CC BY
23
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
насекомых, а также клеток печени, селезенки и отделов головного мозга крыс. Содержание иммунных протеасом в клетках у крыс выявлялось с использованием антител к иммунным субъединицам LMP7 и LMP2. Определение химотрипсин- и каспазаподобной активностей протеа-сом в осветленных гомогенатах выявлялось по скорости деградации специфического флуорогенного олигопепти-да N-Succmyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-methylcoumarm и Z-Leu-Leu-Glu-7-amido-4-methylcoumarin, которые утилизируются химотрипсин- и каспазаподобными центрами протеасом, соответственно. Вклад примесных активностей оценен с помощью конкурентного ингибитора протеасом, MG132. Роль протеасомных механизмов в регуляции воспаления изучена при фармакологическом воздействии специфических ингибиторов активности протеасом (бортезомиба). Распределение протеасом по клеткам было исследовано методом иммунофлуоресцен-ции. Уровень регуляторов экспрессии иммунных субъединиц протеасом — белков шаперонов HSP/HSC70 оценен методом Вестерн-блоттинга с применением специфических антител. В клетках Sf9, в целомоцитах аннелид и в клетках изученных органов у крыс при инфицировании возрастало содержание индуцибельных белков теплового шока HSP70. Впервые была изучена нативная структура протеасом в целомоцитах кольчатых червей и Sf9 клетках насекомых с помощью модифицированного метода двумерного электрофореза для грубых фракций протеасом, первое направление которого выполняется в нативных условиях, что позволяет дифференцировать множественные формы протеасом. В ходе работы выделены протеасо-мы из клеток насекомых и изучен их полипептидный состав методами протеомного анализа (двумерный электрофорез в полиакриламидном геле и масс-спектрометрия). При электрофорезе в полиакриламидном геле в нативных условиях экстрактов клеток S. frugiperda, также клеток исследованных органов крыс, протеолитическая активность выявляется во фракциях 26S (комплекс CP и RP) и 20S протеасом (CP), ассоциированных с различными активаторами. В целомоцитах кольчатых червей A. marina протеасомы были представлены преимущественно формой 20S. Инфекция бакуловирусом AcMNPV не приводила к значимому изменению субъединичного состав протеасом клеток S. frugiperda. В клетках печени и коры головного мозга у крыс наблюдалась диссоциация активаторов в пулах 26S и 20S протеасом через 1 и 6 часов после инфицирования. При воспалении, вызванном введением липополисахарида, форма 26S в целомоци-тах аннелид полностью исчезает, а электрофоретическая подвижность фракции 20S протеасом возрастает, что вероятно отражает изменение их субъединичного состава и диссоциацию активаторов протеасом. В клетках исследованных нами организмов при инфицировании наблюдается возрастание химотрипсинподобной активности протеасом, которое ингибируется введением бортезомиба. Таким образом, изменения в тонкой структуре протеасом и активация шаперонов являются молекулярной основой для реактивности при инфицировании вирусами и патогенами у многоклеточных организмов.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 16-04-00454.
КУПИРОВАНИЕ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ ПАТТЕРНОВ ДЕПРЕССИВНО-ПОДОБНОГО СОСТОЯНИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ МОДУЛИРОВАННЫХ ПСИХОАКТИВНЫМ ВЕЩЕСТВОМ ИММУННЫХ КЛЕТОК
Маркова Е.В. \ Княжева М.А1, Савкин И.В.1, Тихонова М.А.2, Амстиславская Т.Г.2
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», Новосибирск, Россия
2 ФНГБУ«Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицинь», Новосибирск, Россия
Введение. Нарушение нейроиммунного взаимодействия является существенным звеном в патогенезе поведенческих расстройств, оказывая негативное влияние на их течение, утяжеляя клиническую картину, снижая эффективность терапии; в силу чего актуальным является поиск новых подходов к их лечению. Однонаправленное влияние большинства психоактивных препаратов на ЦНС и иммунную систему позволяет рассматривать иммунные клетки в качестве модельных объектов для воздействия на межсистемную функциональную взаимосвязь. Имеется достаточный массив данных о существенной роли им-мунокомпетентных клеток и их биологически активных продуктов в патогенезе депрессии, что обуславливает возможность и перспективность иммунотерапии указанного состояния аутологичными иммуноцитами с модулированной экстракорпорально психоактивными веществами функциональной активностью. Ранее нами была показана возможность и механизмы стимуляции пассивного типа поведения у экспериментальных животных трансплантацией спленоцитов, с модулированной in vitro кофеином функциональной активностью.
Цель. Исследование влияния трансплантации иммунных клеток, функциональная активность которых была изменена предварительной экстракорпоральной обработкой кофеином, на поведенческие паттерны депрессивно-подобного состояния, индуцированного у экспериментальных животных длительным социальным стрессом.
Материалы и методы. В качестве доноров и реципиентов использовались мыши (CBAxC57BL/6)F1, в возрасте 3-х месяцев, c пассивным типом поведения в «открытом поле», у которых было сформировано депрессивно-подобное состояние методом сенсорного контакта с опытом 10-кратных ежедневных поражений в межсамцовых конфронтациях с доминирующим партнером. Иммунные клетки для трансплантации получали в стерильных условиях из суспензии спленоцитов, обрабатывали in vitro кофеином и внутривенно вводили сингенным реципиентам. В контрольной группе животных подготовка и трансплантация иммунных клеток проводилась в аналогичных условиях эксперимента, за исключением того, что последние культивировались без присутствия кофеина. У реципиентов через 48 часов после трансплантации оценивались параметры поведения в тесте «открытое поле», в тесте принудительного плавания по Порсолту, выраженность ангедонии, содержание ряда регуляторных цитокинов в патогенетически значимых для депрессивного состояния структурах головного мозга.
Результаты. Трансплантация иммунных клеток с модулированной кофеином функциональной активностью
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
вызывала у реципиентов в депрессивно-подобном состоянии стимуляцию двигательной и исследовательской активностей в «открытом поле»; существенное увеличение временных периодов мобильности в тесте принудительного плавания и снижение ангедонии, считающейся главным признаком депрессии в экспериментальных моделях, выявляемое по предпочтению потребления раствора сахарозы (в процентном отношении от общего количества потребляемой жидкости) по сравнению с контрольной группой животных (87,8±2,0 и 67,5±4,8 соответственно; р < 0,05). Различия по указанным показателям между контрольной и опытной группами реципиентов регистрировались в течение 8-10 дней после клеточной трансплантации и были ассоциированы со стимуляцией нейрогенеза в гиппокампе. У животных в депрессивно-подобном состоянии после внутривенного введения иммунных клеток, обработанных in vitro кофеином, наблюдалось также изменение содержания ряда ре-гуляторных цитокинов в патогенетически значимых для депрессивно-подобного состояния структурах головного мозга, преимущественно в сторону снижения провоспа-лительных цитокинов: в гиппокампе выявлено снижение IL-6, IFNy и повышение IL-10; в гипоталамусе — снижение IL-ip, IL-6, IFNy; в префронтальной коре — снижение IFNy.
Заключение. Представленные результаты демонстрируют позитивный эффект трансплантации модулированных кофеином иммунных клеток, проявляющийся в купировании поведенческих паттернов депрессивно-подобного состояния у экспериментальных животных путем воздействия на патогенетические механизмы депрессии.
КОНЦЕНТРАЦИЯ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МАКАК-РЕЗУСОВ В СРАНИТЕЛЬНО ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ
Матуа А.З., Шевцова З.В., Трапш Х.З., Амаба С.Т.
Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии АНА, Сухум, Абхазия
Введение. Обезьяны, как известно, являются наиболее адекватным экспериментальным объектом для решения задач экспериментальной биологии и медицины, вследствие биологического сходства с человеком (Лапин Б.А. и соавт., 1987, 2004; Фридман Э.П., 2009). Большинство видов приматов уже внесены в международную и национальные Красные книги (Лапин Б.А., 2004). Однако по-прежнему сохраняется необходимость изучения на приматах патогенеза инфекционных заболеваний, а также испытания на них вакцин и терапевтических препаратов при таких инфекциях, для которых нет альтернативных моделей. Учитывая, что цитокины являются одной из наиболее мощных систем регуляции и интеграции врожденных и адаптивных форм иммунного ответа, определение уровня ведущих цитокинов у соматически здоровых обезьян Сухумского питомника имело практическое значение.
Цели и задачи. Исследование уровня цитокинов у макак-резусов, с установлением нормативных значений для обезьян, содержащихся в условиях сухумского питом-
ника. Сравнение полученных концентрации цитокинов у молодых половозрелых обезьян (основная группа сравнения) с особями старшей возрастной группы и человеком.
Материалы и методы. Исследования проведены на базе Сухумского питомника при НИИ экспериментальной патологии и терапии АНА. Специалистами клинического отдела Сухумского питомника, по соответствующим кли-нико-лабораторным критериям соматического здоровья животных, были отобраны 60 здоровых макак-резусов (28$ и 32$). Группа 1 — 40 молодых половозрелых обезьян (с 4 до 11 лет) и группа 2 — 20 животных старшего возраста (с 20 до 30 лет). Забор крови осуществляли из локтевой вены в один и тот же временной промежуток — с 9 до 10 часов утра натощак. Методом иммуноферментного анализа, с применением тест-систем ЗАО «Вектор-Бест», были определены в сыворотке крови уровни следующих цитокинов: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFNy.
Результаты. В сыворотке крови молодых половозрелых особей концентрация IL-1ß и IL-6 была ниже в 3,6 (IL-1ß) и в 1,5 (IL-6) раза по сравнению с животными старшей группы (р < 0,0001 и р < 0,03 соответственно). При этом содержание IL-2 и IFNy у особей группы 1 было, наоборот, в 4,5 (IL-2) и 2,3 (IFNy) раза выше по сравнению с группой 2 (р < 0,0001). Разницы в уровне IL-4 выявлено не было. При сравнении полученных данных с человеком, было определено, что концентрации цитокинов в сыворотке соматически здоровых макак-резусов молодого половозрелого возраста входит в диапазон нормативных значений цитокинов здоровых людей соответствующего возраста (Симбирцев А.С., 2009).
Заключение. Определение уровня ряда ведущих цитокинов и установление их норм явилось дополнительным иммунологическим критерием для полной оценки соматического здоровья макак-резусов Сухумского питомника. Кроме того то, что исследуемые цитокины укладываются в те же пределы нормативных колебаний, что и человеческие, является очередным подтверждением порой безальтернативного использования низших обезьян старого света при моделировании ряда иммунопатологических состояний.
ПОВРЕЖДЕНИЕ ОРГАНОВ ИММУНОПОЭЗА ПРИ ХИМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ И СПОСОБ ЕГО КОРРЕКЦИИ
Медведева С. Ю.1, 2, Пьянкова З.А.2, Белоусова А.В.1, 2
1ФГБУН«Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН, Екатеринбург, Россия
2 ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина, Екатеринбург, Россия
Введение. Основной мишенью токсического действия тетрахлорметана (СС14) является печень. В последнее время много работ посвящено изучению структурных изменений печени, ее клеточных элементов, принимающих участие в регенерации при токсическом повреждении. Однако исследование иммунотоксикологического воздействия промышленных ядов на иммунные органы остается не до конца изученным и является актуальным, поскольку нарушение иммунологической реактивности может приводить к развитию инфекционных и онколо-
