CC BY
22
© *Онопрieнко М. В., "Соколова I. 6., **Масюк Д. М. *Вшшков А. I. УДК 578.74+636.4.033
*Онопр'1енко М. В., *Соколова I. €., **МасюкД. М. *Вiннiков А. I.
ОЦ1НКА ЕФЕКТИВНОСТ1 1МУНОПРОФ1ЛАКТИКИ ЦИРКОВ1РУСНОТШФЕКЦП У СВИНЕЙ
*Днiпропетровський нацiональний унiверситет iм. О. Гончара (м. Днтропетровськ) **Науково-дослщний центр бiобезпеки та екологiчного контролю агропромислового комплексу Днтропетровського державного аграрного унiверситету
(м. Днтропетровськ)
2|2ота@1.иа
Роботу було виконано у межах держбюджетно! теми №1-294-15, що виконуеться на кафедрi мiкро-бiологiT, вiрусологiI та бiотехнологiI Днтропетровського нацюнального унiверситету iменi Олеся Гончара, № державноТ реестраци 0115U002385.
Вступ. Першi вiдомостi про патогенний цирков^ рус свиней з'явилися в 1991 р., коли в Канадi було виявлено нове захворювання - синдром мультисис-темного виснаження от'емишмв (СМВО). У поросят 6-14- тижневого в^ спостерiгали виснаження, за-дишку, дiарею, жовтушнiсть шкiри. Отриман зго-дом данi дозволили охарактеризувати новий вiрус, як цирковiрус свиней 2-го типу. Вивчення ролi цир-ковiрусiв (ЦВС) в iнфекцiйнiй патологи свиней, свщ-чить про участь ЦВС-2 у патогенезi таких захворю-вань, як СМВО, дерматит i синдромом нефропатiT (ДСНП). До цього списку також вщносять конгеы-тальний (вроджений) тремор, некротизуючi i прол^ феративнi плевропневмонiT, ексудативнi епщерм^ ти та ентерити. 1снують припущення про здатнють ЦВС-2 викликати порушення репродуктивних функ-цiй у свиноматок [5,8].
Виникненню даного комплексу захворювань сприяе розвиток змшаних iнфекцiй ЦВС-2 з шшими патогенами вiрусноT та бактерiальноT природи [3,5].
Першi вiдомостi про наявнють цирковiрусу в по-пуля^ях свиней були отриманi A. B. Щербаковим у 2000 р. Проте, у втизнянм лiтературi вiдсутнi дан про бiологiчнi властивостi iзолятiв цирковiрусу свиней 2-го типу, циркулюючих у популяцiях домашнiх свиней [7,6].
Залишаються не з'ясованими питання ключного прояву хвороб, асоцiйованих з цирковiрусами при змiшаних iнфекцiях. Патолопчы змiни при пол^ етiологiчному шфекцмному процесi за участю ЦВС е надзвичайно рiзноманiтними. У зв'язку з цим не-обхiдно Tх детальне вивчення для встановлення ет-демiчного значення [4].
Данi, отриманi дослщниками за останнi кiлька рокiв свщчать про iснування ще одного представни-ка сiмейства цирковiрусiв. Цей вiрус був видiлений в ЯпонiT в 1997 р. у людини з посттрансфузмним гепатитом i названий ТТ^русом (TTV - Transfusion transmitted virus). Подальше вивчення молекулярних i бiофiзичних властивостей вiрусу дозволило стано-вити аналопю у будовi вiрiонiв TTV з цирковiрусами
тварин. Проте, геном ТТУ представлений молекулою одноланцюгово! ДНК 1з вм1стом 37503852 ну-клеотид1в, що дещо б1льше розм1ру типового для цирков1русу тварин. Р1шенням М1жнародного Ком1-тету з ТаксономИ в1рус1в ТТ-в1рус входить до складу роду Anellovirus родини Circoviridae. Доогмдження ТТУ показали, що даний агент мае повсюдне по-ширення. За остаными даними ТТ-в1рус знайде-ний у домашых тварин (свин1, юшки, собаки, курки, в1вц1), примат1в, екзотичних тварин (Tupaia belangeri chinensis, Saguinus oedipus, Aotes trivirgatus) [9].
У зв'язку з цим проблема цирков1русно1 Ыфекцп у свиней е достатньо актуальною як для оцшки епще-м1чно1 ситуацп, так I для розробки заход1в специф1ч-но! 1мунопроф1лактики I терапИ. Вже з'явились вакци-ни для 1мун1зацИ свиней проти цирков1русно1 1нфекцИ, що дозволяють проводити профтактику захворювання. Одн1ею з цих е вакцина Циркофлекс.
Метою даного досл1дження була перев1рка ефективност1 1мун1зацИ свиней вакциною Циркофлекс для профтактики цирков1русно1 1нфекцИ.
Об'ект I методи досл1дження. Основним об'ек-том досл1дження було вивчення процесу формування 1мун1тету у поросят Ыфкованих цирков1русом, та 1му-н1зованих вакциною Циркофлекс. Для цього були в1-д1бран1 поросята 4-тижневого в1ку для 2-х дослщних та 2-х контрольних груп по 15 особин у кожнй В дослщних групах поросят прищеплювали в 5-тижнево-му вщ1 одн1ею дозою (1,0 мл) вакцини 1нгельвак Циркофлекс (Бер1нгер 1нгельхайм, Н1меччина), поросят у контрольних групах не вакцинували. Поросят дослщних I контрольних груп утримували I вигодовували в р1зних вольерах одного господарства.
Уся експериментальна частина досл1дження була проведена згщно з вимогами м1жнародних принци-п1в «бвропейсько! конвенцИ щодо захисту хребет-них тварин, як1 використовуються в експеримент1 та 1нших наукових ц1лях» (Страсбург 1986 р.) та вщпо-вщного Закону Укра!ни «Про захист тварин вщ жор-стокого поводження» (№ 3446-IV в1д 21.02.2006 р., м. Ки!в).
Для визначення концентрац1й 1муноглобул1-н1в у кров1 поросят застосовували 1мунофермент-ний анал1з (1ФА) 1з використанням тест-системи «!пде21т 01гооу1гиз 1дМ/!дО ® 11.Р0\/К2» (!пдепаза, 1спан1я) [2].
Для вщбору проб для 1ФА здiйснювали забор KpoBi у поросят на 4-, 6-, 10-, 14-, 18-, 22-ому тиж-нях. Вщбирали кров у ктькост 5-7 мл у стерильш пробiрки. Для вщстоювання сироватки пробiрки
3 кров'ю витримували 30 хв. при температурi 25°С, а потiм при 4°С. Через 10-12 годин зливали сиро-ватку в iншi пробiрки. Сироватка була прозорою, без ознак гемолiзу. Для визначення ефективност вак-цинацií порiвнювали показники концентрацiй IgM та IgG у поросят контрольних та дослщних груп.
Була проведена статистична обробка результат визначення середньостатистичних значень концен-трацiй IgM та IgG iз використанням комп'ютерних програм Microsoft Excel 2007, «Biostat-4».
Результати дослiдження та Гх обговорення. Головною метою даноУ роботи було дослщження ефективностi iмунiзацií свиней вакциною Циркоф-лекс для профтактики цирковiрусноí iнфекцií. Вак-цинацю проводили на 5 тижнi життя поросят. Для цього в першому дослщженш вщбирали поросят методом репрезентативно!" вибiрки у дослiдну та контрольну групи по 15 особин. У контрольна груш поросят не вакци-нували. Спостереження за тваринами i вiдбiр кровi для визначення антитт проводили паралельно в обох групах протягом 22-х тижшв.
Як видно з рис. 1 i 2, в усiх свиней контрольно" та до-слiдноí груп на 4-му тижш (ще до вакцинацп) спостерiгалися великi початковi концентрацп у кровi специфiчних IgG.
Це можна пояснити де-кiлькома причинами. По-перше, IgG могли з'явитися у новонароджених поросят завдяки передачi антитiл вiд iнфiкованоí свиноматки через плаценту. Другою причиною могло бути зараження поросят вертикальним шляхом пщ час полопв вщ шфковано'| свиноматки або побутовим шляхом пщ час вигодову-вання до вакцинацп у першi
4 тижнi.
Аналiз даних, представле-них на рис. 2, ще раз пщтвер-джуе припущення вiдносно того, що вс поросята (до-слiдноí та контрольно'| груп) були завчасно iнфiкованi, ще перед початком експеримен-ту. Пюля вакцинацií на 6-ому тижнi життя в кровi поросят дослiдноí групи спостер^а-еться незначне пiдвищення концентрацп IgM, очевидно за рахунок активацп нових, ще
не сенсибЫзованих В^мфоци^в, однак у HacTynHi тижнi вона почала знижуватись.
Що стосуеться IgG, то з 4-го по 14-ий тиждень спостерiгаeться pi3Ke зниження його концентрацм. Це можна пояснити тим, що вакцина була введена вже зараженим поросятам та шсля и введення ан-тигени вакцини нейтралiзували тi антитiла, якi були присутш у кровi тварин с перших тижшв Тх життя.
Вакцина Циркофлекс мютить протективний антиген ORF2 цирковiрусу другого типу (PCV-2) у кть-костi вiд 1 до 3,75 ВА (Вщносна Активнiсть за тестом ELISA у порiвняннi з еталонною активнiстю) в однiй щеплювальшй дозi (1 мл). Вакцина мютить також допомiжний компонент - карбомер (ад'ювант) в iзо-тонiчному розчиш хлориду натрiю [1].
Згiдно з анотащею на вакцину, Циркофлекс ви-кликае формування iмунноТ вiдповiдi у свиней до цир-ковiрусу 2-го типу приблизно через 2 тижш шсля за-стосування, що збер^аеться не менше 4 мiсяцiв [1].
-IgM -IgG
Bik поросят (тижш]
Рис. 1. Динамка утворення антитiл (IgM та IgG) у свиней контрольно'!' групи (1-й експеримент)
г «
Ъ
га а
5
£ х о
X
S
X
V т
га
■г
а
ш
-IgM -IRG
±0,09 ±0.009
BiK поросят (тижж)
Рис. 2. Динaмiкa утворення антитш (IgM та IgG) у свиней дослщно'Г групи (1-й експеримент)
У зв'язку з тим, що при 1-му доошджены до до-ошдноТ та контрольно( груп увмшли, можливо, вже iнфiкованi поросята, то ефективнють вакцинацiï була недостатньо високою. Тому, перед проведенням на-ступного дослiдження (експеримент 2) здiйснювали перевiрку дослiдних тварин на наявнiсть iмуногло-булiнiв проти цирковiрусу. В дослщження вiдбирали тiльки здорових поросят. Як i в 1-му експеримент^ до контрольно)' та дослано)' груп входили по 15 тварин. Вакцинацю проводили в доошднм групi також на 5-му тижнк
На рис. 3 i 4 представлен дан про накопичення iмуноглобулiнiв в сироватках кровi тварин контрольно' та дослано)' груп.
Як видно з рис. 3, у поросят контрольно)' групи в процес спостереження з 6-го по 22-ий тиждень концентращя iмуноглобулiнiв змiнювалась незначно.
При аналiзi динамiки накопичення антитiл у вак-цинованих поросят дослiдноï групи (рис. 4) було
-IgM
±0,03
±0,02
8 10 12 14 is 18
BiK поросят (тижж)
Рис. 3 Динамка утворення антитш (IgM та IgG) у свиней контрольно'!' групи (2-й експеримент)
а-и cl
iX <D 3" X о
X
s
cl ш
±0,01
BiK поросят (тижш)
Рис. 4. Динамiка утворення антитiл (IgM та IgG) у свиней дослщно'Г групи (2-й експеримент)
встановлено, що максимальна кшькють IgM виявля-лась на 6-му тижн життя тварин (1-й тиждень пюля iмунiзацiï вакциною Цикрофлекс). Далi протягом 4-х тижыв (до 10-го тижня) вона падала и наступ-н 12 тижнiв, до кiнця експерименту, була низькою. Що стосуеться IgG, то максимальний його рiвень був в^д^чений на 14-му тижнi. До 14-го тижня вд бувалося поступове пiдвищення концентрацiï IgG, а пюля 14-го тижня - поступове зниження.
Отриман результати свiдчать про нормальний iмунiзаторний процес, оскiльки IgM е маркером первинно( iмунноï вiдповiдi i в нормi з'являеться вже на першому-другому тижнях пiсля iмунiзацiï. Пюля появи бiльш пiзнiх антитiл - IgG, кшькють IgM падае. Таким чином можна стверджувати, що вакцинащя здорових тварин е ефективною i сприяе формуван-ню тривалого iмунiтету.
Проте, слiд вiдмiтити, що на 18-му тижн вщбуло-ся невелике тдвищення концентрацiï IgM. Це може
свщчити про повторний контакт поросят з BipycoM (рис. 4).
Пор1внявши ефектив-HicTb вакцини Циркофлекс при ¡мунмзаци хворих (у першому експеримен-Ti) та здорових (у другому експеримент!) поросят
__звертае на себе увагу pi3-
ниця в динамМ зм1н пулу IgG та IgM. Так, при iмунi-заци завчасно Ыфкова-них поросят рiвень iмуно-глобулiнiв у кровi тварин знижувався iз-за нейтра-лiзацiï антитiл антигенами введеноï вакцини. Це е показником низько( ефек-тивностi iмунiзацiï. В 2-му експеримент^ де проводили вакцинування здорових тварин, спостер^али класичну динам^ розви-тку первинноï iмунноï вд повiдi пiсля введення вакцини Циркофлекс, а саме: спочатку, пюля iмунiзацiï дещо пiдвишуеться кон-центращя IgM, а вже через 3 тижн починаеться рiзке пiдвищення концентраци IgG, що свiдчить про ефективнють iмунiзацiï.
Ураховуючи отриманi нами даы, можна реко-мендувати великим фер-мерським господарствам, як займаються вирощу-ванням свиней, перед проведенням вакцинаци завчасно проводити моы-торинг на наявнють у поросят побутово( iмунiзацiï
±0,02
±0,01
±0,08
-IjM
-"ев
цирков1русом. Якщо вона мае мюце, то введення вакцини проводити не слщ бо це т1льки знижуе вже набутий 1мун1тет.
Висновки
1. При постанов! першого експерименту, коли мала мюце, як виявилося, побутова iмунiзацiя, у поросят контрольно! групи з самого початку визнача-лись висок! титри IgM та IgG. У дослщно! групи, ще до ^унюаци, також були достатньо висок! р!вн! IgM та IgG. Тому iмунiзацiя свиней дослщно! групи привела до негативних наслщюв, а саме, до практично повного виключення iмунiтету, який очевидно сфор-мувався у поросят трансплацентарним або алiмен-тарним шляхом.
2. При постановi другого експерименту, коли перед iмунiзацiею проводився !мунолог!чний аналiз кров! на наявнють IgM та IgG i для доогмдження вщ-
бирались тшьки здоровi тварини, було встановле-но високу ефективнiсть iмунiзацiI свиней вакциною Циркофлекс. Про це свщчили пщвищення рiвнiв 1дМ та 1дй пiсля вакцинацiI у свиней дослщно! групи.
3. Перед проведенням iмунiзацiI треба завчасно проводити моыторинг на наявнють у поросят побу-тово! iмунiзацiI цирковiрусом. Якщо побутова iмунi-зацiя поросят мае мiсце, то iмунiзацiю вакцинами проводити не слщ бо це ттьки знижуе вже набутий iмунiтет поросят.
Перспективи подальших дослiджень
Оскiльки в ветеринарнiй практицi починають за-стосовувати вакцини рiзних виробникiв, то на на-ступному етапi роботи буде проведено порiвняння ефективностi iмунiзацiI свиней вакцинами 1нгельвак Циркофлекс (Берiнгер 1нгельхайм, Нiмеччина) та Биуахуп PCV2 ( <^ое^», США).
Лiтерaтурa
1. Анотацiя до вакцини 1нгельвак Циркофлекс (Берiнгер 1нгельхайм, Ымеччина).
2. Анотацiя до тест-набору 1ФА (Ingenasa, lспанiя).
3. Дягилев К. К. Цирковирусная инфекция свиней и борьба с ней / К. К Дягилев // Совершенствование технологии производ-
ства свинины на комплексах и фермах промышленного типа Минской области: науч.-практ. конф. / РНИУПИЭВ. - Минск, -2003.- С. 39-43.
4. Орлянкин Б. Г. Респираторные нарушения свиней / Б. Г. Орлянкин // Мат. международной научно-практической конферен-
ции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». ГНУ ВИЭВ, 2006. - С. 135-138.
5. Сатина Т. А. Цирковирусные инфекции свиней / Т. А. Сатина // Обзор литературы / ФГУ ВНИИЗЖ. - Владимир, - 2003. -
101 с.
6. Серомониторинг инфекционных болезней среди диких кабанов в центральном федеральном округе России / С. А. Кукушкин
[и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных / ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»). Т.4. - Владимир. - 2006. - С. 233-237.
7. Тимина A. M. Выявление и дифференциация цирковирусов свиней методом мультиплексной ПЦР / A. M. Тимина, A. B. Щер-
баков, В. Ф. Ковалишин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных / ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»). Т.4. - Владимир. - 2006. - С. 91-99.
8. Alan G. M. Porcine circovirus: a review / G. M. Alan, J. A. Ellis // J. Vet. Diagn. Invest. - 2000. - Vol. 12, N 1. - P. 13-14.
9. Prevalence of swine Torque teno virus in post weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected
pigs / T. Kekarainen [et al.] // J. General Virology. - 2006. - Vol. 87. P. 833-837.
УДК 578.74+636.4.033
ОЦ1НКА ЕФЕКТИВНОСТ11МУНОПРОФ1ЛАКТИКИ ЦИРКОВ1РУСНОТ ШФЕКЦП У СВИНЕЙ
Онопрieнко М. В., Соколова I. €., Масюк Д. М., Вшшков А. I.
Резюме. Показана ефективнють iмунiзацiI здорових поросят вакциною Циркофлекс, що пщтверджуеть-ся даними про наростання титрiв антитш протягом 6-22 тижыв. Показано також негативний вплив iмунiзацiI при введены вакцини поросятам, як були завчасно шфковаы цирковiрусом. Це було пщтверджено сутте-вим зниженням концентраци 1дй пюля вакцинаци. У вщношены цирковiрусноI шфекцп вперше було показано необхщнють обов'язкового визначення вихщних концентрацм специфiчних антитш у свиней перед iмунiза-
Ключовi слова: цирковiрус свиней, цирковiрусна Ыфек^я, iмуноферментний аналiз, iмуноглобулiни, iмунiзацiя, вакцина.
УДК 578.74+636.4.033
ОЦЕНКА ЭФЕКТИВНОСТИ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ЦИРКОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У СВИНЕЙ
Оноприенко М. В., Соколова И. Е., Масюк Д. Н., Винников А. И.
Резюме. Показана эффективность иммунизации здоровых поросят вакциной Циркофлекс, о чем свидетельствуют данные о нарастании титров антител в течение 6-22 недель. Показано также негативное влияние иммунизации при введении вакцины поросятам, которые до иммунизации были инфицированы цирковиру-сом. Это было подтверждено существенным снижением концентрации 1дй после вакцинации. В отношении цирковирусной инфекции впервые показана необходимость обязательного определения исходных концентраций специфических антител у свиней перед иммунизацией.
Ключевые слова: цирковирус свиней, цирковирусная инфекция, иммуноферментный анализ, иммуноглобулины, иммунизация, вакцина.
UDC 578.74+636.4.033
ESTIMATION OF IMMUNE PREVENTION EFFICACY OF CIRCOVIRUS INFECTION OF PIGS
Onopriienko M. V., Sokolova I. E., Masuk D. N., Vinnikov A. I.
Abstract. The graduation devoted to study of efficacy of pig immunization with Circoflex vaccine to prevent the circovirus infection.
The first information about pathogenic porcine circovirus appeared in 1991, when in Canada was discovered a new disease - a syndrome of multi-tag piglets' exhaustion (SMPE). Exhaustion, shortness of breath, diarrhea, jaundice skin were watched in pigs at the age from 6 to 14 weeks. The received data let discover new virus as swine circovirus type 2. It was shown that circovirus play main role in pathogenesis of diseases such as SMVO, dermatitis and nephropathy syndrome (DSNP). The list also includes congenital tremor, proliferative and necrotizing pleuropneumonia, epidermidits and exudative enteritis. There are assumptions about the ability of TSVS 2 to break reproductive functions in sows.
Object of research was study of immunity response in pigs infected by circovirus and immunized with vaccine Circoflex. The pigs of 4 weeks age were selected for 2 experimental and 2 control groups of 15 animals each. The piglets in experimental groups were vaccinated at 5 week of age by one dose (1.0 ml) of the vaccine Inhelvak Cyrkofleks (Boehringer Ingelheim, Germany). The piglets in control groups were not vaccinated. The pig of experimental and control groups were breastfed and kept in different cages of one household.
To determine the concentrations of antibodies in blood of pigs enzyme immunoassay test (ELISA) «Ingezim Circovirus IgM / IgG ® 11.PCVK2» (Ingenasa, Spain) was used. A samples of blood for ELISA were received from pigs in 4-, 6-, 10-, 14-, 18-, 22-nd weeks. The blood in amount of 5-7 ml was placed in sterile tubes. To separate serum from blood cells the test tubes were endured 30 minutes at 25°C and then at 4°C. The serum after 10-12 hours of standing was carried into other tubes. Serum was transparent, hemolysis not was discovered.
To analyse of vaccination efficacy the concentrations of IgM and IgG in piglets blood of control and experimental groups were compared.
A statistical treatment of average values of IgM and IgG concentrations was carried out with software Microsoft Excel 2007, «Biostat-4».
The methods of research are: biological, immunological, ELISA for determining the concentration of IgM and IgG, statistical methods.
The results of research are: efficiency of immunization of healthy pigs with Circoflex vaccine was showed, as a result the growth of IgM and IgG titers during 6-22 weeks was observed. It was also shown negative influence of vaccine injection to infected pigs. This was confirmed by a significant decrease in the concentration of IgG, which was initially high before vaccination. A necessity of determination of concentrations of specific antibodies in pigs before immunization was first showed regarding to circovirus infection.
Results, that were got, can be used for the development of practices creation principles of immunization schemes.
The work is interesting for veterinarian, medicals, microbiologist and virologist.
Keywords: Cyrcovirus of pigs, Cyrcovirus infection, ELISA, Immunoglobulin, Immunization, Vaccine.
Рецензент - проф. Цебржинський О. I.
Стаття надшшла 24.10.2015 року
