CC BY
26
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Т-клеток CD4-фенотипа и CD8-фенотипа, при этом обнаружил увеличение численности естественных регуля-торных Т-лимфоцитов CD4+CD25+ фенотипа, основная функция которых заключается в обеспечении толерантности на периферии.
Заключение. Таким образом, подавление синтеза ка-техоламинов в критический период формирования тимуса (Э16-Э17) приводит к долгосрочным изменениям в Т-системе иммунитета, обусловленным усилением продукции естественных регуляторных Т-лимфоцитов. Присутствие и функциональная активность в тимусе плодов рецепторов к дофамину Д1, Д2, Д3 и Д5 типов свидетельствует в пользу того, что именно дофамин ответственен за описанные эффекты, и подтверждает возможность прямого влияния дофамина на формирование тимуса.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-04-00031.
ЭКСПРЕССИЯ КОМПОНЕНТОВ МОНОАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В РАЗВИВАЮЩЕМСЯ ТИМУСЕ
Лифанцева Н.В., Конеева Ц.О., Мельникова В.И.
ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, Москва, Россия
Введение. Исследование роли моноаминов в прена-тальном развитии имеет особое значение, поскольку при формировании различных структур плода реализуются эпигенетические механизмы, обеспечивающие адаптационную пластичность всех систем организма. Ранее было показано, что дефицит серотонина или дофамина в период активного формирования тимуса у плодов крыс приводит к необратимым морфогенетическим изменениям в функционировании Т-клеточного звена иммунитета в постнатальной жизни. Однако механизмы такого действия моноаминов остаются невыясненными. У половозрелых животных все компоненты моноаминергической системы (синтез, захват, рецепторы) тем или иным образом задействованы в модуляции иммунных реакций. Возможность синтеза моноаминов и их захвата в клетках иммунной системы, а также экспрессия рецепторов в пренатальном онтогенезе не изучены.
Цель и задачи. В настоящей работе исследовали возрастную динамику экспрессии рецепторов к серотонину и дофамину, а также возможность синтеза и транспорта моноаминов в клетках тимуса у плодов крыс.
Материалы и методы. Возрастную динамику экспрессии рецепторов к серотонину и дофамину, в тимусе оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией у плодов, начиная с 15-го дня эмбрионального развития (Э15). Экспрессию молекул-транспортеров и ферментов синтеза серотонина и дофамина исследовали методами ПЦР и Вестерн-блоттинга. Способность тимоцитов на 18-й эмбриональный день к захвату внеклеточных моноаминов оценивали с помощью конфокальной микроскопии живых клеток, которые инкубировали с флуоресцирующим субстратом транспортеров моноаминов (ASP+ 10-7 М) в присутствии или без селективных блокаторов захвата серотонина (флюок-сетин 10-5 М) или дофамина (GBR-12909 10-5 М).
Результаты. В тимусе плодов, начиная с Э15-Э16, обнаружена мРНК рецепторов к серотонину (5-НТ-1а, 5-НТ-1Ь-, 5-НТ-2а, 5-НТ-2Ь и 5-НТ-7) и рецепторов к дофамину ф1, D2, D3, D5). Ферменты синтеза серотонина и дофами-
на — триптофангидроксилаза, тирозингидроксилаза и де-карбоксилаза ароматических аминокислот выявлены в тимусе плодов начиная с 16-го дня с помощью методов ПЦР и Вестерн-блоттинга. Инкубация эмбриональных тимусов (Э18) ex vivo в присутствии предшественников серотонина и дофамина (триптофана или тирозина) с последующим иммуногистохимическим выявлением серотонина или дофамина, соответственно, позволила подтвердить функциональную активность обнаруженных ферментов. Подавление транспорта ASP+ в клетки тимуса (Э18) в присутствии селективных ингибиторов транспорта серотонина и дофамина доказывает способность клеток эмбрионального тимуса активно захватывать внеклеточные моноамины.
Заключение. Таким образом, в развивающемся тимусе плодов крыс присутствуют и функционально активны все компоненты серотонинергической и дофаминерги-ческой систем (синтез, транспорт, рецепторы), что подтверждает возможность прямого влияния моноаминов на формирование тимуса. Существование локальной моно-аминергической системы в эмбриональном тимусе, наряду с высоким уровнем моноаминов в крови плодов, свидетельствует о возможности реализации эффектов моноаминов как через паракринные, так и через эндокринные механизмы, а также позволяет предположить различные функции внутритимического и циркулирующего пулов моноаминов в регуляции развития тимуса.
РОЛЬ ПРОТЕАСОМ И ШАПЕРОНОВ В РЕАКТИВНОСТИ МНОГОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ ВИРУСАМИ И ПАТОГЕНАМИ
Люпина Ю.В., Становова М.В., Ерохов П.А., Абатурова С.Б., Горностаев Н.Г., Михайлов В.С., Шарова Н.П.
ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, Москва, Россия
Реактивность при воздействии неблагоприятных факторов у многоклеточных организмов является ключевым звеном в их способности к адаптации. Протеолитическая активность протеасом, их полипептидный состав и физико-химические свойства, регулируются в соответствии с состоянием клеток и действии внеклеточных сигналов. Целью настоящей работы было выяснение особенностей функционирования убиквитин-протеасомной системы (УПС) и шаперонов при индукции бактериальной или вирусной инфекции в клетках беспозвоночных и млекопитающих, а именно: у эволюционно удаленных классов беспозвоночных, в целомоцитах кольчатых червей Arenicola marina (кл. Polychaeta) и Sf 9 клетках кукурузной листовой совки Spodoptera frugiperda (кл. Insecta), и в клетках ЦНС и лимфоидных органов у крыс. Клетки Sf9 были ифици-рованы бакуловирусом AcMNPV, воспаление у кольчатых червей и крыс вызывалось инъекцией липополисахарида. Реакцию УПС и шаперонов в клетках оценивали через 30 мин, 1 час, 6 часов и 24 часа после инфицирования. Для определения характеристик пулов протеасом и изменения соотношения различных форм при инфицировании у беспозвоночных и млекопитающих изучены на-тивные формы протеасом методом модифицированного нативного фореза и определено содержание 20S- и 26S форм протеасом, а также их регуляторов с помощью метода Вестерн-блоттинга и специфичных антител в осветленные экстрактах из целомоцитов аннелид, Sf9 клеток
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
насекомых, а также клеток печени, селезенки и отделов головного мозга крыс. Содержание иммунных протеасом в клетках у крыс выявлялось с использованием антител к иммунным субъединицам LMP7 и LMP2. Определение химотрипсин- и каспазаподобной активностей протеа-сом в осветленных гомогенатах выявлялось по скорости деградации специфического флуорогенного олигопепти-да N-Succmyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-methylcoumarm и Z-Leu-Leu-Glu-7-amido-4-methylcoumarin, которые утилизируются химотрипсин- и каспазаподобными центрами протеасом, соответственно. Вклад примесных активностей оценен с помощью конкурентного ингибитора протеасом, MG132. Роль протеасомных механизмов в регуляции воспаления изучена при фармакологическом воздействии специфических ингибиторов активности протеасом (бортезомиба). Распределение протеасом по клеткам было исследовано методом иммунофлуоресцен-ции. Уровень регуляторов экспрессии иммунных субъединиц протеасом — белков шаперонов HSP/HSC70 оценен методом Вестерн-блоттинга с применением специфических антител. В клетках Sf9, в целомоцитах аннелид и в клетках изученных органов у крыс при инфицировании возрастало содержание индуцибельных белков теплового шока HSP70. Впервые была изучена нативная структура протеасом в целомоцитах кольчатых червей и Sf9 клетках насекомых с помощью модифицированного метода двумерного электрофореза для грубых фракций протеасом, первое направление которого выполняется в нативных условиях, что позволяет дифференцировать множественные формы протеасом. В ходе работы выделены протеасо-мы из клеток насекомых и изучен их полипептидный состав методами протеомного анализа (двумерный электрофорез в полиакриламидном геле и масс-спектрометрия). При электрофорезе в полиакриламидном геле в нативных условиях экстрактов клеток S. frugiperda, также клеток исследованных органов крыс, протеолитическая активность выявляется во фракциях 26S (комплекс CP и RP) и 20S протеасом (CP), ассоциированных с различными активаторами. В целомоцитах кольчатых червей A. marina протеасомы были представлены преимущественно формой 20S. Инфекция бакуловирусом AcMNPV не приводила к значимому изменению субъединичного состав протеасом клеток S. frugiperda. В клетках печени и коры головного мозга у крыс наблюдалась диссоциация активаторов в пулах 26S и 20S протеасом через 1 и 6 часов после инфицирования. При воспалении, вызванном введением липополисахарида, форма 26S в целомоци-тах аннелид полностью исчезает, а электрофоретическая подвижность фракции 20S протеасом возрастает, что вероятно отражает изменение их субъединичного состава и диссоциацию активаторов протеасом. В клетках исследованных нами организмов при инфицировании наблюдается возрастание химотрипсинподобной активности протеасом, которое ингибируется введением бортезомиба. Таким образом, изменения в тонкой структуре протеасом и активация шаперонов являются молекулярной основой для реактивности при инфицировании вирусами и патогенами у многоклеточных организмов.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 16-04-00454.
КУПИРОВАНИЕ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ ПАТТЕРНОВ ДЕПРЕССИВНО-ПОДОБНОГО СОСТОЯНИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ МОДУЛИРОВАННЫХ ПСИХОАКТИВНЫМ ВЕЩЕСТВОМ ИММУННЫХ КЛЕТОК
Маркова Е.В. \ Княжева М.А1, Савкин И.В.1, Тихонова М.А.2, Амстиславская Т.Г.2
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», Новосибирск, Россия
2 ФНГБУ«Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицинь», Новосибирск, Россия
Введение. Нарушение нейроиммунного взаимодействия является существенным звеном в патогенезе поведенческих расстройств, оказывая негативное влияние на их течение, утяжеляя клиническую картину, снижая эффективность терапии; в силу чего актуальным является поиск новых подходов к их лечению. Однонаправленное влияние большинства психоактивных препаратов на ЦНС и иммунную систему позволяет рассматривать иммунные клетки в качестве модельных объектов для воздействия на межсистемную функциональную взаимосвязь. Имеется достаточный массив данных о существенной роли им-мунокомпетентных клеток и их биологически активных продуктов в патогенезе депрессии, что обуславливает возможность и перспективность иммунотерапии указанного состояния аутологичными иммуноцитами с модулированной экстракорпорально психоактивными веществами функциональной активностью. Ранее нами была показана возможность и механизмы стимуляции пассивного типа поведения у экспериментальных животных трансплантацией спленоцитов, с модулированной in vitro кофеином функциональной активностью.
Цель. Исследование влияния трансплантации иммунных клеток, функциональная активность которых была изменена предварительной экстракорпоральной обработкой кофеином, на поведенческие паттерны депрессивно-подобного состояния, индуцированного у экспериментальных животных длительным социальным стрессом.
Материалы и методы. В качестве доноров и реципиентов использовались мыши (CBAxC57BL/6)F1, в возрасте 3-х месяцев, c пассивным типом поведения в «открытом поле», у которых было сформировано депрессивно-подобное состояние методом сенсорного контакта с опытом 10-кратных ежедневных поражений в межсамцовых конфронтациях с доминирующим партнером. Иммунные клетки для трансплантации получали в стерильных условиях из суспензии спленоцитов, обрабатывали in vitro кофеином и внутривенно вводили сингенным реципиентам. В контрольной группе животных подготовка и трансплантация иммунных клеток проводилась в аналогичных условиях эксперимента, за исключением того, что последние культивировались без присутствия кофеина. У реципиентов через 48 часов после трансплантации оценивались параметры поведения в тесте «открытое поле», в тесте принудительного плавания по Порсолту, выраженность ангедонии, содержание ряда регуляторных цитокинов в патогенетически значимых для депрессивного состояния структурах головного мозга.
Результаты. Трансплантация иммунных клеток с модулированной кофеином функциональной активностью
