РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГії ОДЕРЖАННЯ ЛіКУВАЛЬНО-ДіАГНОСТИЧНОї СИРОВАТКИ ПРОТИ ВіРУСУ КАЛіЦИВіРОЗУ КОТіВ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:616.98:636.8

Б01: 10.15587/2313-8416.2017.97681

РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГИ ОДЕРЖАННЯ Л1КУВАЛЬНО-Д1АГНОСТИЧНО1 СИРОВАТКИ ПРОТИ В1РУСУ КАЛ1ЦИВ1Р ОЗУ КОТ1В

© Т. Г. Козленко, В. В. Недосеков, О. Г. Мартинюк

Розроблено ефективну схему ¡мунгзацИ для отримання гтергмунног сировотки проти вгрусу калщивгрозу кот1в. Антиген вводили комбтовано тдшюрно та внутрШньом'язово з одночасним застосуванням 1му-ностимулюючого препарату «1мунофан».

Проведено видтення глобултовог фракцП б1лк1в шляхом висалювання сгрчанокислим амошем. Одержуали фракцю чистих 1муноглобул1н1в G, що у два рази вище питомог ваги 1муноглобул1н1в вих1дно '1 сироватки Ключовi слова: ¡муноглобулгни, ггпергмунна сировотка, вгрус, антиген, антитша, калщивгроз котгв, гло-бул1н, лгкування

ВЕТЕ РИНАРН1 НАУКИ

1. Вступ

Враховуючи важливють використання високо-ефективних засобiв дiагностики калiцивiрозу, науко-вий i практичний штерес представляе розробка способу отримання високоактивного та специфiчного антигену калiцивiрусу. Останнш буде викоритстаний для iмунiзацii тварин-донорiв з метою одержання п-перiмунних протикалiцивiрусних сироваток. Вони будуть корисш для виготовлення лiкувальних та дiа-гностичних препаратiв для серологiчних реакцш.

Препарати внутрiшньосудинних iмуноглобу-лiнiв, яш одержують iз плазми донорiв, сьогодш стали одними iз основних продукпв на свiтовому ринку завдяки 1'хньому успiшному застосуванню для профь лактики i лiкування багатьох шфекцшних, ауггамун-них i запальних захворювань. У дослщженш розгля-даються процеси виробництва гiперiмунноi сировотки та видшення з неi специфiчних iмуноглобулiнiв, в контекстi 1'хньо1' вартостi i виходу цiльового продукту, який мае бути високо1' якостi, а також безпечним.

2. Лiтературний огляд

Бшьштсть iмунологiчних методiв дослiдження передбачають застосування iмунних сироваток, оде-ржуваних з кровi тварин, iмунiзованих рiзними антигенами, при цьому актившсть останнiх iстотно впли-вае на результати дослвдження [1, 2].

Для отримання сироваток необхвдно пiдiбрати рацюнальну схему iмунiзацii тварин. Пiд цим розу-мiють перш за все так фактори, як фiзико-хiмiчний склад антигену, доза, способи, штервали i кратнiсть введення антигену, загальну тривалють циклу iмунi-зацii, застосування ад'юванпв та iмуномодуляторiв. Загальновiдома залежнiсть антитшоутворення вiд до-зи антигену, що вводиться твариш. Рiвень iмунноi вь

дповiдi органiзму залежить вщ дози антигену, який буде введений, оскшьки занадто велика доза може викликати iмунне виснаження органiзму, а замала -недостатне iмунне подразнення, що приводить до зниження ти^в антитiл. При введеннi великих доз антигену утворюються антитша з низьким ступенем афiнiтету i 1'х синтез тривае протягом довгого часу. Зменшуючи дозу, можна пiдiбрати таку, яка буде ш-дукувати синтез високоафшних антитiл [3, 4].

Результати вивчення залежностi антитшоутво-рення вiд кратносп введення антигену сввдчать про очевидну перевагу багаторазово1' iмунiзацii перед одноразовою. 1нтервали мiж iн'екцiями iмуногену роз-раховуються емпiричним шляхом, причому результати дослiдiв зазвичай можуть бути використанi лише стосовно конкретного препарату. Простежуеться за-лежнiсть мiж способом введення антитену i рiвнем антитiл в сироватцi кровi тварин. Основними причинами цього е швидшсть, з якою антиген поширюеть-ся ввд мiсця iн'екцii, i ймовiрнiсть його проходження через лiмфатичнi вузли та iншi органи iмунноi систе-ми [1, 5].

Встановлено, що о^м шляху введення та тд-бору ад'ювантiв, застосування рiзноманiтних iмуно-модулюючих препаратiв забезпечуе тдвищення бю-логiчноi активностi антигену та iмунного статусу тварин- продуцентiв гiперiмунних сироваток кровi. Вченi успiшно використовували у своему дослвджен-нi iмуностимулюючi препарати, одним з яких був ко-лощний розчин полiпренiлфосфату iз хво1' ялицi («Фоспренш»). Встановлено, що останнш тдвищуе природну резистентнiсть оргашзму, стимулюе про-дукцiю iнтерферону, штерлейшшв (1Л-1, 1Л-2), фактору некрозу пухлин (ФНП), активнiсть природних кiллерiв i фагоцитоз [5].

Використання iмуномодулятора «Тимал^» сприяе значному пiдвищенню титрiв специфiчних сировоткових антитш за рахунок зростання числа ан-титiлопродукуючих клiтин в результатi стимуляци функци макрофагiв i хелперних Т-клтгин. «Циклофо-сфан», який е класичним iмуносупресором, також ак-тивуе макрофаги, стимулюючи фагоцитарну, цитото-ксичну i супресивну (в вiдношеннi головним чином Т-лшфоципв) функци [6].

Позетивнi результата отримаш при викорис-таннi iмунокоректора «1мунофану» синтетичного ге-ксопептиду, який впливае на зростання титру i три-валiсть циркуляци специфiчних антитш [7, 8].

У дослщженш [9], одна i та ж шнцева мета може бути досягнута рiзними шляхами, але в будь-якому випадку, схема iмунiзацil, пропонована для виробництва, повинна вiдповiдати певним вимогам. Головною з вимог е - можливють отримання сирова-ток з досить високим титром специфiчних антитш за порiвняно короткий промiжок часу при мшмальних затратах антигенного й шшого матерiалу.

Враховуючи вище викладене, науковий i прак-тичний штерес дослiджень представляе розробка способу отримання високоактивного та специфiчного антигену калiцивiрусу.

3. Мета та задачi дослвдження

Мета дослiдження - отримання високоактив-них, специфiчних гiперiмунних сировоток проти вь русу калiцивiрозу котiв.

Для досягнення мети були поставленi наступ-нi задачi:

а) розробити рацюнальну схему гiперiмунiзацil тварин, що включае пiдбiр тварин-донорiв, антигену, його дози, способу, штервалу та кратностi введення, загально! тривалостi циклу iмунiзацil, застосування ад'ювантiв й iмуностимуляторiв.

б) Видшити iмуноглобулiни класу G з одержа-них сироваток кровi тварин-продуцентiв шляхом ви-дiлення глобулшово1 фракцп.

4. Матерiали та методи досл1джень

Як продуценпв сироваток кровi були викорис-танi кролi. Антигеном при проведенш гiперiмунiзацil служив iзолят К-2, накопичений в культурi клiтин CrFK з актившстю 8,5 ЦПД50/см3. Антиген був очищений ввд клiтинного детриту шляхом низькошвид-кiсного центрифугування суспензп (6000 об/хв., впродовж 30 хв); осаджений i концентрований сульфатом амонш, в подальшому очищений з викорис-танням градiентiв концентраци сахарози та шактиво-ваний формалiном у концентраци 0,2 % за темпера-тури 37 °С i експозицп 72 години.

У cxeMi rinepiMym3aqii використовували 12 дорослих кролiв, обох статей породи "Шиншила" масою 2,5-3,0 кг, з яких було сформовано групи по тварини у кожнш.

Тваринам першо! групи антиген вводили внут-ршшрно в 5 точок по 0,1 см3. Тваринам друго! групи антиген вводили внутршньом'язово по 0,5 см3. Тваринам третьо! групи антиген вводили комбшовано: шдшшрно по 0,5 см3 та внутршньом'язово по 0,5 см3 на 1-й та 21-й день. Тваринам четверто! групи вводили мжрофшьтрат незаражено! культури клiтин (контрольна група).

Також тваринам вводили iмyностимyлятор 1мунофан у дозi 0,2 см3 пвдшшрно у кожному циклi iмyнiзaцil.

Серолопчна оцiнкa ефективностi гшерiмyнiзi-ци проводилась в РН, яку ставили за загальноприй-нятою методикою проти 100 ЦПД 50/см3 КВК [10].

З метою одержання очищених iмyноглобyлiнiв класу G з одержаних сироваток кровi кролiв провели видiлення глобулшово1 фракцп. Для цього з одержаних гiперiмyнних сироваток кровi кролiв видели за-гальну фрaкцiю глобyлiнiв шляхом висолювання ср-чанокислим aмонieм за 40 % насиченосп та гель-проникною хромaтогрaфieю на yльтрaгелi АсА-34 та одержували фракцш iмyноелектрофоретичних чис-тих iмyноглобyлiнiв G.

Для роздшення фрaкцiй сyспензiю глобyлiнiв вносили в колонку з ультрагелем АсА-34, зрiвновa-женням 0,01-0,02 М ФСБ, рН 7,2-7,4. Шдготовку, упаковку колонки та гельф№трацш проводили згвд-но настанови виробника (Pharmacia, Iтaлiя). Фракцш iмyноглобyлiнiв ввдбирали окремо, а дaлi осаджували сульфатом амонш при нaсиченнi до 40 %, при експозицп з останшм впродовж 30 хвилин за температури 4 °С, з наступним центрифугуванням при 2 тис. об/хв. впродовж 30 хвилин. Вщ солей сульфату амонш су-спензш одержаних iмyноглобyлiнiв очищали шляхом дiaлiзy проти 0,01 М ФСБ, рН 7,2-7,4, впродовж 12 годин.

Кшьшсне визначення бiлкa проводили за методом Лоург

5. Результата дослiджень та ix обговорення

Пiсля апробаци розроблено! схеми гiперiмyнi-заци (табл. 1) визначали титри aнтитiл до вiрyсy ка-лiцивiрозy на 14-ту та 28-му добу дослщу за допомо-гою реакци нейтрaлiзaцil.

В результата дослiджень aнтитiлa вже були ви-явленi на 14-у добу за внутршньошшрного введення антигену та у тварин, iмyнiзовaних комбiновaно вну-тршньошшрно та внyтрiшньом'язово, титр aнтитiл складав 6,0 log2 та 7,5 log2, вiдповiдно (табл. 2).

Таблиця 1

Схема отримання rinepiMyHHOi сироватки KpoBi проти Bipycy калiцивiрозу на кролях, n=7

Доба Доза, cnoci6 i кратшсть введення

I II III

1 0.1 мл в 5 точок в/ш 0,5 мл в/м 0,5 мл п/ш+0,5 мл в/м

7 0.1 мл в 5 точок в/ш 0,5 мл в/м -

14 0.1 мл в 5 точок в/ш 0,5 мл в/м -

21 0.1 мл в 5 точок в/ш 0,5 мл в/м 0,5 мл п/ш+0,5 мл в/м

Таблиця 2

Динамiка накопичення антитш проти калiцивiрусу в результатi iMyrn3a^i тварин групоспецифiчним антигеном __вiрyсy кaлiцивiрозy, n=3_

Доба iMym3a^T Титр антитш (log2)

I II III

14 6,0±0,8 5,8±0,8 7,5±0,7

28 8,9±0,6 7,6±0,7 9,5±0,7

Максимальш титри антитiл виявляли тсля че-тверто! iмунiзацii на 28-му добу у тварин першо! i третьо! груп 8.9 log2 та 9,5 вiдповiдно. У тварин друго! групи, яким антиген вводили внутрш-ньом'язево, титр антитiл був найнижчий i складав 5,8-7,6 log2.

Сироватки кровi тварин контрольно! групи були негативними (рис. 1).

Й.У 1 7,6 7,5 Уп J 1

6 5.8 1 1

1 1

I група II груоа III група

в 14 день и 28 день

Рис. 1. Динамжа зростання титру антитш

Таким чином, застосування в схемi гiперiмунi-зацii iмуностимулюючого препарату «1мунофан» у комплексi з культуральним антигеном дало змогу отримати гiперiмунну сироватку кровi з високим титром антитш до вiрусу калiцивiрозу.

Отже, проведенi дослiдження на кроликах дають можливiсть констатувати, що вони е оптима-льними тваринами-донорами для одержання сироватки, якi забезпечують високий рiвень антитiл, простоту проведення та технолопчшсть процесу одержання.

Також доведено, що комбшоване внутршньо-шкiрне i внутрiшньом'язове введення антигену тва-ринам-продуцентам забезпечуе кращий ефект при отриманш гiперiмунноi сироватки проти калiцивiру-су, н1ж застосування одного з них. Внутршньошшр-не введення антигенного препарату значно зменшуе об'ем використаного iмуногену та скорочуе термiн гiперiмунiзацii.

В цшому була розроблена технолог1я одержання гiперiмунноi сироватки проти вiрусу калщивь розу, яка полягала у комбшованш iмунiзацii кролiв шляхом введення антигену внутршньошшрно та внутрiшньом'язoво, що дозволило отримати гшерь мунну сироватку з титром антитш 9,5±0,7 log2.

З метою одержання очищених iмуноглобулiнiв класу G з одержаних сироваток кровi кролiв провели видiлення глобулшово! фракцп.

У результатi проведених експериментiв була розроблена методика видшення та очищення iмуног-лобулiнiв, принцип яко! включае наступнi етапи:

- центрифугування сироватки при 2 тис. об/хв. впродовж 20-30 хв.;

- дворазове переосадження сульфатом амонш 40 % насиченим, при цьому щоразу осад видаляли центрифугуванням. Пiсля третього висалювання, ро-зчиняли фосфатним буфером рН в об'ем^ що складае 10-25 % вихшного об'ему сироватки.

У фракц1ях, що одержанi з гiперiмунних сироваток шляхом осадження сульфатом амонш та гель-проникною хроматографiею визначали загальний бь лок за Лоурi та специфiчнi iмуноглобулiни в реакцп нейтралiзацii з наступним розрахунком питомо! ак-тивностi антитiл в 1 мг бшку.

У фракци загальних iмуноглобулiнiв, одержаних пiсля преципiтацii з специфiчною сироваткою арчано-кислим амошем насиченим до 40 % з наступною гель проникною хроматографiею на ультрагел1 АсА-34, пи-тома вага iмуноглобулiнiв на 1 мг бшкового розчину була вдшч вищою у порiвняннi з вихвдною сироваткою.

6. Висновки

1. Була розроблена рацiональна схема гшершу-тзацп тварин що включае комбшовану схему, що поля-гае у внутршньошюрному та внутршньом'язовому введент антигену, з штервалом м1ж шушзащями 7 дiб. Застосування у схемi шуностимулюючого препарату «1мунофан», який забезпечуе стабiльне одержання ви-сокоактивних сироваток кровi крол1в проти вiрусу каль цивiрозу з акгивнiстю в РН вщ 6,0 log2 до 9,5^2, як1 можуть бути застосованi як з дагностичною так i л1ку-вальною метою.

2. Розроблена технолопя видiлення iмуногло-булiнiв класу G з одержаних сивороток шляхом пре-ципiтацii сiрчанокислим амонiем та гельпроникаю-чою хроматографiею. Встановлено, що питома акти-внiсть очищених препаратiв у два рази вище питомо! ваги iмуноглобулiнiв вихiдноi сироватки, що мае ва-жливе значення для вдосконалення технологи одержання iмуноглобулiнiв для виробництва дiагностич-них та лшувальних препаратiв.

Лiтература

1. Алиева, Е. В. Опыт получения иммунных сывороток для производства диагностических препаратов [Текст] / Е. В. Алиева, И. С. Тюменцева, Е. Н. Афанасьев, М. П. Лаврешин, Н. Е. Афанасьев, Е. А. Горобец и др. // Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". - 2008. - № 1. - С. 11-15.

2. Рахманина, М. М. Калицивирусная инфекция кошек: биологические свойства возбудителя, эпизоотология, специфические средства и методы профилактики [Текст]: автореф. дис. ... д-ра вет. наук / М. М. Рахманина. - М., 2005. - 47 с.

3. Пронин, А. В. Полипренилфосфаты как адъюванты, поляризующие иммунный ответ в сторону Th1 [Текст] /

A. В. Пронин, С. В. Ожерелков, А. В. Деева, А. В. Санин, А. Н. Наровлянский // Инфекция и иммунитет. - 2012. - № 3. -С. 645-650.

4. Poulet, H. Immunisation with a combination of two complementary feline calicivirus strains induces a broad cross-protection against heterologous challenges [Text] / H. Poulet, S. Brunet, V. Leroy, G. Chappuis // Veterinary Microbiology. -2005. - Vol. 106, Issue 1-2. - Р. 17-31. doi: 10.1016/j.vetmic.2004.12.010

5. Мазур, Н. В. Розробка способу отримання aнтирaбiчноl гiперiмyнноl сироватки кровi вщ кролiв [Текст] / Н. В. Ма-зур, В. В. Недосеков, С. А. Ничик, I. М. Полупан // Ветеринарна бютехнолопя. - 2016. - № 28. - С. 158-163.

6. Addie, D. Ability of antibodies to two new caliciviral vaccine strains to neutralise feline calicivirus isolates from the UK [Text] / D. Addie, H. Poulet, M. C. Golder, M. McDonald, S. Brunet, J. C. Thibault, M. J. Hosie // Veterinary Record. - 2008. -Vol. 163, Issue 12. - Р. 355-357. doi: 10.1136/vr.163.12.355

7. Козленко, Т. Г. Оптимiзaцiя методiв очистки та шактиваци збудника кaлiцивiрозy котш [Текст] / Т. Г. Козленко,

B. В. Недосеков // Вюник Полтав^ю^ державна аграрн^ академи. - 2016. - № 4. - С. 92-94.

8. Radford, A. D. The challenge for the next generation of feline calicivirus vaccines [Text] / A. D. Radford, S. Dawson, K. P. Coyne, C. J. Porter, R. M. Gaskell // Veterinary Microbiology. - 2006. - Vol. 117, Issue 1. - Р. 8-14. doi: 10.1016/ j.vetmic.2006.04.004

9. Волков, Г. Л. Технология получения иммуноглобулинов и технологические аспекты очистки [Текст] / Г. Л. Волков // Украшський бiохiмiчний журнал. - 2006. - Т. 78, № 3. - С. 88-98.

10. Ашмарин, И. П. Статистические методы в микробиологических исследованиях [Текст] / И. П. Ашмарин, А. А. Воробьев. - Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

Дата надходження рукопису 14.02.2017

Козленко Тетяна Tpra^piBHa, астрант, кафедра етзоотологи та оргашзаци ветеринарнл справи, Нацюнальний ушверситет бюресурсш i природокористування Украши, вул. Герогв Оборони, 15, м. Кшв, Украша, 03041 E-mail: tatiana188981@gmail.com

Недосеков В^алш Володимирович, доктор ветеринарних наук, професор, кафедра етзоотологи та оргашзаци ветеринарии справи, Нацюнальний ушверситет бюресурсш i природокористування Украши, вул. Герои Оборони, 15, м. Кшв, Украша, 03041 E-mail: nedosekov1@rambler.ru

Мартинюк Олександр Григорович, кандидат ветеринарних наук, доцент, кафедра етзоотологи та оргашзаци вете-ринaрноl справи, Нацюнальний ушверситет бюресурав i природокористування Украши, вул. Герои Оборони, 15, м. Кшв, Украша, 03041 E-mail: sandr70@gmail.com