CC BY
1РОЗРОБКА СЕЛЕКТИВНОГО СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ ВИД1ЛЕННЯ ТОКСИН ПРОДУКУЮЧИХ ШТАМ1В C. DIFFICILE
Кхедер Caid Салех,
Молодший науковий ствробтник, Державна установа «1нститут м^кроб^ологИ' та ¡мунологп iM. 1.1. Мечникова Нацюнальног академп медичних наук Украгни», ORCIDID: https://orcid.org/0000-0002-0765-3157
DOI: https://doi.org/10.31435/rsglobal_ws/31102020/7216
ABSTRACT
Enterocolitis disorders caused by Clostridioides difficile infection still remain a serious health problem in the world. In many countries CDI is officially considered a nosocomial infection that causes considerable economic losses, including diagnostic and treatment costs. According to the existing data, C. difficile is the main agent causing antibiotic -associated diarrhea and the main etiologic factor of the pseudomembranous colitis (PMC) that often develops in case of complete destruction of the intestinal flora due to the use of antibiotics or chemotherapeutic agents. There is no official registration of CDI in Ukraine, therefore the official incidence and lethality rates are absent. At this time, the problems of development and improvement of selective nutrient mediums and quick, affordable bacteriological methods of C. difficile isolation are especially relevant.
The comparative study of the efficacy of the known commercial nutrient mediums for isolation of toxin-producing strains of C. difficile was carried out and composition of a new, original selective nutrient medium was proposed. Unlike existing analogs, the proposed nutrient medium is suitable for the simultaneous isolation of the agent from the clinical material and detection of toxin-producing properties due to its high growth properties, optimal transparency and density.
Citation: Kheder Said Saleh. (2020) Development of the Selective Nutrient Medium for Isolation of Toxin Producing Strains of C. Difficile. World Science. 8(60). doi: 10.31435/rsglobal_ws/31102020/7216
Copyright: © 2020 Kheder Said Saleh. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) or licensor are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.
Вступ. Ентероколгги, обумовлет Clostridioides d7ificile-iнфекцiя (CDI) i доа залишаються серйозною проблемою охорони здоров'я в усьому свт. У багатьох кра!нах CDI офщшно визнано, як нозокомiальну, економiчm втрати вщ яко! досить сутта, враховуючи витрати на дiагностику та ткування. За даними Центру контролю та профшактики захворювань (CDC), тшьки у Сполучених Штатах у 2017 рощ CDI спостершалась у 223 900 випадюв, 12 800 - це були випадки з летальним юнцем, витрати на охорону здоров'я, пов'язаш з цим, склали 1 млрд. долл. США [1].
У Сврош на початку 2000-х захворювашсть на CDI була у 10 разiв нижчою, шж зараз. Починаючи з 2007 року, коли був зареестрований перший випадок CDI, спричинений епiдемiчним штамом 027, европейсью кра!ни та США, враховуючи тдвищену небезпеку нового, на той час, епiдемiчного штаму, ввели обов'язкову реестращю важких захворювань, обумовлених CDI, розробили та впровадили низку протиепiдемiчних заходiв [2, 3].
Ниш захворювашсть на CDI у Свропейських кра!нах складае 10,0 - 30,0% серед вах антибютикоассоцшованих дiарей, та поки що, мае тенденщю до збшьшення частоти i тяжкост захворювання [4-6].
ARTICLE INFO
Received: 23 August 2020 Accepted: 10 October 2020 Published: 31 October 2020
KEYWORDS
C. difficile,
toxin-producing activity, nutrient media.
У крашах Азп, зокрема у Кита', останш дослiдження показують таку саму захворюванiсть на CDI, як i в европейських крашах. Hobí дослiдження, проведенi показали захворюванють CDI на piBHi 31,1 % [7].
В Укрш'ш офiцiйна реестращя CDI вiдсутня, тому вiдсутнi i офщшш показники захворюваностi, а також смертности
Clostridioides difficile (C. difficile) - грам позитивна рухлива спороутворююча паличка, облiгатний анаероб, представник факультативно!' мiкрофлори кишкiвника. За таксономiчною класифшацею належить до сiмейства Peptostreptococcaceae, роду Clostridioides. До 2016 року C. difficile розглядали, як представника роду Clostridium, але пiсля проведення секвенування 16S р РНК та рибосомального бiлка, C. difficile та C. mangenotii було вщнесено до окремого роду Clostridioides [8, 9]. Представники цього виду можуть продукувати екзотоксини i бути патогенними для людей i тварин.
C. difficile - е основним збудником антибютикоасоцшованих дiарей та головним етюлопчним фактором розвитку псевдомембранозного кол^у (ПМК), що часто виникае у випадку знищення флори кишечника через використання антибiотикiв або хiмiотерапевтичних препаратiв [10, 11].
Головну роль у патогенезi CDI вщграе такий фактор патогенностi, як здатнють збудника до продукцiï двох екзотоксишв: токсину A (TcdA) i токсину B (TcdB) [12]. Токсин A та токсин B мають сильну цитотоксичну та запальну дiю. Ц токсини е ферментами глюкозилтрансферазами, що каталiзують iнактивацiю бiлкiв Rho, як вiдповiдають за органiзацiю актинового цитоскелету та функцiю епiтелiального бар'еру [13, 14]. Глюкозилiрування бiлкiв Rho призводить до дезагрегацп актинового цитоскелету, збшьшенню проникностi мембран, втратi бар'ерноï функци, склеюванню клiтин та ïx загибелi [15]. Внаслiдок руйнування епiтелiальниx кл^ин виникае порушення водно-електролiтного обмiну в цшому, що сприяе секрецiï рщини у кишковий простiр. Токсини C. difficile здатш iндукувати апоптоз та некроз епiтелiальниx клiтин, беруть участь у тканезахисних запальних процесах, стимулюють масивнi клiтиннi реакцiï у виглядi нейтрофiльноï iнфiльтрацiï з пiдвищенням активност та вивiльненням цитокiнiв (IL-8, IL-6, IL-1P, лейкотрiенiв B4, iнтерфероу у) [16, 17]. 1снуе також бшарний токсин, але його роль до кшця не вивчена [18].
За даними деяких дослщниюв, самим надшним, з можливiстю широкого використання в практичнш медицинi, залишаеться культуральний (бактерюлопчний) метод дiагностики CDI. Але, бактерюлопчне видiлення штамiв C. difficile з випорожнень хворих пов'язано з рядом труднощiв, в тому чи^ з невеликою кшьюстю збудника в кишювнику через наявнiсть рiдкиx частих випорожнень. Крiм того, без визначення токсигенних властивостей видiлениx збудникiв, бактерiологiчний метод не може бути використаний, як самостшний, для проведення дiагностики.
Таким чином, питання розробки та удосконалення селективних середовищ та швидких, доступних методiв виявлення токсинiв C. difficile залишаеться актуальним.
Матерiали i Методи.
Матерiалом для дослiджень були зразки бютичного матерiалу (фекалiï) вiдiбранi вщ хворих з проявами CDI.
Вiдбiр матерiалу здiйснювали у стерильну пластикову емнiсть в об'емi 5-10 мл. Дослщженню пiдлягали зразки рщких фекалiй. При неможливостi доставки зразюв до лабораторiï протягом 2 годин, фекали вiдбирали у транспортну пробiрку-тампон з середовищем Еймса в об'емi не менш нiж 5 мл.
З метою видшення C. difficile дослщжуваний матерiал у кiлькостi 0,1 мл з розведень 103-106 виавали на селективний фруктозний агар - Clostridium Difficile Agar (CDA) (HiMedia, 1цщя) з селективною добавкою FD 010 (HiMedia, Iндiя), агар Шедлера з 5,0 % овечо1' кровi (bio Mérieux, Францiя) та на кров'яний сахарний агар (з 2,0 % глюкози та 10,0 -15,0 % кров^. Чашки з поавами помщали в анаеростат з GEN box anaer. 1нкубащя 37°С 5 дiб.
Паралельно проводили висiв на попередньо розплавлене та охолоджене до 45°С середовище Вiльсона-Блера (по двi пробiрки з кожного розведення). По однш пробiрцi кожного розведення прорвали на водянiй банi при 80°С на 20 хв. Iнкубацiя 37°С 48 год.
Попередню iдентифiкацiю iзольованиx культур, що виросли на щшьних середовищах, робили за характерною морфолопею колонiй, наявнiстю специфiчного запаху крезолу
«навозу», результатами мшроскопи мазюв, пофарбованих за Грамом (наявшсть крупних 3-6 х 1,3-1,6 нм грампозитивних паличок з овальними субтермiнальними спорами) [19].
На середовищi Вiльсона-Блера про наявнiсть клостридiй свщчили чорнi колони у товщi агару (наявшсть сульфитредуктази).
Для щентифшаци мiкроорганiзмiв використовували API системи виробництва bio Merieux, Францiя (Rapid ID 32A - identification system for anaerobes).
Результати дослщження.
При розробцi нового селективного середовища для видiлення токсинпродукуючих штамiв C. difficile з клшчного матерiалу, за основу було взято склад комерцшного середовища Clostridium Difficile Agar (CDA) (HiMedia, Iндiя) з селективною добавкою FD 010 (HiMedia, Iндiя), поширеного в Украiнi. До основного складу входили наступи компоненти: протеаза пептон, гiдрофосфат динатрiю, калда дiгiдрофосфат, сульфат магнiю, хлористий натрш, фруктоза, агар, антибiотики циклосерин та цефокситин. Для того, щоб середовище було незабарвленим та прозорим (придатним для проведення реакцп iмунопреципiтацii) до складу не було включено еритроцитарну добавку (7,0 % еритроципв барана). З метою покращення ростових якостей та вивчення впливу рiзних компонента рщких живильних середовищ на штенсившсть росту штамiв C. difficile попередньо нами проводились дослщження, як показали, що додавання до живильних середовищ таких речовин, як розчин глюкози, дрiжджовий екстракт та вiкасол в концентращях 1,0 %, 2,0 % та 1,0 % вщповщно, сприяе iнтенсивностi росту C. difficile та статистично достовiрному збiльшенню кiлькостi мшробних клiтин порiвняно з контрольним середовищем. Тому, глюкоза, дрiжджовий екстракт та вшасол в концентрацiях 1,0 %, 2,0 % та 1,0 % вщповщно, також були включеш нами до основного складу середовища, яке розробляеться.
На першому етапi розробки середовища проведено порiвняльне вивчення ростових якостей запропонованого середовища та середовища Clostridium Difficile Agar (CDA) (HiMedia, 1цщя). Для цього готували мшробш суспензи добових культур клiнiчного та музейного штамiв C. difficile (1,0 за McF, 6,5* 107 КУО/мл), робили ряд сершних десятикратних розведень i висiвали по 0,1 мл на чашки з дослщжуваними агарами. Культивування проводили 48 годин в анаеробних умовах, пiсля чого шдраховували кiлькiсть колонiй. Результати представленi в таблиц 1.
Таблиця 1. Порiвняння ростових якостей запропонованого та комерцшного середовища, для видшення C. difficile. _
Поживш середовища Кiлькiсть мшробних клiтин КУО/мл, (М ± m)
106 105 104 103
C. difficile 281 C. difficile №1 C. difficile 281 C. difficile №1 C. difficile 281 C. difficile №1 C. difficile 281 C. difficile №1
Clostridium Difficile Agar (HiMedia, Iндiя) in 0 X Q) CD ± ,8 in 0 X CD ± ,6 0 X c0 ± ,4 5,( 0 X c0 ± ,4 5,( 0 X <Z> ± ,4 cn 0 X <Z> ± ,4 4,( Немае росту Немае росту
in 0 in 0 0 0 0 0 3 0
1 1 1 1 1 1 1
Запропоноване m in P P СО о m
середовище о ± О ± о ± о ± О ± о ± о ±
m ,8 ,8 ,6 ,6 ,2
2,( 1, 5, 5, 4,( 4,( 1,
( ( ( ( ( ( (
Примiтка: C. difficile 281 (музейний штам), C. difficile №1 (клшчний iзолят).
Отримаш результати засвiдчили, що запропоноване нами середовище мае кращi ростовi якосп порiвняно з комерцiйним середовищем. Рют колонiй клiнiчного та музейного штамiв
C. difficile вщбуваеться з розведення культури 103 (КУО/мл), тодi як на комерцшному середовищi - при посiвнiй дозi не менше, нiж 104 (КУО/мл). Таким чином, запропонований склад середовища шдвищуе чутливiсть методу i дозволяе виявляти збудника при значно меншш його кiлькостi в клiнiчному матерiалi (р < 0,05).
Для перевiрки селективних якостей взятого за основу комерцшного середовища готували мiкробнi суспензи добових культур референс- штамiв Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus 25923, Shigella flexneri Д1СК 170 та контрольних лабораторних штамiв: Proteus mirabilis 461, Clostridium perfringens 12, Peptostreptococcus spp., Clostridioides difficile 281 (1,0 за McF, 6,5*107 КУО/мл), робили серда десятикратних розведень i виавали по 0,1 мл на чашки. Результати вираховували через 48 годин культивування в анаеробних умовах.
Отримаш результати свщчать про недостатнш селективний ефект комерцiйного середовища. Комбшащя антибiотикiв циклосерина та цефокситина не затримуе рют анаеробних кокiв (пептострептокоюв).
На другому етапi з метою тдвищення селективно1 якостi середовищ для видшення C. difficile, проведено вивчення антимшробно1 дiï по вiдношенню до пептострептокоюв та штамiв C. difficile антибютика амоксицилiна, беталактамного препарату широкого спектру ди з групи пенщитшв, який характеризуеться високою активнiстю по вщношенню до анаеробних кокiв i низькою - до штамiв C. difficile. Вивчення антимiкробноï дiï проводили загальноприйнятим методом серiйних розведень у нашврщкому тiоглiколевому середовищi. Результати наведет у таблиц 2.
Таблиця 2. Активтсть амоксицилiна до штамiв Peptostreptococcus spp. та C. difficile
М iнiмальнi iнгiбуючi концентрацiï амоксицилiна
Штами Peptostreptococcus spp М1К (г/л) Штами C. difficile М1К (г/л)
№ 1(музейний) 0,008 № 258 (музейний) 0,032
№ 1( клшчний) 0,016 № 1(клшчний) 0,128
№ 2( клшчний) 0,004 № 2(клшчний) 0,064
№ 3( клiнiчний) 0,008 № 3 (клшчний) 0,064
Отримаш результати дозволили визначити найменший рiвень концентраци антибiотика амоксицилiна (0,016 мг/л), який затримуе рют вшх перевiрених штамiв анаеробних кокiв i не пригшчуе рiст штамiв C. difficile Введення амоксицилiна в кiлькостi 0,016 мг/л до складу запропонованого нами середовища дозволило шдвищити його селективну дда порiвняно з аналогом (табл. 3).
Таблиця 3. Порiвняння складу та селективних якостей запропонованого середовища та середовища Clostridium Difficile Agar (HiMedia, Iндiя) _
Найменування та одинищ вимiру Запропоноване середовище Iндiя; HiMedia; Clostridium difficile Agar Base
Типова формула г/л г/л
1 2 3
Протеаза пептон 40,0 40,0
Пдрофосфат динатрiя 5.0 5.0
Калiя дигидрофосфат 1,0 1,0
Сульфат магшя 0,1 0,1
Хлористий натрiй 2,0 2,0
Фруктоза 6,0 6,0
Агар 15,0 15,0
рН 7,4 ± 0,2 при 25°C 7,4 ± 0,2 при 25°C
Глюкоза 1,0
Вшасол 1,0
Дрiжджовий екстракт 2,0
Продовження таблиц 3.
1 2 3
Циклосерин 0,5 0,5
Цефокситин 0,016 0,016
Амоксицилш 0,016
Колiр середовища блщо-жовтий, прозоре шоколадний коричневий
Контроль якостп
- no3HTHBHHH Komponb: Clostridioides difficile Хороший рют, аро-бшого кольору колони Хороший рют, аро-бшого кольору колони
- HeraTHBHÎ Komponi: Staphylococcus aureus Escherichia coli Shigella flexneri Clostridium perfringens Proteus mirabilis Немае росту Немае росту
Peptococcus Peptostreptococcus Немае росту Рют вщ поодиноких колонiй до помiрного
Як свщчать результати таблищ 3 селективна дiя середовища, що розробляеться була вищою i вщповщала необхiдним вимогам.
З метою виявлення токсин продукуючих штамiв C. difficile вивчалась можливiсть використання запропонованого середовища для постановки реакци преципiтацiï 3i специфiчним антитоксином C. difficile Перевiркою вiдомих твердих середовищ для вирощування C. difficile було встановлено, що проведенню реакцiï iмунопреципiтацiï можуть заважати надмiрна щiльнiсть середовища (кiлькiсть агару бшьше 1,5 %) та наявнють в складi середовищ кров'яних еритроцитарних добавок, якi забарвлюють середовище, або барвниюв (нейтральний червоний та ш.). Склад запропонованого середовища вiдрiзнявся вщ вiдомих аналогiв вiдсутнiстю барвникiв та вмютом агару не бiльше, шж 1,5 %. При дотриманнi цих умов, середовище було придатним для проведення реакцiï преципiтацiï зi специфiчним антитоксином C. difficile (табл. 4).
Таблиця 4. Порiвняльна характеристика розробленого середовища та середовища Clostridium Difficile Selective Agar (Canada)__
Найменування та одиницi вимiру Запропонована корисна модель Canada, USA; BD BBL™; Clostridium difficile Selective Agar
1 2 3
г/л г/л
Протеаза пептон 40,0
Гiдрофосфат динатрiя 5.0
Калiя дигидрофосфат 1,0
Сульфат магнiя 0,1
Хлористий натрш 2,0 2,0
Фруктоза 6,0
Агар 15,0 20,0
рН 7,4 ± 0,2 при 25°C 7,2 ± 0,2
Глюкоза 1,0
Вшасол 1,0
Дрiжджовий екстракт 2,0
Пептичний гiдролiзат тваринно1 тканини 32,0
Маннiт 6,0
Продовження таблиц 4.
1 2 3
Монокалiя фосфат 1,0
Дiнатрiя фосфат 5,0
Фактори росту 3,3
Нейтральний червоний 0,03
Циклосерин 0,5 0,25
Цефокситин 0,016 0,016
Амоксицилш 0,016
Контроль якосп
- no3HTHBHHH Kornponb: Clostridioides difficile Хороший рют, аро-бшого кольору колони Рют вщ помiрного до рясного; вщ блщо-жовтого до яскраво-жовтого
- HeraTHBHÎ Komponi: Staphylococcus aureus Escherichia coli Shigella flexneri Clostridium perfringens Proteus mirabilis Немае росту Немае росту
Peptococcus Peptostreptococcus Немае росту Рют вщ поодиноких колонш до помiрного
Реакщя iмунопреципiтацiï з антитоксином
Позитивний контроль: токсигенний штам Clostridioides difficile Специфiчнi лши прециштаци Неможливють виявлення специфiчних лшш прециштаци
Негативний контроль нетоксигенний штам Clostridioides difficile Вщсутнють специфiчних лшш прециштаци Вщсутнють специфiчних лшш прециштаци
Висновки. Проведет дослщження дозволили шляхом удосконалення комерцiйних середовищ для видшення штамiв C. difficile, розробити склад нового середовища. На B^MiHy вiд iснyючих аналогiв, запропоноване середовище за рахунок оптимально! прозоростi та щшьносп, придатне для детекци токсигенних властивостей штамiв в реакци специфiчноl iмyнопрециmтащl з антитоксином. Запропонований склад середовища для видшення штамiв C. difficile з клшчного матерiалy також мае високу селективну дда.
Дана розробка може бути застосована у ктшчнш лабораторий практицi для видшення чистих культур штамiв C. difficile з клшчного матерiалy та встановлення токсинопродукуючих властивостей, що покращить якють лабораторно! дiагностики CDI.
REFERENCES
1. CDC. Antibiotic Resistance Threats in the United States, 2019. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, CDC. (2019). Retrieved from www.cdc.gov/DrugResistance/Biggest-Threats.html
2. Demihovskaya E. Dvulikiy C. difficile: vozbuditel ezhegodnoy infektsii i ili endogennyiy opportunist kishechnoy mikrofloryi pri antibiotikoterapii. «Bolezni i antibiotiki». № 1(03). 2010. Retrieved from http://www.mif-ua.com/archive/article/14568
3. Clostridium difficile. Robert Koch-Institut: Erstveröffentlichung im Epidemiologischen Bulletin Juni 2009. Retrieved from https://www.rki.de/
4. Cai J, Zhao C, Du Y, Zhang Y, Zhao M, Zhao Q. Comparative efficacy and tolerability of probiotics for antibiotic-associated diarrhea: Systematic review with network meta-analysis. United European Gastroenterol J. 2018 Mar;6(2):169-180. Retrieved from https://doi.org/10.1177/2050640617736987
5. Schäffler H, Breitrück A. Clostridium difficile - From Colonization to Infection. Front Microbiol. 2018 Apr 10; 9:646. Retrieved from https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00646
6. Lessa FC, Mu Y, Bamberg WM, Beldavs ZG, Dumyati GK, Dunn JR, et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 2015;372(9):825-34. DOI: 10.1056/nejmoa1408913
7. Dai, W., Yang, T., Yan, L. et al. Characteristics of Clostridium difficile isolates and the burden of hospital-acquired Clostridium difficile infection in a tertiary teaching hospital in Chongqing, Southwest China. BMC Infect Dis 20, 277 (2020). Retrieved from https://doi.org/10.1186/s12879-020-05014-6
8. Oren, Aharon; Garrity, George M. (2017). "List of new names and new combinations previously effectively, but not validly, published". International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 67 (9): 3140-3143. D0I:10.1099/ijsem.0.002278. PMC 5817221. PMID 28891789.
9. Lawson, Paul A.; Citron, Diane M.; Tyrrell, Kerin L.; Finegold, Sydney M. (August 2016). "Reclassification of Clostridium difficile as Clostridioides difficile (Hall and O'Toole 1935) Prevot 1938". Anaerobe. 40: 95-99. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2016.06.008. ISSN 1095-8274. PMID 27370902.
10. Lobzin Y.V., Kvetnaya A.S., Zhelezova L.I. PEDIATRIC RESEARCH AND CLINICAL CENTER FOR INFECTIOUS DISEASES, ST. PETERSBURG, RUSSIA. Marine Medicine. 2017; 3(1):14-24. (In Russ.) Retrieved from https://doi.org/10.22328/2413-5747-2017-3-1-14-24
11. Solovey NV, Karpov IA, Glaz OC (2013). C. difficile as the primary causative agent of antibiotic-associated diarrhea: current state of the problem [C. difficile kak osnovnoj vozbuditel' antibiotik-assotsiirovannykh diarej: sovremennoe sostoyanie problemy]. Klinicheskaya infektologiya i parazitologiya. Prilozhenie, 102-125.
12. Waligora, A. J., Hennequin, C., Mullany, P., Bourlioux, P., Collignon, A., & Karjalainen, T. (2001). Characterization of a cell surface protein of Clostridium difficile with adhesive properties. Infection and immunity, 69(4), 2144-2153. https://doi.org/10.1128/IAI.69.4.2144-2153.2001
13. Thomas Jank, Torsten Giesemann, Klaus Aktories, Rho-glucosylating Clostridium difficile toxins A and B: new insights into structure and function, Glycobiology, Volume 17, Issue 4, April 2007, Pages 15R-22R. Retrieved from https://doi.org/10.1093/glycob/cwm004
14. Schirmer J, Aktories K. Large clostridial cytotoxins: cellular biology of Rho/Ras-glucosylating toxins. Biochim Biophys Acta. 2004 Jul 6;1673(1-2):66-74. Retrieved from https://doi:10.1016/j.bbagen.2004.03.014. PMID: 15238250
15. Voth, D. E., & Ballard, J. D. (2005). Clostridium difficile toxins: mechanism of action and role in disease. Clinical microbiology reviews, 18(2), 247-263. Retrieved from https://doi.org/10.1128/CMR.18.2.247-263.2005
16. Fiorentini, C., Fabbri, A., Falzano, L., Fattorossi, A., Matarrese, P., Rivabene, R., & Donelli, G. (1998). Clostridium difficile toxin B induces apoptosis in intestinal cultured cells. Infection and immunity, 66(6), 2660-2665. Retrieved from https://doi.org/10.1128/IAI.66.6.2660-2665.1998
17. Carter GP, Chakravorty A, Pham Nguyen TA, Mileto S, Schreiber F, Li L, Howarth P, Clare S, Cunningham B, Sambol SP, Cheknis A, Figueroa I, Johnson S, Gerding D, Rood JI, Dougan G, Lawley TD, Lyras D. Defining the Roles of TcdA and TcdB in Localized Gastrointestinal Disease, Systemic Organ Damage, and the Host Response during Clostridium difficile Infections. mBio. 2015 Jun 2; 6(3): e00551. Doi: 10.1128/mBio.00551-15. PMID: 26037121; PMCID: PMC4453007.
18. Barth H, Aktories K, Popoff MR, Stiles BG. Binary bacterial toxins: biochemistry, biology, and applications of common Clostridium and Bacillus proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 2004 Sep;68(3):373-402, table of contents. DOI: 10.1128/mmbr.68.3.373-402.2004.
19. Volyanskij Yu. L., Chernyavs'kij V. I., Biryukova S. V., Maryushchenko A. M. i dr. Patogennye klostridii. Mikrobiologicheskaya diagnostika klostridial'nyh infekcij. Metodicheskie rekomendacii dlya vrachej i internov po special'nosti «Bakteriologiya». Har'kov. 2013. 60 S
