CC BY
15
УДК 547.518
СИНТЕЗ И БИОТЕСТИРОВАНИЕ КОНЪЮГАТОВ БЕНЗИМИДАЗОЛА С АДАМАНТАНОМ
Е.В. Нуриева, А.А. Белоглазкина, Д.В. Шишов, В.В. Гоголь, Я.С. Глазкова, Б. Вобит*, Н.С. Зефиров**, С.А. Кузнецов , О.Н. Зефирова
(кафедра органической химии; e-mail: olgaz@org.chem.msu.ru)
В работе представлен синтез 2-адамантил-6-[(1#-бензимидазол-1-илкарбонил)амино]-гексаноата и 2-адамантил-7-(1#-бензимидазол-1-ил)-7-оксо-гептаноата и результаты их тестирования на цитотоксичность по отношению к клеткам карциномы легких человека А549. Показана невозможность присоединения 5-(2-адамантилоксикарбонил)пентилизо-цианата к нокодазолу в разных условиях.
Ключевые слова: бензимидазол, колхицин, нокодазол, тубулин, цитотоксичность.
В ходе исследований необычных «гибридных» аналогов противоопухолевого препарата колхицина [1, 2] нами получены его конъюгаты с адамантаном (рис. 1, структуры 1а и 1б) с очень высокой цито-токсичностью по отношению к клеткам карциномы легких А549 (ЕС50=5-6 нМ) и не описанным ранее в литературе механизмом действия на клеточный белок тубулин [2]. В данной работе с целью проверки универсальности обнаруженного механизма мы попытались заменить колхициновый фрагмент остатком нокодазола (рис. 2, 3), молекула которого обладает колхициноподобной активностью.
Сравнение расположения молекул колхицина и нокодазола в области связывания с тубулином, выполненное на основе данных работы [3], показывает, что наиболее удобной позицией присоединения линкера с адамантаном является атом азота имидазольного цикла нокодазола, близко расположенный к атому азота амидной группы колхицина (рис. 2).
Анализ литературы свидетельствует о том, что оптимальным в препаративном плане методом модификации атома азота имидазольного фрагмента ноко-
Рис. 2. Расположение молекул колхицина и нокодазола в области связывания колхицина с тубулином (атомы азота показаны черным цветом)
Рис. 1. Структура конъюгатов 1а и 1б (колхициновый фрагмент выделен темным цветом)
Рис. 3. Структуры предложенных конъюгатов 2а и 2б (темным выделен фрагмент нокодазола).
дазола является реакция с легко доступными изоциа-натами, протекающая с высокими выходами [4-7]. На основании этих данных для синтетической реализации нами были предложены коньюгаты 2а,б (рис. 3).
Для синтеза целевых соединений 2а и 2б в реакцию с дифенилазидофосфатом [8] (схема 1) ввели исходные моноэфиры 3а и 3б (полученные ранее взаи-
*Институт биологических наук, клеточной биологии и технологии биологических систем Ростокского университета, Росток,
Германия; **МГУ и Институт физиологически активных веществ Российской Академии наук.
модействием адамантанола и полиангидрида соответствующей дикарбоновой кислоты в присутствии DMAP [2]).
В результате были синтезированы соответствующие изоцианаты 4a и 4б (схема 1). В спектре ЯМР
13
С вещества 4а наблюдали смещение сигнала изо-цианатного атома углерода в область сильного поля ~128 м.д. по сравнению с таковым для карбоновой кислоты ~179 м.д.
Далее мы показали, что реакция изоцианата 4a с модельным соединением (бензимидазолом) протекает при комнатной температуре с высоким выходом (схема 1). В спектре ЯМР 1Н продукта 5 присутствует пик протона амидной группы при 6.74 м.д., а в
13
спектре ЯМР С - сигнал атома углерода мочевин-ного фрагмента в области 149.92 м.д. Данные ИК-спектроскопии и элементного анализа также подтверждают строение соединения 5.
Попытки проведения аналогичной реакции с нокодазолом не увенчались успехом: независимо от вариаций температуры и растворителя (СН2С12, ДМСО и др.) из реакционной смеси были выделены только исходные вещества. Отметим, что к такому же результату привели и попытки ^ацилирования нокодазола с помощью хлорангидрида кислоты 3а (полученного по стандартной методике реакцией с SOCl2 в присутствии Е1^), а также с помощью самой кислоты 3а как в системе DCC/DMAP, так и в присутствии 2-этокси-Ы-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина (EEDQ). При этом аналогичный последнему варианту процесс с бензимидазолом (схема 2) протекает гладко и приводит к соединению
6 с выходом 97% (характеристики этого вещества см. в экспериментальной части).
Полученные в работе конъюгаты 5 и 6 были протестированы на противоопухолевую активность по отношению к клеткам А549 в стандартном колориметрическом тесте с использованием красителя 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-2#-тетразолил-бромида (МТТ) по методике [9]. Это исследование показало резкое падение цитотоксичности соединений 5 и 6 (EC50>10 цМ) по сравнению с соединениями-лидерами 1а и 1б. Возможность синтеза конъюгатов 2а и 2б или их аналогов с более высокой цитотоксич-ностью в настоящее время изучается.
Экспериментальная часть
Контроль хода реакций и чистоты веществ осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol-UV254. Хроматографическое разделение проводили на колонках с силикагелем Acros
1 13
(40-60 мкм). Спектры ЯМР H и C регистрировали в растворе CDCl3 при комнатной температуре на спектрометре «Bruker Avance 400» фирмы «Varian» с рабочей частотой соответственно 400 и 100 МГц. Химические сдвиги приведены в шкале 8 (м.д.) относительно остаточного сигнала растворителя при 7.28 и 77.0 м.д. Элементный анализ выполняли на CHN-анализаторе «Vario micro cube». ИК-спектры регистрировали в пластинах с KBr на спектрофотометре «IR-200» («ThermoNicolet»).
5-(2-Адамантилоксикарбонил)пентилизоциа-нат (4a). Смесь моноэфира дикарбоновой кислоты 3a (0,111 г; 0,38 ммоль), триэтиламина (0,060 мл;
С х е м а 1
он
(ООС -(ŒL) - СО)
VCH2,"-n*C:
о
4 а п = 5 (97%) 46 п = 6(95%)
■ О
Сг
,N NH
из 4а
нокодазол
О (СН0)И ОН Y " " Y (Ph0)2P(0)N3, Et3N O n
. s CH.Ph
За n = 5 3
36 /î = 6
О (CH9)5 ^ JL
Y NH ^
О
k
2a,б
5 (86%)
С х е м а 2
0,43 ммоль) и ^О)2Р(О^3 (0,098 мл, 0,45 ммоль) в 10 мл толуола нагревали в течение 8 ч при 80°С. Растворитель упаривали при пониженном давлении, остаток хроматографировали (элюент: этилацетат -петролейный эфир (40-70°С), 1:15). Получено 0,108 г соединения 4а (выход 97%) в виде бесцветной маслянистой жидкости, В 0,68. Спектр ЯМР1Н: 1.41-1.48 м (2Н), 1.56-1.59 м (2Н, НАа), 1.67 м (4Н), 1.75-1.79 м (4Н, НАа), 1.85-1.87 (4Н, НАа), 1.99-2.02 м (4Н, НАа), 2.37 т (2Н, ./=7.2 Гц, СНСО2), 3.32 т (2Н, 3 = 6.7 Гц, СН-^СО), 4.93 м (1Н, Н ) Спектр ЯМР 13С: 24.50, 26.10, 26.98, 27.23, 30.79, 31.79, 31.97, 34.61, 36.32, 37.37, 42.79 (СН-^СО), 76.90 (С2-Аа), 128.27 (ЧСО), 172.82 (С=о). Спектр ИК (см-1): 1256, 1421,1452, 1720 (С=О), 2277 ^СО), 2929, 3054.
6-(2-Адамантилоксикарбонил)гексилизоциа-нат (4б) синтезировали аналогично соединению 4а из кислоты 3б (0,150 г; 0,49 ммоль), триэтилами-на (0,074 мл, 0,56 ммоль) и ^О)2Р(О^3 (0,115 мл; 0,53 ммоль). Получено 0,142 г изоцианата 4б (выход 95%) в виде бесцветной маслянистой жидкости, ^ 0.70. Спектр ЯМР ХН: 1.34-1.42 м (2Н); 1.53-1.57 м (2Н, НАа); 1.59-1.69 м (6Н); 1.72-1.77 м (4Н, НАа), 1.82-1.85 (4Н, НАа); 1.97-2.01 м (4Н, НАа); 2.33 т (2Н, 3 = 7.2 Гц, СН2СО2); 3.28 т (2Н, 3 = 6.7 Гц, СН-^СО); 4.91 м (1Н, Н2-Аа). Спектр ИК (см-1): 1264, 1420, 1448, 1723 (С=О), 2270 ^СО), 2900-3050 (уш. с).
2-Адамантил-6-[(1Н -бензимидаз ол-1-илкарбонил)амино]гексаноат (5). Смесь изоцианата 4а (0,100 г; 0,34 ммоль) и бензимидазола (0,057 г; 0,48 ммоль) в 5 мл хлористого метилена перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали, остаток хроматографировали (элюент: этилацетат - петролейный эфир (40-70°С), 1:7). Получено 0,12 г соединения 4а (выход 86%) в виде бесцветной маслянистой жидкости. Спектр ЯМР *Н: 1.43-1.50 м (2Н), 1.52-1.55 м (2Н, НАЙ), 1.69-1.75 м (8Н, НСШ+НАа), 1.80-1.83 м (4Н, НАа), 1.96-1.99 м (4Н, НАа), 2.38 т (2Н, /=7.1 Гц, СН2СО2), 3.53 дд (2Н, 3 = 6.9, 5.8 Гц, СЩЧНСО), 4.91 м (1Н, Н2-Аа), 6.74 уш. с (1Н, N№1, 7.33-7.42 м (2Н, Н5,6-Аг), 7.78 д (1Н,
J = 8.0 Гц, H4-Ar), 7.96 д (1H, J = 8.0 Гц, H'-Ar), 8.51 с (1H, H2-Ar). Спектр ЯМР 13С: 24.13, 25.97, 26.71, 26.6, 28.67, 31.53, 31.66, 34.30, 36.05, 37.09, 42.48 (CH2N-
-<2-Ad\ 2
-7-Ar\
CO), 76.54 (С ), 113.43, 120.22, 123.80, 124.83, 131.36 (C7a-Ar), 140.49 (C2-Ar), 143.57 (C3a-Ar), 149.92 (N-C=O), 173.20 (C=O). Спектр ИК (см-1): 966, 985,
1043, 1101, 1215, 1255, 1290, 1319, 1340, 1452, 1477, 152, 1543, 1610, 1726 (С=О), 2856, 2910, 2927, 3059, 3109. Элементный анализ. Найдено (%): С (70,44), Н (7,68), N (10,19). С24Н31^О3. Вычислено (%): С (70,39), Н (7,63), N (10,26).
2-Адамантил-7-(1Н-бензимидазол-1-ил)-7-оксо-гептаноат (6). Раствор кислоты 3а (0,021 г; 0,071 ммоль), бензимидазола (0,010 г; 0,085 ммоль) и EEDQ (0,021 г; 0,085 ммоль) в 5 мл СН2С12 перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали, остаток хроматографировали (элюент: этилацетат - петролейный эфир (40-70°С), 1:4, затем хлористый метилен - метанол, 1:20). Получено 0,027 г соединения 6 (выход 97%) в виде бесцветной маслянистой жидкости. Спектр ЯМР 1Н: 1.48-1.61 м (4Н), 1.701.81 м (6Н), 1.83 м (4Н), 1.89-1.95 м (2Н), 1.95-2.04 м (4Н, НАа), 2.40 т (2Н, 3 = 7,4 Гц, СН2СО2), 3.03 т (2Н, 3 = 7,3 Гц, СН2СОЩ 4.94 м (1Н, Н2-А\ 737-7.46 м (2Н, Н56-Аг), 7.81 дд (1Н, 3 = 7.4, 1.1 Гц, Н4-Аг), 8.25 д (1Н, 3 = 7.1 Гц, Н'-Аг), 8,41 с (1Н, Н - ). Элементный анализ.
Найдено (%): С (73,12), H (7,64), N (7,18). C24H30N2O3. Вычислено (%): С (73,07), H (7,66), N (7,10).
MTT-тест на цитотоксичность
Клетки карциномы легких человека А549 высаживали в плашки с 96 ячейками (на ячейку 30006000 клеток в 200 цл культуральной среды DMEM с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота). Затем клетки обрабатывали 24 ч растворами веществ 5 или 6 в ДМСО в интервале концентраций 0,005-10,000 цМ или колхицином в концентрации 0,001-0,300 цМ в качестве положительного контроля (8 ячеек для каждого значения концентрации). Раствор MTT 5 мг/мл готовили в фосфатно-солевом буфере и фильтровали через 0,22 мм фильтр. За 2 ч до окончания выдержки тестируемого соединения в каждую ячейку добавляли 20 цл стерильного раствора MTT так, чтобы конечная концентрация составила 0,45 мг/мл. После удаления клеточной среды в каждую ячейку добавляли 100 цл лизирующего раствора (ДМСО, содержащий 10% додецилсульфата натрия и 0,6% уксусной кислоты). Образовавшиеся кристаллы формазана солюбилизировали тщательным перемешиванием на качалке. Оптическую плотность измеряли при 590 нм с референсным фильтром 690 нм на приборе «EL808 Ultra Microplate Reader»
(«Bio-Tek Instruments», США). Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда Александра Гумбольдта (3.4-Fokoop-Rus/1015567) и РФФИ (проекты № 12-03-00720_а и № 11-03-12088_офи-м).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zefirova O.N., Nurieva E.V., Lemcke H., Ivanov A.A., Shishov D.V., Weiss D.G., Kuznetsov S.A., Zefirov N.S. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. 18. P. 5091.
2. Zefirova O.N., Nurieva E.V., Shishov D.V., Baskin I.I., Fuchs F., Lemcke H., Weiss D.G., Schröder F., Zefirov N.S., Kuznetsov S.A. // Bioorg. Med. Chem. 2011. 19. P. 5529.
3. Nguyen T.L., McGrath C., Hermone A.R., Burnett J.C., Zaha-revitz D.W., Day B.W., Wipf P., Hamel E, Gussio R. // J. Med. Chem. 2005. 48. P. 6107.
4. Пилюгин В. С., Михайлюк А. Н., Косарева В. М., Валитов Р. Б., Киселева Г. В., Кузнецова С. Л. // ЖОХ. 2003. 73. C. 1367. (англ. Pilyugin VS., Mikhailyuk A.N.,
Kosareva V.M., Valitov R.B., Kiseleva G.V., Kuznetsova S.L. // Russ. J. Gen. Chem. 2003. 73. P. 1293).
5. Hernandez-Luis F., Hernandez-Campos А., Yepez-Mulia L., Cedillo R., Castillo R. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. 11. P. 1359.
6. Chassaing C., Berger M., Heckeroth A., Ilg T., Jaeger M., Kern C., Schmid, K., Uphoff M. // J. Med. Chem. 2008. 51. P. 1111.
7. Ross S. T., Kruse L. I., Kingsbury W. D., ErhardK. F., Harrsch P. B. // Eur. J. Med. Chem. 1989. 24. P. 363.
8. Cremlyn R. J. W. // Aust. J. Chem. 1973. 26. P. 1591.
9. Mosmann T. // J. Immunol. Methods. 1983. 65. P. 55.
Поступила в редакцию 13.09.12
SYNTHESIS AND BIOTESTS OF BENZIMIDAZOLE CONJUGATE WITH ADAMANTANE
E.V. Nurieva, A.A. Beloglazkyna, D.V. Shishov, V.V. Gogol, Y.S. Glazkova, B. Wobith, N.S. Zefirov, S.A. Kuznetsov, O.N. Zefirova
(Division of Organic Chemistry)
The synthesis of 2-adamantyl-6-[(1,ff-benzimidazole-1-ylcarbonyl)amino]hexanoate and 2-adamantyl-7-(benzimidazole-1-yl)-7-oxo-heptanoate and the results of their testing for cytotoxicity against human lung carcinoma cells A549 are presented in the paper. The impossibility of 5-(2-adamantyloxycarbonyl)pentylisocyanate addition to nocodazole under various conditions is demonstrated.
Key words: benzimidazole, colchicine, nocodazole, tubulin, cytotoxicity.
Сведения об авторах: Нуриева Евгения Владимировна - науч. сотр. кафедры органической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (E.Selunina@org.chem.msu.ru); Белоглазкина Анастасия Александровна — студентка химического факультета МГУ (anastas-beloglaz@mail.ru); Шишов Дмитрий Вениаминович — аспирант химического факультета МГУ (shishov_d@mail.ru); Гоголь Владимир Владимирович — студент химического факультета МГУ (Vl. gogol@gmail.com); Глазкова Яна Сергеевна - студентка химического факультета МГУ (janglaz@bk.ru); Биргит Вобит - ассистент Института биологических наук, клеточной биологии и технологии биологических систем Ростокского университета, Германия (birgit.wobith@uni-rostock.de); Зефиров Николай Серафимович - зав. кафедрой органической химии химического факультета МГУ, профессор Института физиологически активных веществ РАН, докт. хим. наук, акад. РАН (zefirov@org.chem.msu.ru); Кузнецов Сергей Анатольевич - доцент Института биологических наук, клеточной биологии и технологии биологических систем Ростокского университета, Германия, докт. биол. наук (sergei.kuznetsov@uni-rostock.de); Зефирова Ольга Николаевна - доцент кафедры органической химии химического факультета МГУ, ст. науч. сотр. Института физиологически активных веществ РАН, докт. хим. наук (olgaz@org.chem.msu.ru).
