Rev Cancer 2005;5(8):615-25.
DOI: 10.1038/nrc1669.
8. Zhang Y., Bao L., Lu J. et al. The clinical value of the quantitative detection of four cancer-testis antigen genes in multiple myeloma. Mol Cancer 2014;13(1):25. DOI: 10.1186/1476-4598-13-25.
9. De Carvalho F., Vettore A.L.,
Colleoni G.W.B. Cancer/testis antigen MAGE-C1/CT7: new target for multiple myeloma therapy. Clin Develop Immunol 2012;2012:257695. DOI: 10.1155/2012/257695.
10. De Carvalho F., Alves V.L.F., Braga W.M.T. et al. MAGE-C1/CT7 and MAGE-C2/CT10 are frequently expressed in multiple myeloma and can be explored in combined immunotherapy for this malignancy. Cancer Immunol Immunother 2013;62(1):191—5.
DOI: 10.1007/s00262-012-1376-4.
11. Andrade V.C.C., Vettore A.L., Felix R.S. et al. Prognostic impact of cancer/testis antigen expression in advanced stage multiple myeloma patients. Cancer Immun 2008;8:2.
12. Scanlan M.J., Andrew J.G., Old L.J. The cancer/testis genes: review, standardization, and commentary. Cancer Immun 2004;4(1):1.
13. Lim S.H., Austin S., Owen-Jones E. et al. Expression of testicular genes
in haematological malignancies. Br J Cancer 1999;81(7):1162-4. DOI: 10.1038/sj.bjc.6690824.
14. Jungbluth A.A., Ely S., Di Liberto M. et al. The cancer-testis antigens CT7 (MAGE-C1) and MAGE-A3/6 are commonly expressed in multiple myeloma and correlate with plasma-cell proliferation. Blood 2005;106(1):167-74. DOI: 10.1182/blood-2004-12-4931.
15. Wienand K., Shires K. The use of MAGE C1 and flow cytometry to determine
the malignant cell type in multiple myeloma. PloS One 2015;10(3):e0120734. DOI: 10.1371/journal.pone.0120734.
16. He L., Ji J., Liu S. et al. Expression of cancer-testis antigen in multiple myeloma. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 2014;34(2):181-5.
DOI: 10.1007/s11596-014-1255-7.
17. Rajkumar S.V., Dimopoulos M.A., Palumbo A. et al. International Myeloma Working Group updated criteria
for the diagnosis of multiple myeloma Lancet Oncol 2014;15(12):e538-48. DOI: 10.1016/S1470-2045(14)70442-5.
18. Atanackovic D., Luetkens T., Hildebrandt Y. et al. Longitudinal analysis and prognostic effect of cancer-testis antigen expression in multiple myeloma. Clin Cancer Res 2009;15(4):1343-52. DOI: 10.1158/1078-0432.ccr-08-098.9.
19. Tyler E.M., Jungbluth A.A., Gnjatic S. et al. Cancer-testis antigen 7 expression and immune responses following allogeneic stem cell transplantation
for multiple myeloma. Cancer Immunol
Res 2014;2(6):547-58.
DOI: 10.1158/2326-6066.cir-13-0174.
20. Condomines M., Hose D., Raynaud P. et al. Cancer/testis genes in multiple myeloma: expression patterns and prognosis value determined by microarray analysis. J Immunol 2007;178(5):3307-15. DOI: 10.4049/jimmunol.178.5.3307.
21. Van Duin M., Broyl A., de Knegt Y. et al. Cancer testis antigens in newly diagnosed and relapse multiple myeloma: prognostic markers and potential targets for immunotherapy. Haematologica 2011;96(11):1662-9. DOI: 10.3324/haematol.2010.037978.
22. Tinguely M., Jenni B., Knights A. et al. MAGE-C1/CT-7 expression in plasma cell myeloma: sub-cellular localization impacts on clinical outcome. Cancer Sci 2008;99(4):720-5.
DOI: 10.1111/1.1349-7006.2008.00738.
23. De Carvalho F., Costa E.T., Camargo A.A. et al. Targeting MAGE-C1/CT7 expression increases cell sensitivity
to the proteasome inhibitor bortezomib in multiple myeloma cell lines. PloS One 2011;6(11):e27707. DOI: 10.1371/journal.pone.0027707.
Вклад авторов £ Э.А. Макунина: набор больных в исследование, выполнение лабораторной части исследования (полимеразная цепная реакция в реальном
времени), обзор публикаций по теме статьи, анализ полученных данных, написание текста рукописи; ®
Л.П. Менделеева: разработка научной идеи и дизайна исследования, анализ полученных данных, редактирование рукописи, утверждение ^
статьи; «V
CV CV
ев
B.Л. Сурин: организация и участие в лабораторной части исследования (полимеразная цепная реакция в реальном времени); М.В. Соловьев, М.В. Фирсова: выполнение диагностических и лечебных мероприятий у больных, включенных в исследование, мониторинг течения болезни и ответа на проведенное лечение;
А.М. Ковригина, А.А. Шерстнев: выполнение гистологического и иммуногистохимического исследования, участие в анализе результатов; И.В. Гальцева: разработка дизайна исследования, организация и выполнение лабораторной части исследования (иммунофенотипирование); Ю.О. Давыдова: выполнение лабораторной части исследования (иммунофенотипирование);
C.М. Куликов: статистическая обработка данных, редактирование рукописи.
Authors' contributions ^
E.A. Makunina: accruing of patients in the study, laboratory part of the study (real-time polymerase chain reaction), review of publications on the article's ® topic, analysis of the data obtained, article writing; s
L.P. Mendeleeva: development of the scientific idea and design of the study, analysis of the data obtained, editing and approval of the article; О
V.L. Surin: organization and participation in the laboratory part of the study (real-time polymerase chain reaction);
M.V. Soloviev, M.V. Firsova: diagnostic and therapeutic measures in the patients included in the study, monitoring of the disease and treatment response; e
A.M. Kovrigina, A.A. Sherstnev: histological and immunohistochemistry studies, participation in the analysis of the results; _
I.V. Gal'tseva: research design development, organization and performance of the laboratory part of the study (immunophenotyping); r-
Yu.O. Davydova: laboratory part of the study (immunophenotyping);
S.M. Kulikov: statistical analysis, article editing. о
ORCID авторов / ORCID of authors «V
Э.А. Макунина / E.A. Makunina: https://orcid.org/0000-0001-6736-064X 2
Л.П. Менделеева / L.P. Mendeleeva: https://orcid.org/0000-0002-4966-8146 «V
B.Л. Сурин / V.L. Surin: https://orcid.org/0000-0002-1890-4492 iv М.В. Соловьев / M.V. Soloviev: https://orcid.org/0000-0002-7944-6202
М.В. Фирсова / M.V. Firsova: https://orcid.org/0000-0003-4142-171X s
А.М. Ковригина / A.M. Kovrigina: https://orcid.org/0000-0002-1082-8659 «-
А.А. Шерстнев / A.A. Sherstnev: https://orcid.org/0000-0002-1597-4591 ^
И.В. Гальцева / I.V. Gal'tseva: https://orcid.org/0000-0002-8490-6066 О Ю.О. Давыдова / Yu.O. Davydova: https://orcid.org/0000-0001-5932-0285
C.М. Куликов / S.M. Kulikov: https://orcid.org/0000-0002-6288-7570 ^
ш
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. x
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. в
Financing. The study was performed without external funding.
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «Национальный
медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России.
Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Compliance with patient rights and principles of bioethics.The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of National Research
Center for Hematology, Ministry of Health of Russia.
All patients gave written informed consent to participate in the study
Статья поступила: 18.01.2022. Принята к публикации: 28.02.2022. Article submitted: 18.01.2022. Accepted for publication: 28.02.2022.
