Використання ІФА для виявлення специфічних антитіл до пастерельозу, викликаного p. haemolytica Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:616.98:579.843.95-07:57.083.3

Мазур Т.В., д.вет.н., Ткаченко В.В., астрант, Чумак Р.М., д.б.н.,

Мартиненко Д.Л., к.вет.н., Рибальченко Д.Ю., астрант © Нацюнальний аграрный утеерситет, м. Киге

ВИКОРИСТАННЯ 1ФА ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ СПЕЦИФ1ЧНИХ АНТИТ1Л ДО ПАСТЕРЕЛЬОЗУ, ВИКЛИКАНОГО P.HAEMOLYTICA

Предстаелеш дат щодо еикористання ¡муноферментного анал1зу (1ФА) для еияелення специфгчних антиты до бактерп Pasteurella haemolytica

Ключовi слова: пастерельоз, Pasteurella haemolytica, ¡муноферментний анал1з (1ФА).

Вступ. Значну роль у виникненш та розвитку рестраторних хвороб тварин вдаграе бактерiальна мжрофлора, яка за певних умов може стати i першопричиною хвороби. В етюлогп рестраторних захворювань молодняку одне i3 провiдних мiсць займають пастерельози, якi завдають тваринництву значних економiчних збиткiв, що складаються iз загибелi тварин, вимушеного забою та зниження приросив i затрат на лжування [1, 2, 3, 4, 5].

В остант роки пастерельозна iнфекцiя у тваринництвi дещо змшила сво! класичнi риси i тому, здавалося б, уже вирiшенi проблеми !! дiагностики i профiлактики знову набувають актуальностi [2, 6].

1нструкщя «Про заходи з профiлактики та лжвщаци пастерельозу» передбачае проведення комплексно! дiагностики пастерельозу з обов'язковим лабораторним тдтвердженням, що потребуе значних затрат часу. При цьому важливим е розробка та використання серолопчних методiв дiагностики, основаних на щентифжаци та типуванш збудника. Широко! популярностi, остантм часом, набувае метод iмуноферментного ан^зу . Висока чутливiсть та специфiчнiсть 1ФА сприяли значному його поширенню як в гуманнiй, так i ветеринарнiй медицинi [3, 6, 7].

Враховуючи, що в Укра!нi не придшялась надежна увага вивченню ролi гемолiтично! пастерели в розвитку патологи с.-г. тварин, а дiагностика i типування даного збудника i дос викликають певнi труднощi, метою нашо¥ роботи було проведення апробацi! методу 1ФА для виявлення специфiчних антитш у ВРХ та кролiв при пастерельозi зумовленому Pasteurella haemolytica.

Матер1ал i методи. Для проведення дослщжень було сформовано 4 групи тварин:

1. клмчно здоровi кролi вiком вщ шести до десяти мiсяцiв;

2. кролi вiком вiд шести до десяти мюящв гiперiмунiзованi антигеном Pasteurella haemolytica;

3. ВРХ - клмчно здоровi тварини, вжом вiд дванадцяти до вiсiмнадцяти мiсяцiв;

4. ВРХ - тварини з ознаками рестраторно! патологi!.

© Мазур Т.В., Ткаченко В.В., Чумак Р.М., Мартиненко Д.Л., Рибальченко Д.Ю., 2008

140

У кожнш грут було по 8 тварин. Вщ уЫх дослщних тварин брали кров та отримували сироватку для подальших дослщжень. Усi дослiднi тварини до початку дослщу не були iмунiзованi проти пастерельозу.

Отримання антигену: шактивовану в автоклавi суспензiю бактерiальних кл^ин Р. haemolytica, осаджували центрифугуванням при 4000 оберив на хвилину та ресуспендували осад у фiзрозчинi i обробляли ультразвуком на льодовiй баш при 22000 Н впродовж 10 хвилин.

В матерiал вносили водонасичений фенол у стввщношенш 1:1 i повторно центрифугували (30 хвилин) при 3000 об/хв. Верхню водну фазу вщбирали i додавали до не! 2 об'еми етанолу. Матерiал витримували протягом 12 годин для формування осаду. Центрифугуванням (30 хвилин при 6000 об/хв.) вщдшяли осад i розчиняли у невеликому об'eмi 0,01 М карбонатного буферного розчину, рН 9,2. Отриманий матерiал застосовували в якост антигену при проведеннi 1ФА.

Проведення 1ФА: в лунки планшету вносили 100 розчину для розведення сироваток i 10 антитiл зразкiв дослiджуваних сироваток. Антитша, специфiчнi до Pasteurella haemolytica, зв'язували з антигеном на твердiй фаз^ утворюючи комплекси антиген-антитiло. Утворенi комплекси виявляли за допомогою кон'югату бшок g - пероксидаза. Пiсля вщмивання незв'язаних компонентiв у лунки додавали розчин проявника - субстрат пероксидази (ТМБ) та вимiрювали оптичну густину сумiшi в лунках, яка при довжиш хвилi 450 нм пропорцшна концентраци специфiчних антитiл у зразках сироватки. Зчитування результат здiйснювали за допомогою багатоканального фотометра.

Граничне значення оптично! густини складало у кролiв 0.046 та -0.069 у велико! рогато! худоби.

Результати дослщження.

Як видно iз таблицi № 1, при дослщженш сироваток кровi вiд клмчно здорових кролiв методом 1ФА в уЫх 8 випадках було одержано негативний результат. Тобто концентращя антитш в кровi клiнiчно здорових кролiв була низькою, що е свщченням вiдсутностi зараження !х даним збудником.

У зразках сироватки кровi вщ 8 кролiв, гiперiмунiзованих антигеном Pasteurella haemolytica, концентацiя антитiл була досить високою, тобто дослiдження методом 1ФА встановлено позитивний результат. Оптична густина антитш у вЫх тварин була досить високою i вiдповiдала показникам вщ 2,006 до 0,929.

В той же час дослщження сироваток кровi ВРХ (клшчно здорових тварин) методом 1ФА дало суперечливi результати: у шести сироватках результат був негативним, тобто концентращя антитш була недостатньою; два зразки, навпаки, показали позитивну реакщю. Показник оптично! густини (ОГ) антитш до Pasteurella haemolytica в цих сироватках становив 0,684 та 0,703 вщповщно. Це дозволяе зробити припущення, що тварини, вiд яких були отримаш цi зразки сироватки, були пастерелоноЫями, а такий стан

141

iмунологiчно! рiвноваги у взаемоди мiж мжро- та макрооргашзмом не сприяв клiнiчному прояву хвороби.

Результати дослщжень сироваток кров^ отриманих вщ ВРХ з ознаками рестраторно! патологi!, продемонстрували, що лише у двох зразках сироватки титр антитш до Pasteurella haemolytica був низьким. Тодi, як у шести шших сироватках кровi показник ОГ навпаки був високим i досягав рiвня 0,156 -0,581, що може свщчити про важливу роль Pasteurella haemolytica в проявi респiраторно! патологи у цих тварин.

Таблиця 1.

Результати дослщжень сироваток кровi вщ крол1в та ВРХ методом 1ФА на

наявнiсть специфнчних антитш до Pasteurella haemolytica

КлЫчно здоровi кролi Кролi гiперiмунiзованi Pasteurella haemolytica ВРХ - клЫчно здоровi тварини ВРХ - тварини з ознаками рестраторно! патологи

ОГ ОГ ОГ ОГ

0.036 нег. 1.015 поз. 0.080 нег. 0.239 поз.

0.027 нег. 0.929 поз. 0.684 поз. 0.581 поз.

0.035 нег. 1.513 поз. 0.069 нег. 0.030 нег.

0.059 нег. 2.006 поз. 0.061 нег. 0.380 поз.

0.054 нег. 1.089 поз. 0.051 нег. 0.156 поз.

0.038 нег. 1.395 поз. 0.051 нег. 0.227 поз.

0.050 нег. 1.740 поз. 0.703 поз. 0.046 нег.

0.037 нег. 1.163 поз. 0.067 нег. 0.382 поз.

ОГ - оптична густина

Висновок. Таким чином, результатами проведених дослщжень встановлено, що iмуноферментний аналiз е придатним методом виявлення антитш до збудника Pasteurella haemolytica. Застосування 1ФА е перспективним для проведення загального скринiнгу поголiв'я тварин на наявнiсть антитiл до бактери Pasteurella haemolytica.

Лiтература

1. Лях Ю.Г., Крот Л.А., Роль животных пастереллоносителей в поддержании респираторной патологии у свиней и крупного рогатого скота // Ветеринарна медицина. Мiжвiдомчий тематичний науковий збiрник. - Харюв, 2005. - Вип. 85. - С.183-186.

2. Заболотная В.П., Сосницкий А.И. Пастереллы - как один из возбудителей ассоциативных инфекций (Особенности культивирования пастерел) // Материалы научной сесии Россельхозакадемии. - М.: Россельхозакадемия, 1999. - Т.1 - С. 240-241.

3. Геведзе В.И. Пастереллез крупного рогатого скота. - Минск: Ураджай, 1989. - 135 с.

142

4. Распространение гемолитических маннгеймий среди клинически здоровых овец в Норвегии / Поуелсон Л.Л., Рейнерт Т.М., Сенд Р.Л. и др.// Российский ветеринарный журнал. - 2007. - №3. - С. 25.

5. In situ expression of intercellular adhesion molecule - 1 (ICAM - 1) mRNA in calves with acute Pasteurella haemolytica pneumonia / Radi Z.A., Register K.B., Lee E.K. et al.// Veter. Pathol.. - 1999. - Vol.36,N 5.-P. 437-444.

6. Значение тестов на гемолитическую активность и образование индола для внутривидовой дифференциации пастерелл // Семиотрочев В.Л., Безрукова Л.С., Степанов В.М., Мартиневский И.Л. Значение тестов на гемолитическую активность и образование индола для внутривидовой дифференциации пастерелл // Сборник трудов «Вопросы генетики, молекулярной биологии и микробиологии чумы и холеры». - Саратов, 1985. - С. 69-71.

7. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. - М.: Высш. Шк., 1991. - 288 с.

Summary

The presented is given in relation to the use of ELISA for the exposure of specific antibodies to the bacterium Pasteurella haemolytica

Key words: pasterellosis, Pasteurella of haemolytica, ELISA

Стаття надшшла до редакцИ 19.09.2008

143