CC BY
14
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro HamoHaibHoro ymBepcnreTy BeTepHHapHoi' MegnuUHH
Ta 6i0TexH0iroriH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7741
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 606:577.2/.3: 616-091.3
TT« • •• • •
Подготовка компонентш селективно1 поверхн1 трансдюсера шунного б1осенсора для шдикацй Pseudomonas aeruginosa
У cmammi представлено результати до^джень щодо отримання специфiчних KounoHeHmie тдготовки селективноi поверхн трансдюсера iмуннoгo бюсенсора для подальшого розроблення iмунoбioсeнсoрнoi тест-системи для експрес-тдикацй бактерш Pseudomonas aeruginosа з метою ii детекцп в бioлoгiчнoму маmeрiалi та в об'ектах довтлля. Авторами було отримано сneцифiчнi антисироватки та жуноглобулти до P. aeruginosa. Отримат компоненти модифжацн поверхт було протестовано на актившсть та сneцифiчнiсmь за допомогою аналтичного приладу туносенсора на oснoвi поверхне-вого плазмонного резонансу «Плазмон-6». На трансдюсернш поверхн iмуннoгo бioсeнсoра iммoбiлiзували сneцифiчнi антитипа, що взаeмoдiяли з клтинними антигенами, в рeзульmаmi чого реестрували зсув величини резонансного кута. З вiдгу-ку шуносенсора видно, що дiагнoсmична система працюе iз концентращею IgG 1 мг/мл, робочий титр 1:7 в полтональних антиттх проти P. aeruginosa. Отриман сneцифiчнi антисироватки та iмунoглoбулiни можуть бути використат, як компоненти тдготовки селективно1 поверхн трансдюсера iмуннoгo бюсенсора.
Ключовi слова: бактерй, тест-система, iмунoглoбулiн, сneцифiчнi сироватки
Подготовка компонентов селективной поверхности трансдюсера имунного биосенсора для индикации Pseudomonas aeruginosa
В статье представлены результаты исследований по получению специфических компонентов подготовки селективной поверхности трансдюсера иммунного биосенсора для дальнейшей разработки имунобиосенсорнои тест-системы для экспресс-индикации бактерий Pseudomonas aeruginosа с целью ее детекции в биологическом материале и в объектах окружающей среды. Авторами было получено специфические антисыворотки и иммуноглобулины к P. aeruginosa. Полученные компоненты модификации поверхности были протестированы на активность и специфичность с помощью аналитического прибора иммуносенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса «Плазмон-6». На трансдюсерной поверхности иммунного биосенсора иммобилизовали специфические антитела, которые взаимодействовали с клеточными антигенами, в результате чего регистрировали смещение величины резонансного угла. Исходя из отклика иммуносенсора видно, что диагностическая система работает с концентрацией IgG 1 мг/мл, рабочий титр 1:7 в поликлональных антителах против P. aeruginosa. Полученные специфические антисыворотки и иммуноглобулины могут быть использованы, как компоненты подготовки селективной поверхности трансдюсера иммунного биосенсора.
Ключевые слова: бактерии, тест-система, иммуноглобулин, специфические сыворотки.
Citation:
Novgorodova, O.Ju., Starodub, M.F., Ushkalov, V.O. (2017). Preparation of components for selective surface of immune biosensor for inditation
Pseudomonas aeruginosa. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 19(77), 190-193.
О.Ю. Новгородова, М.Ф. Стародуб, В. О. Ушкалов oleksandra_n@yahoo.com, nikstarodub@yahoo.com, ushkalov63@gmail.com
Нацюнальний утверситет бюресурсгв i природокористування Украши, вул. Геро1в Оборони, 15, м. Кш'в, 03041, Украша
А.Ю. Новгородова, М.Ф. Стародуб, В. А. Ушкалов oleksandra_n@yahoo.com, nikstarodub@yahoo.com, ushkalov63@gmail.com
Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, ул. Героев Обороны, 15, г. Киев, 03041, Украина
Preparation of components for selective surface of immune biosensor for
inditation Pseudomonas aeruginosa
O.Ju. Novgorodova, M.F. Starodub, V.O. Ushkalov oleksandra_n@yahoo.com, nikstarodub@yahoo.com, ushkalov63@gmail.com
National university of life and environmental sciences of Ukraine, Heroyiv Oborony Str., 11, Kyiv, 03041, Ukraine
The article presents the results of research to obtain specific components of the preparation selective biosensor surface for further development the immune biosensor test-system for the express - indication of bacteria Pseudomonas aeruginosa and their detection in biological material and in the environment. Specific antiserum and immunoglobulins to P. aeruginosa were obtained by autors. The resulting surface modification components for activity and specificity of the specific compounents were tested using analytical device imunosensor «Plasmon-6», based on surface plasmon resonance. Biosensors are defined as any measuring device that contains a biological element. It combines the exquisite selectivity of biology with the processing power of modern microelectronics and optoelectronics to offer powerful new analytical tools with major applications in the field of medicine, environmental studies, food and processing industries. These analytical devices are based on the union between biological and physio-chemical components. Biological components include macro-molecules such as antibodies, enzymes, tissue slices which are used to recognize and interact with a specific analyte. Physiochemical components are usually referred to as transducers which converts the interactions into signals; it is later amplified with respect to its concentration of analyte. The transducer may use potentiometric, amperometric, optical, magnetic, colorimetric devices. A target analyte in the external membrane must be able to enter the biosensor. The external membrane of the biosensor must be permeable to the analyte where the biosensor is sensitive to it. The biological element inside the biosensor then interacts with chemical species through a biochemical reaction which in turn produces another chemical product and characterized by change in mechanical, electrical properties. The output signal may be a conventional electrochemical signal depending on the type of transducer it uses.
Assessment of P. aeruginosa was carried out using an analytical device - immunosensor, with immobilized specific antibodies on the transducer surface. The antibodies have interact with cell antigens, and the resulting shift value resonance angle recorded. Changing the angle depends on the amount of the immune complexes formed on the transducer surface. From the obtained results on the selective surface of transducer of the imunosensor, we can see, that the diagnostic system works with IgG concentration of 1 mg/ml, working titer of 1:7 in polyclonal antibodies against P. aeruginosa. The resulting antiserum specific immunoglobulins can be used in preparing the selective surface of immune biosensor.
Key words: bacteria, test system, immunoglobulin, specific serum
Вступ
Мжрооргашзм Pseudomonas aeruginosa e опорту-шстичним патогеном людини та тварин i актив1зуеть-ся у випадку ослаблення iмунiтету но^ (Qing and Luyan, 2013; Sikkema and Koopmans, 2016; Mund et al., 2017). Сучасш методи визначення мiкроорганiзмiв, так як 1ФА або ПЛР вимагають великих промгжшв часу, коштовного обладнання та реактивiв (Starodub et al., 2016). Тому розробка нових недорогих, швид-ких та вщносно дешевих методiв шдикацп патогенних бактерш у навколишньому середовищi e актуальним питанням.
На сьогодш рiвень розвитку молекулярно! бюлогп у поеднанш з досягненнями фiзики i х1ми визначили новий напрям в дiагностицi захворювань на основi принцишв бюсенсорики. Серед значно! шлькосп рiзних титв iмунних бiосенсорiв особлива увага при-дметься тим, що базуються на принцип поверхнево-го плазмонного резонансу (ППР), яш належать до класу оптичних i побудоваш на ефекп бiоспецiфiчно-го фггингу та дозволяють рееструвати комплекс макромолекул з високою концентрацшною чутливютю (Novgorodova et al., 2016). Бюсенсори складаються з трьох компоненпв: бюселективного шару (зразка), детектора, що вдентифшуе стимул; трансдюсера, що перетворюе сигнал, який з'являеться в результата взаемодп аналпу з бюселективним елементом, та системи обробки сигналу. Бюсенсор формуе цифро-вий електричний сигнал, що пропорцшний концент-
рации визначувано! сполуки чи ряду сполук (Starodub et al., 2013; Baleviciute et al., 2013).
1мунобюсенсорна тест-система на основi ППР включае розробку компоненпв попередньо! подготовки селективно! поверхш трансдюсера iмунного бюсе-нсора для аналiзу (Filion-Cöte et al., 2017).
Метою нашо! роботи було отримати антисироват-ки та iмуноглобулiни до P. aeruginosa як основш ком-поненти для модифшащх селективно! поверхнi трансдюсера iмунного бiосенсора.
Матерiал i методи дослщжень
Кролiв iмунiзували за схемою грундiмунiзацi!, що грунтуеться на введенш 1 см3 антигену (штам P. aeruginosa ATCC 9027) з повним ад'ювантом Фрейнда (1:1) уздовж хребта у 6 точок шдшшрно з штервалом два тижнi. Через 45 дiб проводили гшерь мунiзацiю за схемою: введення пiдшкiрно антигену спочатку з неповним адьювантом, а попм без ад'юванту в дозi 0,1 см3 з десятиденним iнтервалом, впродовж трьох тижшв.
Кров вiдбирали з поверхнево! вушно! вени, без тотального знекровлення, з дотриманням принцишв бюетики. Отриману сироватку поетапно перевiряли на активнiсть в реакцi! аглютинацй на склi.
З активних видоспецифiчних сироваток P. aeruginosa видiляли загальну глобулiнову фракцiю бiлкiв методом висолювання насиченим розчином сульфату амон1ю, за методикою О.П. Бойко та ш.
(Bojko et al., 2010). Наявшсть бшка у фракцiях, що випкають з колонки, визначали з допомогою 5 %-го розчину трихлороцтово! кислоти. Наявнiсть солей амонiю у фраках, що витiкають, визначали як1сною реакщею з реактивом Несслера-Вiнклера.
Концентрацiю отриманих iмуноглобулiнiв визначали за допомогою спектрофотометру, при довжиш хвилi 280 нм.
Вимiрювальний пристрiй iмуносенсор «Плазмон -6» на основi поверхневого плазмонного резонансу (ППР).
Трансдюсер iмуносенсора у виглядi попередньо хромовано! (3-5 нм шару Cr) скляно! пластинки з напиленим шаром золота товщиною 45 нм поеднуеть-ся з призмою оптичного приладу за допомогою iмер-сшно! рвдини з коефщентом заломлення 1,6.
Результати та ix обговорення
Титри антитiл у кролiв, iмунiзованих за вищеза-значеною схемою, визначали на 55, 65 та 75-у добу.
До введення антигену у тварин-донорiв не було виявлено специфiчних антитш до P. aeruginosa, але уже шсля двократного введення полiвалентного антигену виявлено ст^мке утворення антитiл (табл.1).
Специфiчнi антитша у кроликiв на введення антигену формувалися активно i вже на 45-ту добу ¡муш-заци досягали середнiх титрiв 1:16 - 1:32. На 65-ту добу, титри антитш досягали рiвня 1:32 - 1:64. На 75-ту добу титри сягали рiвня 1:128 - 1:256 (рис. 1).
На основi показнишв титру антитiл отриманi анти-сироватки можуть використовуватись в подальшому для виготовлення специфiчних iмуноглобулiнiв для створення iммобiлiзацiйно! матрицi селективного шару трансдюсера.
Для перевiрки iмуноглобулiну на активнiсть та специфiчнiсть, ми iммобiлiзували бактерiальну культуру Р. aeruginosa на сенсорну поверхню чипа i проводили визначення, додаючи по краплi отриманий нами ¡муногло6улш (рис. 2).
Таблиця 1
Динамика титрш антитiл у кролiв пiд час riперiмушзацГl i'x антигеном P. aeruginosa в реакцй' аглютинацй'
Кролi № п/п
45-та доба 1:32 1:16 1:16
Титри антитш тсля ¡му^з^и
55-та доба 1:64 1:64 1:32
65-та доба 1:128 1:128 1:64
75-та доба 1:256 1:256 1:128
1
2
3
го
300 250 200 150
Q.
1 100
50 О
45-та доба 55-та доба 65-та доба 75-та доба
Титри энтмтГл nicym ¡мушзэци Ш крц|| 1 * крьнь 2 • кршьЗ Рис. 1. Динамiка титрiв антитiл у кролiв пiд час гiперiмунiзацil i'x антигеном P. aeruginosa
10 20 30 40 во 60
Рис. 2. Ка.мбрування приладу «Плазмон-6» з використанням експериментального зразка IgG до
P. aeruginosa
З вщгуку 1муносенсора видно, що д1агностична система працюе i3 концентращею IgG 1мг/мл, робо-чий титр 1:7 в полмональних антитiлах проти P. aeruginosa. Наступним етапом розробки iмуносен-сорно! тест-системи для експрес^ндикацп P. aeruginosa передбачена iммобiлiзацiя антитш на золотiй поверхнi трансдюсера iмунного бiосенсору, а також ввдпрацювання алгоритму iмуноаналiзу за до-помогою iмунного бiосенсора на основi ППР.
Висновки
Отримаш специфiчнi антисироватки та iмуногло-булiни можуть бути використанi, як компоненти тдготовки селективно! поверхт трансдюсеру iмун-ного бiосенсору. Селективна поверхня трансдюсера iмуносенсора на основi ППР працюе i3 концентрацiею iмуноглобулiна IgG 1мг/мл, робочий титр 1:7 в полмональних антитiлах проти P. aeruginosa. Що дозволяе створити конкурентоспроможну дiагностич-ну тест-систему для експрес^ндикаци P. aeruginosa.
Перспективи подальших розробок. Шдготовлеш компоненти для чутливо! поверхнi трансдюсера бу-дуть використанi у сери дослвджень щодо вщпрацю-вання алгоритму постановки iмуноаналiзу за допомо-гою iмунного бiосенсора на основi ППР.
Б1блюграф1чш посилання
Qing, Wei, Luyan, Z.Ma. (2013). Biofilm Matrix and Its Regulation in Pseudomonas aeruginosa. Int J Mol Sci. 14(10), 20983-21005. doi: 10.3390/ijms141020983 Sikkema, R., Koopmans, M. (2016). One Health training and research activities in Western Europe. Infect Ecol Epidemiol. 6: 10.3402 / iee. v6.33703. doi: 10.3402 / iee.v6.33703
Mund, A., Diggle, S.P., Harrison, F. (2017). The fitness of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing signal
cheats is influenced by the diffusivity of the environment. mBio 8:e00353-17. https://doi.org/10.1128/mBio.00353-17.
Starodub, N., Ogorodniichuk, J., Novgorodova, O.
(2016). Efficiency of Instrumental Analytical Approaches at the Control of Bacterial Infections in Water, Foods and Feed, in Biosensors for Security and Bioterrorism Applications. Edited by Dimitrios P. Ni-kolelis
Novgorodova, O.Yu., Ogorodnijchuk, Yu.O., Starodub, M.F. (2016). Naukovo-metody'chni rekomendaciyi «Biosensorny'j kontroF bakteriaFnogo zabrudnennya seredovy'shha». Ky'yiv (in Ukrainian).
Starodub, N.F., Ogorodniichuk, I., Lebedeva, T., Shpylovyy, P. (2013). Optical immune biosensor «Plasmon Test» for the determination of Salmonella typhimurium. Sensor Electronics and Microsystems Technology. 10(1), 106-113.
Baleviciute, I., Balevicius, Z., Makaraviciute, A., Rama-naviciene, A., Ramanavicius, A. (2013). Study of antibody/antigen binding kinetics by total internal reflection ellipsometry. Biosens Bioelectron. 39(1), 170176.
Filion-Cote, S., Melaine, F., Kirka, A.G., Tabrizian, M.
(2017). Monitoring of bacterial film formation and its breakdown with an angular-based surface plasmon resonance biosensor. Analyst. 30. doi: 10.1039/c7an00068e
Bojko, O.P., Kucheryavenko, R.O., Bojko, P.K., Busol, V.O., Mandy'gra, M.S. (2010). Vy'gotovlennya diag-nostykumu dlya imunofluorescentnoyi indykaciyi ta identyfikaciyi Pseudomonas aeruginosa: Metody'chni rekomendaciyi dlya specialistiv vetery'narnoyi medy'cy'ny', naukovciv ta studentiv. Ky'yiv: NUBiP (in Ukrainian).
Cmammn nadiümna do peda^ii 30.03.2017
