CC BY
68
М1КР0БЮЛ0Г1Я
УДК 579.852.13: 616.34-002-078
Вороншна I. А., Дяченко В. Ф., Городницька Н. /., Кхедер С. С., Бирюкова С. В.
ПОР1ВНЯЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТ1 ВИД1ЛЕННЯ CLOSTRIDIUM DIFFICILE 3 ДОСЛ1ДЖУВАНОГО МАТЕР1АЛУ В ЕКСПЕРИМЕНТ1 3 Р13НИМИ
ПОЖИВНИМИ СЕРЕДОВИЩАМИ
Державна установа «1нститут л/пкробюлогГГта ¡мунологм ¡м. 1.1. Мечникова Нацюнально'ГакадемГГ медичних наукУкра'Гни» (м. Харкш)
anaerob.lab@ukr.net
Робота е частиною НДР «Удосконалення бакте-рюлопчних метод1в видтення токсигенних штам1в Clostridium difficile» (шифр роботи НАМИ 138/2017, державний реестрацмний номер 0117U002282).
Вступ. Захворювання, пов'язанм з Clostridium difficile ¡нфекщею, представляють собою серйозну проблему для сучасно! медицини. Основною пе-редумовою розвитку цих захворювань вважаеть-ся прийом антибютиюв та ¡нших npenapaTiB, що пригычують нормальну мкрофлору кишювника та сприяють швидкому розвитку клострид1ально'| ¡н-фекци [4,2].
Ентерокол1ти, обумовлеы С. difficile, вважають-ся нозоком1альними захворюваннями, внутршньо-лкарняы випадки можуть мати епщем1чний характер, а при виникнены спалах1в можуть охоплювати до 30% вщ числа Bcix nauieHTiB стацюнару [5]. flia-гноз захворювання встановлюеться за сукупню-тю клш1чно1 картини з ознаками ентерокол1ту або псевдомембранозного кол1ту (ендоскотчно) та за допомогою бактерюлопчних та ¡нших лаборатор-них метод1в д1агностики [1,3]. Найбтьш часто ви-користовують методи ¡муноферментного виявлен-ня антитт до токсиыв С. difficile у фекал1ях (1ФА), ПЛР - для пошуку reHiB, кодуючих продукц1ю токси-HiB, та методи встановлення фермент1в або продук-TiB життед1яльност1 мкрооргаызм1в С. difficile, най-частше - метод визначення глутаматдегщрогенази (ГДГ) [10].
Але Bei nepepaxoBaHi методи мають сво! обме-ження. Так, метод 1ФА мае вщносно невисоку чут-ливють, обумовлену антигенною гетерогеннютю циркулюючих LUTaMiB. Специф1чнють та чутливють р1зних тест-систем 1ФА вар1юють вщ 40 до 100%. Вщм1чаеться, що метод ампл1фкаци ДНК (ПЛР) призводить, в значим Mipi, до пперд1агностики, бо виявлення локуЫв токсигенност1 не завжди ко-релюе з експреЫею цих геыв. Метод визначення ГДГ також може призводити до пперд1агностики в зв'язку з тим, що глутаматдегщрогеназа - це ме-табол1чний фермент, схожий на аналопчы фермен-ти ¡нших клостридм, особливо Clostridium sordelli. Тому цей метод може використовуватись лише як скриншговий [7].
Таким чином, використання культуральних ме-TOfliB виявлення збудника С. difficile та встановлення його токсигенних властивостей не втрачае свое! важпивост1, незважаючи на наявнють р1знихлабо-раторних метод1в д1агностики. Науковими дослг дженнями останых poKiB, спрямованими на nopiB-няльне вивчення р1зних метод1в культивування та ростових якостей поживних середовищ, встанов-лено, що найбтьш ефективним е cnociö терм1чно! обробки досл1джуваного матер1алу з послщуючим BHciBOM на селективне середовище (найчастше циклосерин- цефокситин фруктозний агар) [9].
Мета дослщження. Метою досл1джень було експериментальне пор1вняння р1зних поживних середовищ для найбтьш ефективного видтення С. difficile з ключного матер1алу. У зв'язку з труд-нощами видтення С. difficile (ктьюсть бактерм в кишювнику хворих через наявнють рщких частих випорожнень може значно зменшуватись) було пор1вняно ефективнють виЫву матер1алу з транспортного середовища на селективний агар, або BHciB спочатку на pi3Hi рщю середовища збагачен-ня, a noTiM - на селективний агар. Також вивчалась ефективнють транспортного середовища Еймса для забору та збереження виживаемостт С. difficile протягом 1-5 д\б.
Об'ект i методи досл1дження. Використову-вали TaKi поживы середовища: транспортне середовище Еймса, бульйон Шадпера (Himedia, 1нд1я); бульйон з серцево-мозковою витяжкою модифг кований (Himedia, 1нд1я); селективний циклосерин -цефокситин фруктозний агар - CCFA (ф1рма Himedia), модифкований кров'яний агар.
Пор1внювали pi3Hi схеми культурального видтення С. difficile з досл1джуваного матер1алу: BHciB з транспортного середовища Еймса на CCFA (контроль); з транспортного середовища Еймса на бульйон Шадпера, noTiM на CCFA (схема 1); з транспортного середовища Еймса на бульйон з серце-во-мозковою витяжкою модифкований, noTiM на CCFA (схема 2).
Музейы штами Clostridium difficile № 258, № 281 та клш1чний св1жевидтений штам вирощували 48 годин на модифкованому кров'яному arapi в ана-еробних умовах. Готували мкробы завиЫ 2,0 за
Таблиця 1.
Ефективнють р1зних схем видтення С. difficile
Ктьюсть вирослих колоний (lg КУО/мл) з розведення: 107 105 103
(M ± m) (M ± m) (M ± m)
5LLI,CCFA (схема 1) 4,96" ± 0,24 3,32 + 0,61 2,42 + 0,32
БСМВ, CCFA (схема 2) 5,12" ± 0,34 3,26 + 0,54 2,78 + 0,27
Контроль-CCFA 3,24 + 0,51 Н/Р Н/Р
Мс Farland, робили серю десятикратних розведень у фосфатно-буферному роз-чин! в ¡нтервал1 вщ 107до 103 КУО/мл. 3 цих розведень по 0,1 мл виЫвали на рщю та тверд! поживы середовища згщно вказаних схем, вирощували 48 годин в анаеробних умовах. Вираховували кть-юсть вирослих колонм.
Теплову обробку для Bcix BapiaHTiB вис1ву проводили при 80°С на водянм 6aHi протягом 20хвилин.
Статистичну обробку проводили за ДОПОМОГОЮ програми Microsoft Exel Примггки: БШ - бульйон Шадлера, CCFA-селективний циклосерин-цефокситин 2007. РезуЛЬТЭТИ ПЩрахуНЮВ KmbKOCTi фруктозний агар, БСМВ - бульйон з серцево-мозковою витяжкою модифкований, м1кробнИХ КЖТИН (КУО) було виконано ЯК Н/Р - немае росту, КУО/мл - колон1еутворююч1 одиниц1 в мл., * - р < 0,05 проти MiHiMyM в двох паралельних повторах i трансформовано в десятков! логарифми [8,10].
Результати дослщження та 'Гх об-говорення. Результати пор1вняльно-го вивчення р1зних метод1в видтення Clostridium difficile показали, що при використаны схем з виЫвом на рщю середовища збагачення (схеми 1 та 2) з ycix розведень видтялась досл1джува-на культура в ктькост1 вщ 2,42 ± 0,32 до 5,12 ± 0,34 (lg КУО/мл). При використан-Hi ттьки твердого середовища CCFA до-слщжувана культура виЫвалась лише з найбтьшого розведення - 107 КУО/мл в ктькост1 3,24 ± 0,51 (lg КУО/мл).
При пор1вняны ефективност1 схем 1 та 2 npoMix собою встановлено, що в ycix випадках BiporiflHO значущо! р1зниц1 Mix цими схемами не виявлено. Таким чином, використання перев1рених рщ-ких середовищ збагачення пщвищувало
контролю, M - середне значения кшькост1 вирослих колонм (lg КУО/мл), m -стандартна помилка середнього значения кшькост1 вирослих колонш.
Таблиця 2.
Ефектившсть транспортного середовища Еймса для забору та збереження культур и С. difficile протягом
1-5 fli6
Ктьюсть вирослих колошй lg (M ± m) КУО/мл р1зних штам1в С. difficile-.
Час (год) №258 №281 Кл1н1чний
24 3,28 + 0,24 4,36 + 0,41 4,56 + 0,68
48 3,21 + 0,27 4,24 + 0,37 4,42 + 0,58
72 3,19 + 0,33 4,32 + 0,44 4,38 + 0,53
96 3,16 + 0,31 4,18 + 0,39 4,52 + 0,66
120 3,20 + 0,28 4,22 + 0,43 4,36 + 0,63
1 год (контроль) 3,27 + 0,24 4,37 + 0,36 4,54 + 0,59
Примпжи: * - р < 0,05 проти контролю, КУО/мл - колон1еутворююч1 одиниц1 в мл., M - середне значения кшькост1 вирослих колонм (lg КУО/мл), m - стандартна помилка ефективнють видтення С. difficile 3 ycix середнього значения KmbKOCTi вирослих колошй. розведень. Результати досл1джень наве-
ден! в таблиц! 1.
Ефективнютьтранспортного середовища Еймса для забору та збереження виживаемост1 С. difficile протягом 1-5 д\б вивчали в експеримент1 шляхом внесения м1кробних сумшей музейних штам1в С. difficile N° 258, № 281 та ключного штаму в про-б1рки з середовищем Еймса в юнцевм концентраци 107 КУО на 1 мл. Збер1гали проб1рки при темпера-Typi +4°С та робили виЫви на CCFA, пщраховували ктьюсть вирослих колонм. Результати доогнджень наведем в таблиц! 2.
Висновки. Проведеними досл1дженнями встановлено, що найбтьш ефективною схемою видг лення С. difficile з експериментального матер1алу був nepeciB з транспортного середовища Еймса в рщю середовища збагачення (бульйон Шадлера або бульйон з серцево-мозковою витяжкою), a noTÎM - на циклосерин-цефокситин фруктозний агар. Ефективнють цих схем видтення статистично не вщр1знялась м1ж собою.
На вщмшу вщ використання лише середовища CCFA, схеми видтення з застосуванням рщких середовищ збагачення дозволяли видтяти бактери С. difficile з ycix перев1рених розведень культури.
Перев1рка ефективност1 середовища Еймса для забору та збереження культур С. difficile протягом 1-5 д\б показала, що ктьюсть вирослих колонм статистично не змЫювалась протягом всього тер-MÎHy збереження.
Рекомендацм. Виходячи з вищевказаного, рекомендуемо проводити видтення бактерм С. difficile з експериментального матер1алу за допо-могою рщких середовищ збагачення - бульйону Шадлера або бульйону з серцево-мозковою витяжкою модифкованого з подальшим bhcîbom на циклосерин-цефокситин фруктозний агар.
Середовище Еймса забезпечуе збереження культури С. difficile в кгнычному матер1ал1 протягом 5 д\б.
Перспективи подальших дослщжень. Подал ыш досл1дження будуть спрямоваы на вивчення бюлопчних властивостей штам1в С. difficile, ви-дтених вщ хворих за допомогою використання найбтьш ефективних бактерюлопчних схем, та розробку живильних середовищ для встановлення токсигенно!активное^ збудника.
/Нтература
1. Zinchuk О.М. Suchasni aspecty Clostridium-difficile-infekcii / O.M. Zinchuk, G.L. Stolar 11 Infekciyni chvoroby. - 2014. - № 3. -S. 5-12.
2. Kushnir I.E. Antibiotikoassocijovana diarea /I.E. Kushnir // Liky Ukrainy. - 2008. - № 3 (119). - S. 44-47.
3. Lysuk Ju.S. Pseudomembranosnuy kolit - actualna problema suchasnoi antibiotikoterapii / Ju.S. Lysuk, I.A. Bokotey, O.I. Zanik, V.P. Andruschenco // Kharkivska hirurgichna shkola. - 2012. - № 2 (53). -S. 89-92.
4. Solovey N.V. C. difficile как osnovnoy vozbuditel antibiotiko-associirovannuh diarey: sovremennoe sostoyanie problemy / N.V. Solovey, I.A. Karpov, O.Ch. Glas, O.A. Kotovich //Clinicheskaya infectologia i parazitologia. - 2013. - № 3. - S. 102-119.
5. Howell M.D. Iatrogenic gastric acid suppression and the risk of nosocomial Clostridium difficile infection / M.D. Howell [et al.] // Archives of internal medicine. - 2010. - Vol. 170, № 9. - P. 784-790.
6. Koch A.C. Metods for general and molecular bacteriology / A.C. Koch, D. Gerhardt, R.G.E. Murray [et. al.] // ASM Press Growth measurement. - 1994. - P. 254-257.
7. Novak-Weekley S.M. Clostridium difficile testing in the clinical laboratory by use of multiole testing algorithms / S.M. Novak-Weekley, E.M. Marlowe, J.M. Miller// J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48. - P. 889-893.
8. Paulson D.S. Biostatistics and microbiology: a survival manual / D.S. Paulson // Springer Science and Bussiness Media. - 2008. - P. 100.
9. Tiffany Hink A systematic evaluation of metod to Optimize culture-based recovery of Clostridium difficile from stool specimens/ Tiffany Hink, Carey-Ann D. Burnham, Eric Dubberke //Anaerobe. -2013. - № 19. - P. 39-43.
10. Wilcox M.H. Point-counterpoint. What is the current role of algorithmic approaches for diagnosis of Clostridium difficile infection / M.H.Wilcox, T. Planche, F.C. Fang, P. Gilligan //J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48. - P. 4347-4353.
УДК 579.852.13: 616.34-002-078
ПОР1ВНЯЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТ1 ВИД1ЛЕННЯ CLOSTRIDIUM DIFFICILE 3 ДОСЛ1ДЖУВА-НОГО МАТЕР1АЛУ В ЕКСПЕРИМЕНТ1 3 Р13НИМИ ПОЖИВНИМИ СЕРЕДОВИЩАМИ Воронина I. А., Дяченко В. Ф., Городницька Н. I., Кхедер С. С., Бирюкова С. В. Резюме. Проводили пор1вняльне вивчення ефективност1 видтення Clostridium difficile з доогмджуваного матер1алу в експеримент з р1зними поживними середовищами. Проведеними доогмдженнями встановле-но, що найбтьш ефективною схемою видтення С. difficile з експериментального матер1алу був nepeciB з транспортного середовища Еймса в рщю середовища збагачення (бульйон Шадпера або бульйон з серце-во- мозковою витяжкою), a noTiM - на циклосерин цефокситин фруктозний агар. Ефективнють цих схем видтення статистично не вщр1знялась м1ж собою. На вщмЫу вщ використання лише середовища CCFA, схеми видтення з застосуванням рщких середовищ збагачення дозволяли видтяти бактери С. difficile з ycix пере-в1рених розведень культури.
Проведеними дослщженнями встановлено, що найбтьш ефективною схемою видтення С. difficile з експериментального матер1алу був nepeciB з транспортного середовища Еймса в рщю середовища збагачення (бульйон Шадпера або бульйон з серцево-мозковою витяжкою), a noTiM - на циклосерин-цефокситин фруктозний агар.
На вщмшу вщ використання лише середовища CCFA, схеми видтення з застосуванням рщких середовищ збагачення дозволяли видтяти бактери С. difficile з ycix перев1рених розведень культури.
Перев1рка ефективностт середовища Еймса для забору та збереження культур С. difficile протягом 1 -5 д\б показала, що ктькють вирослих колонм статистично не змЫювалась протягом всього термЫу збереження. Таким чином, середовище Еймса забезпечуе збереження культури С. difficile в ктычному матер1ал1 протягом 5 д\б.
Ключов1 слова: Clostridium difficile, ефективы схеми видтення збудника з дослщжуваного матер1алу. УДК 579.852.13: 616.34-002-078
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ CLOSTRIDIUM DIFFICILE ИЗ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ С РАЗЛИЧНЫМИ ПИТАТЕЛЬНЫМИ СРЕДАМИ Воронкина И. А., Дьяченко В. Ф., Городницкая Н. И., Кхедер С. С., Бирюкова С. В. Резюме. Проводили сравнительное изучение эффективности выделения Clostridium difficile из исследуемого материала в эксперименте с разными питательными средами. Проведенными исследованиями установлено, что наиболее эффективной схемой выделения С. difficile из экспериментального материала был пересев с транспортной среды Эймса в жидкие среды обогащения (бульон Шадпера или бульон с сердечно- мозговой вытяжкой), а потом - на циклосерин- цефокситин фруктозный агар. Эффективность использования этих схем выделения статистически не отличалась между собой. В отличие от использования лишь среды CCFA, схемы выделения с применением жидких сред обогащения позволяли выделять бактерии С. difficile из всех исследованных разведений культуры.
Проведенными исследованиями установлено, что наиболее эффективной схемой выделения С. difficile из экспериментального материала был пересев с транспортной среды Эймса в жидкие среды обогащения (бульон Шадпера или бульон с сердечно-мозговой вытяжкой), а затем - на циклосерин-цефокситин фруктозный агар.
В отличие от использования только среды CCFA, схемы выделения с применением жидких сред обогащения позволяли выделять бактерии С. difficile из всех проверенных разведений культуры.
Проверка эффективности среды Эймса для забора и сохранения культур С. difficile на протяжении 5 суток показала, что количество выросших колоний статистически значимо не изменялось на протяжении всего периода сохранения культуры. Таким образом, среда Эймса обеспечивает сохранение культуры С. difficile в клиническом материале на протяжении 5 суток.
Ключевые слова: Clostridium difficile, эффективные схемы выделения возбудителя из исследуемого материала.
UDC 579.852.13: 616.34-002-078
A COMPARATIVE STUDY OF THE EFFECTIVENESS OF THE ISOLATION OF CLOSTRIDIUM DIFFICILE FROM CLINICAL MATERIAL IN AN EXPERIMENT WITH DIFFERENT NUTRIENT MEDIA
Voronkina I. A., Dyachenko V. F., Gorodnitskaya N. I., KhederS. S.,
Birukova S. V.
Abstract. Diseases associated with Clostridium difficile infection are a serious problem for modern medicine.
The use of culture methods to detect C. difficile pathogen and its toxic properties does not lose its importance, despite the presence of various laboratory methods of diagnosis. Scientific researches of last years aimed at comparative study of different methods of cultivation and growth qualities of nutrient media, it has been established that the method of heat treatment of the researched material with subsequent sowing on a selective medium (most often cycloserine-cefoxitin fructose agar) is most effective.
The purpose of the research was to experimentally compare different nutrient media for the most effective isolation of C. difficile from clinical material. Due to the difficulty of isolating C. difficile (the number of bacteria in the intestines of patients can be significantly reduced due to the presence of liquid frequent feces), the effectiveness of seeding the material from the transport medium on a selective agar was comparable, orfirst hanging in the different liquid media of enriching, and then on selective agar.
Also, the effectiveness of the transport media by Aims for catching and maintaining the survival of C. difficile for 1-5 days was studied.
The effectiveness of the transport media by Aims for catching and maintaining the survival of C. difficile for 1-5 days was studied in the experiment by introducing microbial mixes of the museum strains of C. difficile No. 258, No. 281 and the clinical strain into test tubes by Aims at a final concentration of 107 CFU per 1 ml. They were kept at +4°C and sown on the CCFA, counted the number of grown colonies.
We conducted a comparative study of the effectiveness of the isolation of Clostridium difficile from clinical material in an experiment with different nutrient media. Conducted the comparative study of effectiveness of the isolation of Clostridium difficile from the clinical material in an experiment with different nutrient media. Undertaken studies it is set that the most effective scheme of isolation of C. difficile from clinical material was subculturing from a transport media by Aims in the liquid media of enriching (Schadler broth or modified broth with cardio-brain extraction), and then to selective cycloserin-cefoxitin fructose agar. Effectiveness of these scheme of isolation statistically did not differ inter se. Unlike the use only of solid media of CCFA, the scheme of isolation with the use of liquid media of enriching allowed to distinguish to the bacterium of C. difficile from all tested breeding of culture.
Coming from foregoing, recommend to conduct the isolation of bacteria of C. difficile from clinical material by means of the use of liquid media of enriching - Schadler broth or modified broth with cardio-brain extraction with the further sowing on cycloserin-cefoxitin fructose agar.
Testing the effectiveness of the transport media by Aims for catching and maintaining the survival of C. difficile for 1-5 days was showed that the number of grown colonies has not statistically changed throughout the shelf- life.
Thus, the transport media by Aims ensures the preservation of culture of C. difficile in clinical material for 5 days.
Keywords: Clostridium difficile, effective schemes of isolation of strains of C. difficile from the researched material.
Рецензент - проф. Лобань Г. М.
Стаття надшш ла 19.08.2017 року
