CC BY
18
УДК 579.852.1.001.76.8.004.4 405
УДОСКОНАЛЕННЯ МЕТОД1В ДОВГОТРИВАЛОГО ЗБЕР1ГАННЯ М1КРООРГАН1ЗМ1В
РОДУ CLOSTRIDIUM
Мета: удосконалення способу укладання музейних штамiв анаеробних мкрооргашз]шв та nepeBipKa ix життездатносп у процесi тривалого зберiгання. Методи: дослщження проводили i3 застосуванням мкроскотчинх, бактерiологiчниx та бiоxiмiчниx методiв. Результати: у робой запропоновано технолопю приготування шкапсульованих зразкiв музейних еталонних штамiв анаеробних мiкроорганiзмiв роду Clostridium, яю мають дiагностичне та промислове значення. Встановлено високу життездатшсть зi збереженими вихщними бiологiчними властивостями еталонних культур анаеробних бактерш у процесi тривалого збертання. Висновок. Доведено перспективнiсть застосування запропонованоi' методики виготовлення зразкiв музейних еталонних штамiв анаеробних мiкроорганiзмiв з метою тривалого збертання культур у мжробюлопчинх лабораторiяx.
Ключов! слова: анаеробш бактерп, збертання, життездатшсть.
Довготривале зберпання р1зних вид1в спороутворюючих анаеробних м1кроорган1зм1в з1 збереженням i'x вихщних характеристик мае важливе практичне значення у процес виготовлення 1муноб1олог1чних препарапв, та е актуальною проблемою при шдтриманш колекцшних зразюв культур у депозитар1ях [4].
Так, при культивуванш вакцинних штам1в м1кроорган1зм1в роду Clostridium в бшьшосп випадкiв сто'ть завдання одержання не тiльки бiомаси, але i велико' кiлькостi активного продукту бюсинтезу - токсину, що гарантуе повнощнну iмунну вiдповiдь. Лiофiлiзацiя як ефективний спошб зберiгання музейних культур анаеробних бактерш в незмшному сташ (бiльше 30 рокiв) не завжди може бути використаний у зв'язку з вщсутшстю спецiального обладнання в мшробюлопчних лабораторiяx лiкувально-профiлактичниx закладiв та науково-дослщних установ [1, 2].
Тому велике значення надаеться розробцi нових методiв зберiгання музейних штамiв в умовах дiагностичниx лабораторiй та науково-дослщних установ, якi мають дозвiл на роботу з мшрооргашзмами Ш-1У груп патогенност [6].
Метою роботи було удосконалення способу укладання музейних штамiв анаеробних мiкроорганiзмiв та перевiрка i'x життездатностi у процесi тривалого зберпання.
Матерiал та методи дослщження. Вiдомий спосiб тривалого зберiгання кттин живо' тканини, iндивiдуальниx клiтин (кл^ин Лангерганса, гепатоцитiв, еритроцитiв, ферментiв та ш.) автора Франклiна Лiма (United States Patent № 24600), який полягае в шкапсуляци бюлопчного матерiалу з утворенням напiвпроникноi' мембрани i здiйснюеться шляхом суспендування останнього в розчиш альгiнату натрiю, який характеризуеться стабiлiзуючими та желеподiбними властивостями.
При внесенш зазначено' суспензи у розчин хлориду кальщю (iнiцiатор полiмеризацii') утворюються желеподiбнi краплi-капсули, що мiстять бiоматерiал. Приклади застосування дано' методики описанi тшьки для деяких видiв бiологiчного матерiалу без зазначення оптимального термiну тривалого зберпання [7].
Данi експериментальних дослiджень свiдчать, що використання хлориду кальщю як шщатора полiмеризацii' часто призводить до осмотичного лiзису бактерiальниx клiтин. Нами запропоновано застосування лактату кальщю замють хлориду кальцiю в якост iнiцiатора полiмеризацii', оскiльки при цьому створюються найбшьш оптимальнi умови, наближеш до фiзiологiчниx, для шдтримання життедiяльностi як мiкробниx клiтин, так i взагалi будь-яких iндивiдуальниx кттин (еритроцити, лiмфоцити) макроорганiзму. Лактат кальщю е бшьш "м'якою" кращою сполукою як фактор живлення для мiкроорганiзмiв.
Виготовлено зразки музейних штамiв рiзниx видiв анаеробних мiкроорганiзмiв, що мають промислове та дiагностичне значення (Clostridium acetobutylicum 524, C. acetobutylicum 780, C.perfringens 27, C. novyi 198, C.sporogenes 275) [5]. Дослщ проводили у кшька етапiв у стерильних умовах. Для роботи пiдготовлено стерильний посуд, флакони, разовi стерильнi
шприци, голки. На початковому еташ вирощували культури вище зазначених видiв м1крооргашзм1в, внесет у флакони з тюглшолевим середовищем (виробництва bioMerieux, Францiя), при 37°С в анаеростатi протягом 2-3 дiб.
Для контролю чистоти кожно! культури паралельно проводили засiв !! на 2 чашки Петр1 з кровяним агаром, з яких одну клали в анаеростат, а одну для шкубаци при 37°С в термостат. Готували розчин альгiнату натрiю (NaC6H7O6), який у кiлькостi 2,0 г розчиняли у 100,0 мл тридистильовано! води на водянiй банi. Наступний етап - приготування 0,1N розчину лактату кальщю (Ca (С3Н5О3) 5Н2О). Останнш в кiлькостi 3,85 г розчиняли у 250,0 мл тридистильовано! води. Обидва рочини стерилiзували шляхом автоклавування при 121°С 20 хвилин.
В асептичних умовах культуру кожного виду анаеробних мiкроорганiзмiв iнокулювали у стерильний розчин альпнату натрiю у сшввщношенш 1:1 та з використанням стерильних голок для пункци вносили у флакони зi стерильним розчином лактату кальщю, що супроводжувалося пол1меризащею бактерiйного матерiалу та утворенням гелевих м1крокульок. В подальшому iнкапсульованi культури було внесено в стерильш епендорфи та закладено для тривалого зберпання в температурних умовах -70°С.
Через 3, 6, 9, 12 та 15 мюящв капсули культур розчиняли в 0,1 N розчиш лимонно! кислоти, який готували шляхом додавання 0,19 г кристалiв лимонно! кислоти до 1,0 л стерильно! дистильовано! води, та здшснювали засiв у пробiрки з тiоглiколевим середовищем. В подальшому проводили перешв у напiврiдкий 0,5 % цукровий поживний агар (ЦА) та вис1в на глюкозо-кров'яний агар Цейслера з наступною шкубащею в анаеростатi при 37°С. Культури анаеробiв дослiджували за культуральними, морфолопчними, тинкторiальними, бiохiмiчними властивостями [2]. Для перевiрки токсигенностi штамiв C.perfringens 27, C. novyi 198 проводили бюлопчну пробу шляхом пiдшкiрного введення бшим мишам добово! культури зазначених штамiв в дозi 0,2 мл [3].
Результати дослщження та Тх обговорення. Перевiрка ростових властивостей експериментальних зразюв музейних штамiв анаеробних мiкроорганiзмiв, що мають промислове та дiагностичне значення Clostridium acetobutylicum 524, C. acetobutylicum 780, C.perfringens 27, C. novyi 198, C.sporogenes 275 через 3, 6, 9, 12 та 15 мюящв, що зберпались в шкапсульованому вид при температурi -70° С показала високу життездатнють вс1х дослщжуваних штамiв (таблиця 1).
Таблиця 1
Результати росту анаероб1в на поживних середовищах_
№ п/п Результати nociBy на наявшсть aHaepoöiB Мжроскотя, забарвлення за Грамо
Тюглколеве середовище 0,5 % цу^овий arap
1. Clostridium acetobutylicum 524 picT колонй у виглядi пушинок Грампозитивнi палички iз субтермiнальними спорами
2. Clostridium acetobutylicum 780 picT колонй у виглядi пушинок Грампозитивнi палички iз субтермiнальними спорами
3. C.perfringens 27 picT R-колонй у виглядi комочюв вaти Грампозитивнi палички iз центральними спорами
4. C. novyi 198 picT колонй у виглядi чечевищ Грампозитивнi палички iз субтермiнальними спорами
5. C.sporogenes 275 picT колонй у виглядi чечевицi Грампозитивнi палички iз субтермiнальними спорами
1нтенсивний рiст культур анаеробiв на тiоглiколевому середовищi спостерпався вже на другу добу. Через 2 — 3 доби у стовпчиках 0,5 % цукрового поживного агару виростали ясно видимi вiзуально колони мiкробiв-анаеробiв у виглядi чечевищ та пушинок. На глюкозо-кров'яному агарi Цейслера виявлено характернi для кожного виду колони, школи оточеш зоною гемолiзу (С. иоуу1 198, С.регйп^е^ 27). В мазках, забарвлених за Грамом, культури мали типовi для штамiв морфологiю: грампозитивнi палички iз закругленими кiнцями, розташованi поодинщ, або в ланцюжках з 3 — 5 паличок, овальними спорами, розмiщеними субтермiнально або центрально (С.регй-^е^ 27).
За бiохiмiчними властивостями, якi вивчали за здатнютю ферментувати глюкозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, машт, салiцин, використанi в експериментальнш роботi штами були типовими. Пщшюрне введення добових культур С. иоуу1 198 i C.perfringens 27 бшим мишам в дозi 0,2 мл викликало загибель тварин через 20 годин.
Отже, в результат проведених етапiв оживлення, пасажування зазначених штамiв встановлено високу життeздатнiсть цих культур, що свщчить про перспективнiсть застосування у
мшробюлопчних лабораторiях методики виготовлення шкапсульованих зразюв музейних штамiв анаеробних MÎKpoopraHi3MÎB для ïx тривалого зберiгання.
Запропонована теxнологiя довготривалого зберiгання рiзниx видiв спороутворюючих анаеробних мiкроорганiзмiв 3i збереженням ïx вихщних характеристик мае важливе практичне значення у процесi виготовлення iмунобiологiчниx препараив, та е надзвичайно актуальною при шдтриманш колекцiйниx зразкiв культур у депозитарiяx.
1. Встановлено високу життездатшсть зi збереженими виxiдними бiологiчними властивостями шкапсульованих зразюв еталонних культур анаеробних бактерш роду Clostridium у процесi тривалого зберiгання.
2. Доведено перспективнють застосування запропонованоï методики виготовлення зразюв музейних еталонних штамiв анаеробних мiкроорганiзмiв, що мають промислове та дiагностичне значення, з метою тривалого зберпання культур у мiкробiологiчниx лабораторiяx.
1. Акименко Л.1. Методика видiлення, щентифкацй та довгострокового зберiгання штамiв ]шкрооргашз]шв роду Clostridium / Л.1. Акименко, Д.О. Котляр, Н.С. Палiйчук // М - Ки!в: Товариство "Знания" Укра!ни. - Вип.2 - 2001. - С.69-76.
2. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии / Ф.Герхардт [и др.] // - М.: Мир. - Т.1. - 1983. - С.517-533.
3. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А. С. Лабинская // - М.: Медицина, - 1978. - С. 54 - 56.
4. Наказ МОЗ Укра!ни вщ 14.01.2004 р. за № 5 "Про затвердження порядку одержання, облжу, зберпання та утримання тест-штамiв мiкрооргаиiзмiв для проведення контролю якост лжарських засобiв за мжробюлопчними показниками".
5. Полiщук О. I. Каталог культур Музею патогенних для людини мiкрооргаиiзмiв // О. I. Полщук, О. I. Брич, Ж. Е. В'ялих [та ш.] // - К.: Знання Укра!ни, - 2006. - 144 с.
6. Пшчук Н.Г. Розробка технологи довготривалого збертання бактерш з використанням методу сорбцшно-контактного зневоднення // Автореферат на здоб. наук. ступ. канд. вет.наук: 16.00.03. - Нац. наук. центр "1н-т експерим. i клшч. вет. медицини". - Харюв, - 2008. - 20 с.
7. United States Patent № 24600. Encapsulation of biological material // Franklin Lim, Richmond, Va. / C12N 11/10; C12N 11/04; C12N 5/00. Oct. 5, - 1982.
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА CLOSTRIDIUM Брич О.И., Синетар Э.А., Черненко В.Ю.
В paботе уcовеpшенcтвовaн ототоб уктадки музейных штaммов aнaэpобных микpооpгaнизмов и пpовеpкa их жизнеcпоcобноcти в пpоцеccе дательного хpaнения. Методы: иccледовaние пpоводили c пpименением микpоcкопичеcких, бaктеpиологичеcких и биохимичеcких методов. Результaты: в paботе пpедложенa технология пpиготовления инкaпcулиpовaнных обpaзцов музейных этaлонных штaммов aнaэpобных микpооpгaнизмов pодa Clostridium, котоpые имек^ диaгноcтичеcкое и пpомышленное знaчение. Уcтaновленa выcокaя жизнеcпоcобноcть c cохpaненными входными биологичеcкими cвойcтвaми этaлонных культуp aнaэpобных бaктеpий в пpоцеccе длительного хpaнения. Вывод. Докaзaнa пеpcпективноcть пpименения ^едложенной методики изготовления обpaзцов музейных этaлонных штaммов aнaэpобных микpооpгaнизмов c целью дательного хpaнения культуp в микpобиологичеcких лaбоpaтоpиях.
Ключевые слова: aнaэpобные бaктеpии, хpaнение, жизнеcпоcобноcть.
Стaття нaдiйшлa 9.10.2015 p.
IMPROVED METHODS OF LONG-TERM STORAGE OF MICROORGANISMS OF THE GENUS CLOSTRIDIUM
Brych O.I., Synetar E.A., Chernenko V.J.
In research improved the method of stacking museum strains of anaerobic microorganisms and test their viability in the long-term storage. Methods: The study was conducted with the use of microscopic, bacteriological and biochemical methods. Results: The technology in the preparation of encapsulated samples museum reference strains of anaerobic microorganisms genus Clostridium, which are diagnostic and industrial importance was offered. The high viability with preserved original biological properties of reference cultures of anaerobic bacteria in the long-term storage established. Conclusion. Proved promising application of the proposed method sample making museum reference strains of anaerobic organisms with a view to long-term storage of cultures in microbiological laboratories.
Key words: anaerobic bacteria, storage, viability/
Рецензент Кущ О.Г.
