CC BY
28
УДК 577.152.34
Изменение пула протеасом в процессе злокачественной трансформации клеток печени мыши
Т.М. Астахова, Г.В. Делоне, Ю.В. Люпина, Е.Б. Абрамова, И.В. Урываева, Н.П. Шарова* Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26 *E-mail: [email protected]
РЕФЕРАТ Множественные формы протеасом регулируют клеточные процессы, устраняя белки или образуя пептиды, в этих процессах участвующие. Можно полагать, что различные патологии, в т.ч. злокачественная трансформация клеток, связаны с изменениями функционирования множественных форм протеасом. В настоящей работе исследованы изменения в пуле протеасом печени при регенераторной узелковой гиперплазии гепатоцитов и образовании на ее фоне аденомы и гепатоклеточной карциномы у мышей, подвергнутых действию дипина и последующей операции частичной гепатэктомии. Относительное содержание различных форм протеасом изучали с помощью Вестерн-блоттинга. Химотрипсинподобную активность протеасом оценивали по гидролизу флуоро-генного коммерческого субстрата Suc-LLVY-AMC. Выявлено, что изменения в пуле протеасом начинаются уже при формировании диффузных узелков и заключаются в возрастании экспрессии конститутивной субъединицы X(P5) и иммунных субъединиц LMP7(P5i) и LMP2(P1i), что сопровождается увеличением тотального пула протеасом и падением его химотрипсинподобной активности. Эти изменения были более выраженными при образовании гепатоклеточной карциномы. Аденома занимала промежуточное положение между образцами печени с диффузными узелками и гепатоклеточной карциномой по изменению химотрипсинподобной активности и содержания тотального пула протеасом и субъединицы LMP2(P1i). Помимо этого, образование злокачественной опухоли было связано с повышением уровня субъединицы Rpt6, входящей в состав 19S-активатора протеасом. Полученные результаты дают основание полагать, что регенераторная узелковая гиперплазия печени и адено-матоз являются этапами, предшествующими образованию гепатоклеточной карциномы. Кроме того, полученные результаты ставят задачу поиска сигнальных путей, приводящих к изменению экспрессии субъединиц протеасом при злокачественной трансформации клеток. Проделанная работа указывает на перспективность использования 19S-активатора протеасом, избыточно экспрессирующегося в злокачественной опухоли, в качестве мишени для разработки новых противоопухолевых лекарств.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА иммунные протеасомы, 19S-активатор протеасом, химотрипсинподобная активность протеасом, Вестерн-блоттинг, регенераторная узелковая гиперплазия гепатоцитов, аденома, гепатоклеточная карцинома, печень мыши.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ХТП-активность, химотрипсинподобная активность; nNOS, нейрональная NO-синтаза; ди-пин, 1,4-бис-[^№-ди(Этилен)-фосфамид] пиперазин; Suc-LLVY-AMC, N-succinyl-leu-leu-val-tyr7-amido-4-methyl coumarin; MG132, Z-leucyl-leucyl-leucinal; mAb, моноклональные антитела; pAb, поликлональные антитела.
ВВЕДЕНИЕ
Изучение молекулярных механизмов злокачественной трансформации клеток по сей день остается одной из наиболее актуальных проблем. Открытие в 80-х годах прошлого века новой системы гидролиза белков, связанной с протеасомами и затрагивающей все клеточные процессы, выявило дополнительные перспективы в исследовании механизмов злокачественной трансформации клеток млекопитающих. Протеасомы, мультисубъединичные мульти-протеиназные белковые комплексы, присутствуют в органах и тканях млекопитающих во множественных формах, различающихся структурой и физиологической ролью [1 — 4]. По набору протеолитически активных субъединиц все многообразие этих форм можно свести к двум группам -конститутивным и иммунным протеасомам. В состав конститутивных протеасом входят по две субъединицы Х(Р5),
Y(P1) и Z(P2), проявляющие, соответственно, химотрип-син-, каспаза- и трипсинподобную активности. При сборке иммунных протеасом в их структуру встраиваются иммунные субъединицы LMP7(P5i), LMP2(P1i) и LMP10(P2i) вместо перечисленных протеолитических субъединиц конститутивных протеасом. В процессе гидролиза чужеродных белков иммунными протеасомами образуется в несколько раз больше антигенных эпитопов, способных встраиваться в щель Бьоркмана молекул главного комплекса гистосов-местимости класса I для последующего их представления Т-лимфоцитам. Кроме того, иммунные протеасомы участвуют в регуляции дифференцировки и пролиферации некоторых клеточных популяций, вероятно, за счет продуцирования биологически активных пептидов [5, 6] и представляют собой необходимое звено сигнального пути, гасящего окислительный стресс [7].
Как конститутивные, так и иммунные протеасомы образуют пулы 26S- и 20S-протеасом [3]. 26S-протеасомы состоят из протеолитической субчастицы 20S и одной или двух 19S-субчастиц-активаторов, осуществляющих связывание с убиквитинированными белками-мишенями, их расплетание и проталкивание в протеолитическую камеру. Таким образом, 26S-протеасомы регулируют клеточные процессы, устраняя белки или образуя пептиды, участвующие в этих процессах, и запускают реакции, связанные с Т-клеточным звеном иммунитета. Функционирование 26S-протеасом, как правило, зависит от АТР и убиквитина. 20S-протеасомы, напротив, расщепляют белки и короткие пептиды независимо от АТР и убиквитина. С каждым годом увеличивается список обнаруженных белков-субстратов 20S-протеасом. К ним относятся, например, белки с поврежденной третичной структурой [8], ряд вирусных белков [9, 10].
Учитывая многообразие функций протеасом, можно говорить о важности выявления изменений, происходящих в пуле протеасом при злокачественной трансформации клеток, как для понимания механизмов этого процесса, так и для поиска новых мишеней противоопухолевой терапии среди множественных форм протеасом. Немногочисленные литературные данные, связанные с этим вопросом, касаются сравнения содержания той или иной формы про-теасом в злокачественных и контрольных клетках [11-16]. В то же время понимание особенностей функционирования пула протеасом на этапах образования доброкачественной и злокачественной опухолей могло бы прояснить некоторые механизмы перехода клеток в состояние злокачественности. Поэтому целью настоящей работы было выявить изменения, затрагивающие пул протеасом при образовании доброкачественных и злокачественных опухолей, на одной и той же модели животных. Для исследования была выбрана разработанная ранее модель индуцирования злокачественной трансформации клеток печени у мышей CBA/Lac x BL/6 F1 под действием алкилирующего препарата дипина и последующей операции частичной резекции печени [17, 18]. Дипин вызывает в гепатоцитах нерепарируемые повреждения генетического материала, которые после стимуляции митозов частичной резекцией печени приводят к хромосомным разрывам и перестройкам. Клетки, несущие такие повреждения, оказываются нежизнеспособными и постепенно гибнут. Восстановление паренхимы происходит за счет активации тканевого стволового резерва и клонального роста новообразованных гепатоклеточных узелков, которые, сливаясь и вытесняя исходные дегенерирующие гепатоциты, формируют новую ткань. Этот процесс узелковой регенераторной гиперплазии носит диффузный характер, но со временем единичные узелки могут прогрессировать и дать начало образованию крупных аденом и гепатокарцином. В настоящей работе проведено сравнительное исследование ХТП-активности и содержания тотального пула протеасом, а также содержания 26S- и иммунных протеасом в интактной печени и индуцированных печеночных доброкачественных и злокачественных опухолях.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы. В работе использованы Suc-LLVY-AMC и MG132 фирмы Sigma (США), mAb мыши к Р-актину
фирмы Santa Cruz (Германия), mAb мыши к субъединицам Rpt6 и а1,2,3,5,6,7, pAb кролика к субъединицам X(ß5), LMP7(ß5i) и LMP2(ß1i) фирмы Biomol (Великобритания), pAb кролика к nNOS фирмы Abcam (Великобритания). Набор ECL, нитроцеллюлозные мембраны Hybond-ECL и антитела к IgG мыши и кролика, конъюгированные с пе-роксидазой, получены от фирмы Amersham Biosciences (Великобритания).
Животные. Исследование выполняли на мышах CBA/ Lac x BL/6 F1. Группе самцов весом 20-22 г в возрасте трех месяцев вводили дипин из расчета 60 мкг на 1 г веса и проводили стандартную операцию частичной резекции печени (до 70 %) согласно разработанной ранее схеме [17]. В качестве контрольных групп животных использовали мышей с интактной печенью и мышей, подвергнутых операции частичной резекции печени. Через 12 мес. исследовали печень контрольных и опытных животных.
Гистологическое исследование печени. Фрагменты печени и крупных опухолевых узлов фиксировали в 10 %-ном формалине. Фиксированный материал проводили по стандартной методике, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 5 мкм. После депарафинирования препараты окрашивали гематоксилин-эозином, заключали в бальзам и анализировали с помощью светового микроскопа Olympus AHBT3 (Австрия).
Получение осветленных гомогенатов фрагментов печени и опухолей. Все процедуры проводили при 0-4 °С. Фрагменты печени и опухоли промывали стандартным фосфатным солевым буфером, обсушивали, взвешивали и гомогенизировали в гомогенизаторе (стекло-стекло) (Braun Melsungen, Германия) в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитио-треитол, 10 %-ный глицерин, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ATP, 10 мМ Na2S2O5, лейпептин (0.5 мкг/мл), пепстатин (1 мкг/мл) и апротинин (1 мкг/мл), в соотношении 1 : 3. Гомогенаты центрифугировали при 10 000g в течение 30 мин. Надоса-дочную жидкость (осветленные гомогенаты) использовали для дальнейших исследований. Концентрацию белка в осветленных гомогенатах определяли по методу Лоури
[19].
Определение активности протеасом. Активность про-теасом определяли по гидролизу флуорогенного олигопеп-тида Suc-LLVY-AMC, утилизирующегося ХТП-центрами протеасом [20]. Реакционная смесь содержала 20 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1 мМ дитиотреитол, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ ATP. Для исключения вклада примесных протеолитических активностей в ряд проб добавляли 10 мкМ MG132, ингибитор ХТП-центров протеасом. Реакцию проводили при 37 °С в течение 20 мин после внесения 0.5-2 мкл осветленного гомогената в реакционную смесь (до 100 мкл конечного объема) и останавливали 1 %-ным Ds-Na. Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре при значениях возбуждающей длины волны 380 нм и эмиссии 440 нм. Окончательные расчеты проводили по разнице между полной и остаточной активностями в присутствии MG132. Активность выражали в нмоль Suc-LLVY-AMC, гидролизованного протеасомами, содержащимися в 100 мкл осветленных гомогенатов, в течение 20 мин.
Вестерн-блоттинг. Относительное содержание субъединиц протеасом, nNOS и ß-актина в осветленных гомо-
110 | ACTA NATURAE | ТОМ 2 № 1 (4) 2010
a б в
Рис. 1.Гепатоклеточные опухоли, развившиеся на фоне хронического регенеративного состояния печени через 12 мес. после воздействия дипина и частичной гепатэкто-мии: а — узелок-микроаденома, состоящий из мелких гепатоцитов с диплоидными ядрами: б — крупная гепатоклеточная аденома, в которой отсутствует типичная для печени структура долек и сосудистого русла; в — гепатоклеточная карцинома трабеку-лярного типа с цитомегалией, аномальным строением трабекул и синусоидов. Окраска гематоксилин-эозином. Стрелками указаны границы опухолей. Шкала 100 мкм
генатах определяли с помощью Вестерн-блоттинга. После электрофореза белков осветленных гомогенатов (по 5 мкл на дорожку, 120-148 мкг белка) в 10-13 %-ном ПААГ в присутствии Ds-Na осуществляли полусухой перенос полипептидов из геля на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубировали в течение 2 ч при 20 °С в буфере TNT (10 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 150 мМ NaCl, 0.1 % Tween-20), затем в течение 1 ч в буфере TNT, содержащем 2-5 %-ное обезжиренное молоко и mAb мыши к ß-актину (1 : 200), или субъединице Rpt6 (1 : 2500), или субъединицам а1,2,3,5,6,7 (1 : 2500) (или pAb кролика к nNOS (1 : 500), или к субъединице X(ß5), или LMP7(ß5i), или LMP2(ß1i) в разведении 1 : 1250). Затем мембрану отмывали несколько раз буфером TNT и инкубировали в течение 1 ч в буфере TNT, содержащем 2-5 %-ное обезжиренное молоко и антитела к IgG мыши (или кролика), конъюгированные с пероксидазой, в разведении 1 : 2500. После отмывки в буфере TNT мембрану подвергали стандартной обработке системой ECL.
Для анализа изображения использовали компьютерную программу ImageJ. Относительное содержание исследуемых белков в осветленных гомогенатах определяли по плотности соответствующих полос на рентгеновской пленке. Предварительно строили графики зависимости плотности от количества белка, подвергаемого Вестерн-блоттингу. Для дальнейшей работы выбирали тот диапазон количества белка, в котором указанная зависимость носила прямолинейный характер.
Статистический анализ. Данные представлены как среднее ± доверительный интервал (б): 5 = ± ta n-° 5,
где t - коэффициент Стьюдента при уровне значимости p < 0.05, a - стандартная ошибка, n - число экспериментов.
результаты и обсуждение
Гистологическое исследование печени мышей. На рис. 1 представлены результаты гистологического исследования печени через 12 мес. после инъекции мышам дипина и последующей операции частичной гепатэктомии. В ткани печени выявляются множественные узелки (доброкачественные новообразования, микроаденомы) (рис. 1, а), которые формируются в диффузном процессе регенераторной узелковой гиперплазии гепатоцитов. Кроме того, были об-
наружены крупные доброкачественные новообразования, аденомы (рис. 1, б) и злокачественные новообразования, соответствующие по биологическим характеристикам ге-патоклеточным карциномам трабекулярного типа (рис. 1, в) [21]. В образцах опухолей и фрагментах печени с диффузной узелковой гиперплазией исследовали ХТП-активность тотального пула протеасом и содержание различных субъединиц протеасом в сравнении с таковыми в печени контрольных животных.
Технические замечания по исследованию изменений в пуле протеасом при образовании опухолей. Относительное содержание тотального пула протеасом в образцах исследовали Вестерн-блоттингом с применением антител к субъединицам а1,2,3,5,6,7, входящим в состав всех форм протеасом. Аналогично определяли относительное содержание 26S-протеасом с использованием антител к субъединице Rpt6, входящей в состав 19S-субчастицы 26S-протеасом, и относительное содержание протеолити-ческих субъединиц Хф5), LMP7(P5i) и LMP2(P1i) протеа-сом с использованием антител к этим субъединицам.
Наряду с исследованием содержания субъединиц проте-асом в осветленных гомогенатах печени и индуцированных опухолей было проанализировано содержание тотального белка и Р-актина, обычно используемых для стандартизации активности и количества изучаемых белков в различных тканях. Содержание тотального белка в осветленном гомогенате гепатоклеточной карциномы было незначительно, но достоверно снижено по сравнению с таковым в осветленном гомогенате интактной печени (табл. 1). В то же время содержание Р-актина было существенно выше в образце гепатоклеточной карциномы (рис. 2, табл. 1). Поэтому в настоящем исследовании оба эти показателя непригодны к использованию в качестве внутреннего контроля для стандартизации характеристик исследуемых белков. Более корректным представляется сравнение активности и содержания субъединиц протеасом в печени контрольных мышей и печеночных опухолях из расчета на стандартизированный вес сырой ткани.
Следует отметить, что в качестве дополнительного контроля использовали печень, регенерировавшую после операции частичной резекции и не подвергнутую действию дипина. Осветленные гомогенаты ткани этой печени не от-
личались от осветленных гомогенатов интактной печени по ХТП-активности протеасом и уровню всех исследованных субъединиц протеасом, Р-актина и тотального белка (данные не приведены).
Сходство и отличие в изменении пула протеасом при образовании доброкачественных и злокачественной опухолей. Изменения в пуле протеасом начинаются уже при образовании диффузных узелков и выражаются в увеличении тотального пула протеасом и возрастании экспрессии конститутивной субъединицы Х(Р5) и иммунных субъединиц LMP7(P5i) и LMP2(P1i) (рис. 2, табл. 1). По степени увеличения экспрессии эти субъединицы выстраиваются в ряд: LMP2(P1i) > LMP7(P5i) > Х(Р5). Причем по возрастанию содержания субъединицы LMP2(P1i) можно судить и о возрастании содержания третьей иммунной субъединицы LMP10(P2i), поскольку они встраиваются в протеасомы совместно, в то время как иммунная субъединица LMP7(P5i) способна включаться в протеасомы независимо от двух других иммунных субъединиц [22, 23]. Повышение уровня исследованных субъединиц в общем пуле протеасом сопровождалось снижением его активности по отношению к олигопептиду Suc-LLVY-AMC, утилизирующемуся ХТП-центрами конститутивной субъединицы Х(Р5) и иммунной субъединицы LMP7(P5i) (табл. 1).
Образование злокачественной опухоли было связано с еще более сильным падением ХТП-активности про-теасом и еще более выраженным увеличением тотального пула протеасом и содержания иммунных субъединиц и конститутивной субъединицы Х(Р5) (рис. 2, табл. 1). Однако характер возрастания уровня этих субъединиц был иным: LMP2(P1i) > Х(Р5) > LMP7(P5i). Следует отметить, что, хотя содержание иммунной субъединицы LMP7(P5i) в гепатоклеточной карциноме превышало таковое в контрольной ткани печени и фрагментах печени с диффузными узелками, однако оно не отличалось от содержания этой субъединицы в аденоме. В свою очередь, аденома занимала промежуточное положение между образцами пе-
Таблица 1. ХТП-активность протеасом и содержание субъединиц протеасом, nNOS, р-актина и тотального белка в осветленных гомогенатах печени и индуцированных печеночных опухолей у мышей
Параметр Значение параметра в осветленном гомогенате
интактной печени печени с узелковой гиперплазией гепатоцитов аденомы гепатоклеточной карциномы
ХТП-активность протеасом в 100 мкл образца (нмоль Suc-LLVY-AMС) 18.6 ± 1.3 13.7 ± 0.5 11.2 ± 0.5 5.3 ± 0.3
Содержание субъединиц протеасом (%) а1,2,3,5,6,7 100 ± 4 135 ± 3 147 ± 2 220 ± 6
Rpt6 100 ± 3 98 ± 3 101 ± 5 150 ± 6
Х(Р5) 100 ± 3 125 ± 5 - 210 ± 8
LMP7(p5i) 100 ± 5 150 ± 4 170 ± 5 169 ± 7
LMP2(p1i) 100 ± 3 200 ± 7 290 ± 17 400 ± 15
Содержание nNOS (%) слабо выявл. 100 ± 3 - 450 ± 13
Содержание р-актина (%) 100 ± 2 102 ± 3 97 ± 8 270 ± 7
Концентрация белка (мг/мл) 29.5 ± 0.9 26.5 ± 1.1 26.0 ± 0.7 24.0 ± 0.8
За 100 % принято содержание (оптическая плотность полос) субъединиц протеасом и р-актина в осветленном гомогенате интактной печени, nNOS — в осветленном гомогенате печени с узелковой гиперплазией гепатоцитов. Результаты представлены как среднее ± 6. Для каждой точки р < 0.05, п > 5.
112 | АСТА ЫАТиИАЕ | ТОМ 2 № 1 (4) 2010
а!,2,3,5,6,7
Rpt6 LMP7 (р50
X (Р5) LMP2 (р 10 ^ОБ в-актин
кДа - 29
_ 45 29
_ 20 _ 20
„ 116
45
Рис. 2. Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов интактной печени (1), печени с диффузными узелками (2) и гепатоклеточной карциномы (3) с использованием антител к субъединицам а1,2,3,5,6,7, Rpt6, 1-МР7(р51), Х(р5), 1_МР2(р11) протеасом, nNOБ и р-актину. Маркеры: карбоангидраза (29 кДа), овальбумин (45 кДа), ингибитор трипсина (20 кДа) и р-галактозидаза (116 кДа)
чени с диффузными узелками и гепатоклеточной карциномой по содержанию тотального пула протеасом, иммунной субъединицы LMP2(P1i) и ХТП-активности (рис. 2, табл. 1). Эти результаты позволяют говорить о том, что при образовании доброкачественных и злокачественной опухолей тотальный пул протеасом увеличивается за счет множественных форм иммунных протеасом, нарабатывающихся
2
3
в разных соотношениях. К их числу относятся протеасомы, содержащие все три иммунные субъединицы LMP7(P5i), LMP2(P1i) и LMP10(P2i), протеасомы, содержащие иммунную субъединицу LMP7(P5i) и конститутивные субъединицы Y(P1) и Z(P2), а также протеасомы, содержащие конститутивную субъединицу Х(Р5) и иммунные субъединицы LMP2(P1i) и LMP10(P2i).
Падение ХТП-активности при образовании опухолей нельзя объяснить исключительно изменением соотношения субъединиц Х(Р5) и LMP7(P5i), проявляющих эту активность, поскольку не наблюдается корреляции между данными величинами (табл. 1). Вероятно, более существенное влияние на ХТП-активность оказывает встраивание в про-теасомы субъединицы LMP2(P1i) и/или действие внутриклеточных регуляторов.
В настоящей работе выявлено принципиальное отличие пула протеасом злокачественной опухоли от пулов про-теасом доброкачественных опухолей. Из всех исследованных опухолей только гепатоклеточная карцинома содержала повышенное количество 19S-активатора, входящего в состав и определяющего уровень 26S-протеасом (рис. 2, табл. 1). Возрастание уровня 26S-протеасом в гепатокле-точной карциноме вполне объяснимо. Злокачественные опухоли, в т.ч. опухоли печени, характеризуются усиленным обменом белка [24, 25], который требует, в свою очередь, увеличенного содержания протеолитических ферментов, в частности 26S-протеасом.
Вместе с тем причина возрастания уровня иммунных протеасом в гепатоклеточной карциноме не столь очевидна. С одной стороны, правомочно полагать, что иммунные про-теасомы нарабатываются в трансформирующихся клетках для выявления и уничтожения этих клеток иммунной системой. Вполне возможно, что в исследуемой нами модели нефункциональны какие-то иные звенья, необходимые для развития иммунной реакции. Поэтому сколько бы ни нарабатывалось иммунных протеасом в опухолевых клетках, иммунная система не способна их уничтожить. Изучение этого вопроса входит в наши дальнейшие задачи. С другой стороны, учитывая антиоксидативную функцию иммунных протеасом, можно полагать, что путем их дополнительной наработки опухолевые клетки защищаются от действия метаболитов и иных факторов, приводящих к развитию окислительного стресса и апоптозу.
Возможный механизм регуляции содержания иммунных протеасом в опухолях. Отметим, что ПО-зависимый сигнальный путь, направленный на «гашение» окислительного стресса в эндотелиальных клетках, связан с дополнительной экспрессией иммунной субъединицы LMP2(P1i) в большей степени, чем иммунной субъединицы LMP7(P5i) [7]. Эти данные совпадают с полученными нами результатами по динамике экспрессии иммунных субъединиц при образовании опухолей печени (табл. 1). Антиоксидативная функция иммунных протеасом в эндотелиальных клетках заключается в устранении рецептора трансферрина и бло-
ТТ пЫОБ
1
(?)
Рис. 3. Схема злокачественной трансформации клеток печени, основанная на изменениях в пуле протеасом
ТОМ 2 № 1 (4) 2010 | АСТА ПАТиГАЕ | 113
кировании развития цепных реакций свободнорадикально-го окисления с участием двухвалентного железа [7]. Вместе с тем убедительно показано, что NO играет роль антиокси-данта и в злокачественных клетках [26-28]. Не исключено, что в гепатоклеточной карциноме иммунные протеасомы также включены в NO-зависимый сигнальный путь, защищающий опухоль от окислительного стресса. В пользу этого предположения свидетельствуют полученные нами данные по увеличению экспрессии nNOS в гепатоклеточ-ной карциноме (рис. 2, табл. 1). В то же время nNOS слабо выявлялась в печени контрольных мышей. Этот результат совпадает с литературными данными, указывающими на то, что содержание nNOS в печени взрослых мышей резко падает по сравнению с содержанием этого фермента в фетальной печени, где он регулирует гематопоэз [29].
Итак, в настоящей работе показано, что образование опухолей печени у мышей связано с существенными изменениями в пуле протеасом. Причем эти изменения при узелковой гиперплазии гепатоцитов и аденоматозе выражены в меньшей степени по сравнению с изменениями при формировании гепатоклеточной карциномы, что позволяет предположить, что узелковая гиперплазия и аденоматоз являются этапами, предшествующими образованию злокачественной опухоли. На рис. 3 представлена схема злокачественной трансформации клеток печени, основанная на анализе полученных результатов.
Проведенная работа ставит новые задачи поиска сигнальных путей, приводящих к изменению экспрессии различных субъединиц протеасом при образовании опухолей. Кроме того, полученные результаты указывают на перспективность использования 19S-активатора протеасом, избыточно экспрессирующегося в злокачественных новообразованиях, в качестве мишени для разработки новых противоопухолевых лекарств. Следует отметить, что в настоящее время используется первое противоопухолевое лекарство, bortezomib (Velcade), действующее на протеасомы [30]. Bortezomib вводится в кровоток пациентов и применяется в комплексе с другими противоопухолевыми средствами. Являясь производным бороната, bortezomib конкурентно ингибирует ХТП-активность всех форм протеасом
и временно индуцирует апоптоз, преимущественно неопластических клеток. Длительное ингибирование активности протеасом приводит к «включению» механизмов обратной связи и образованию новых протеасом [31], что объясняет временный терапевтический эффект лекарства. Вместе с тем, действуя на тотальный пул протеасом всех органов, bortezomib вызывает побочные эффекты: утомляемость, слабость, желудочно-кишечные нарушения, периферическую нейропатию и существенное ухудшение общего состояния пациентов [30]. В этой связи подавление функций 19S-активатора при сохранении протеолитической активности протеасом представляется более эффективным и безопасным способом противоопухолевой терапии.
вывоДы
Регенераторная узелковая гиперплазия гепатоцитов, аденоматоз и образование гепатоклеточной карциномы сопровождаются изменениями в пуле протеасом, характеризующимися как сходством, так и отличием. Сходство заключается в увеличении содержания иммунных протеа-сом, тотального пула протеасом и падении ХТП-активности протеасом во всех опухолях по сравнению с контролем. Отличие касается 19S-активатора протеасом, уровень которого повышается только в гепатоклеточной карциноме.
Динамика изменений в пулах протеасом печени с регенераторной узелковой гиперплазией гепатоцитов, аденомы и гепатоклеточной карциномы указывает на то, что регенераторная узелковая гиперплазия гепатоцитов и аденоматоз могут быть стадиями, предшествующими злокачественной трансформации клеток печени.
19S-активатор протеасом, избыточно экспрессирующий-ся только в злокачественно трансформированных клетках печени, представляется перспективной мишенью для разработки новых противоопухолевых лекарств. •
Авторы выражают благодарность В.С. Гореловой за помощь в работе.
Работа поддержана Федеральным агентством по науке и инновациям (ГК 02.512.12.2047) и РФФИ (грант № 09-04-00077).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Rock K.L., Goldberg A.L. // Annu. Rev. Immunol. 1999. V. 17. P. 739-779.
2. Шарова Н.П. // Онтогенез. 2006. Т. 37. С. 171-178.
3. Sharova N., Zakharova L. // Recent Patents on Endocrine, Metabolic & Immune Drug Discovery. 2008. V. 2. P. 152-161.
4. Tanaka K. // Proc. Jpn. Acad., Ser. B. 2009. V. 85. P. 12-36.
5. Caudill C.M., Jayarapu K., Elenich L., et al. // J. Immunol. 2006. V. 176. P. 4075-4082.
6. Singh S., Awasthi N., Egwuagu C., Wagner B.J. // Arch. Biochem. Biophys. 2002. V. 405. P. 147-153.
7. Kotamraju S., Matalon S., Matsunaga T., et al. // Free Rad. Biol. Med. 2006. V. 40. P. 1034-1044.
8. Grune T., Reinheckel T., Davies K.J.A. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 15504-15509.
9. Voigt A., Salzmann U., Seifert U., et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 355. P. 549-554.
10. Yuksek K., Chen W.L., Chien D., Ou J.H. // J. Virol. 2009. V. 83. P. 612-621.
11. Meidenbauer N., Zippelius A., Pittet M. J., et al. // Cancer Res. 2004. V. 64. P. 6319-6326.
12. Gobbi G., Mirandola P., Micheloni C., et al. // Int. J. Oncol. 2004. V. 25. P. 1625-1629.
13. Chen L., Madura K. // Cancer Res. 2005. V. 65. P. 5599-5606.
14. Barnes C.J., Li F., Talukder A.H., Kumar R. // Clin. Cancer Res. 2005. V. 11. P. 28682874.
15. Mehling M., Simon P., Mittelbronn M., et al. // Acta Neuropathol. 2007. V. 114. P. 111-119.
16. Deng S., Zhou H., Xiong R., et al. // Breast Cancer Res. Treat. 2007. V. 104. P. 21-30.
17. Uryvaeva I.V. // Monogr. Dev. Biol. 1992. V. 23. P. 230-236.
18. Урываева И.В. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1997. Т. 124. С. 364-368.
19. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
20. Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E., et al. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 2196321972.
21. Becker F.F. // Cancer Res. 1982. V. 42. P. 3918-3923.
22. Groettrup M., Standera S., Stohwasser R., Kloetzel P.-M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 8970-8975.
23. Griffin T.A., Nandi D., Cruz M., et al. // J. Exp. Med. 1998. V. 187. P. 97-104.
24. Бульдяева Т.В., Базарнова (Астахова) Т.М., Кузьмина С.Н., Збарский И.Б. // Эксперим. онкология. 1984. Т. 6. С. 35-38.
25. Bazarnova (Astakhova) T.M., Buldyaeva T.V., Filatova L.S., Akopov S.B., and Zbarsky I.B. // Cell Res. 1998. V. 8. P. 195-207.
26. Juckett M.B., Weber M., Balla J. // Free Rad. Biol. Med. 1996. V. 20. P. 63-73.
27. Gorbunov N.V., Yalowich J.C., Gaddam A., et al. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 12328-12341.
28. Кондакова И.В., Загребельная Г.В. // Биомедицинская химия. 2004. Т. 50. С. 571-581.
29. Krasnov P., Michurina T., Packer M.A., et al. // Mol. Med. 2008. V. 14. P. 141-149.
30. Field-Smith A., Morgan G.J., Davies F.E. // Ther. Clin. Risk. Manag. 2006. V. 2. P. 271-279.
31. Naujokat C., Fuchs D., Berges C. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1773. P. 1389-1397.
114 | ACTA NATURAE | ТОМ 2 № 1 (4) 2010
