CC BY
164
УДК: 616-006.6:577.156
АКТИВНОСТЬ ПРОТЕАСОМ В ТКАНЯХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ
Л.В. Спирина1, И.В. Кондакова1, Е.А. Усынин1, Л.А. Коломиец12,
Е.Л. Чойнзонов12, М.Р Мухамедов1, А.Л. Чернышова1, Н.П. Шарова3
НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск1 ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Томск2 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва3 634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: KondakovaIV@oncology.tomsk.ru1
В результате проведенного исследования активности протеасом у больных злокачественными опухолями различных локализаций установлены разнонаправленные их значения. В ткани опухоли почки происходило снижение активности протеасом по сравнению с окружающей неизмененной тканью. При раке мочевого пузыря активность ферментов в опухоли не отличалась от их активности в окружающей ткани. В опухолевой ткани эндометрия и в плоскоклеточных карциномах головы и шеи активность протеасом была повышена по сравнению с окружающей неизмененной тканью. Увеличение активности протеасом при злокачественных новообразованиях обусловлено увеличением активности пула 20S-протеасом.
Ключевые слова: активность протеасом, 20S протеасомы, 26S протеасомы, рак почки, рак мочевого пузыря, рак эндометрия, плоскоклеточные карциномы головы и шеи.
PROTEASOME ACTIVITY IN CANCER TISSUES L.V Spirina1, I.V Kondakova1, Y.A. Usynin1, L.A. Kolomiets12 E.L. Choinzonov12, M.R. Mukhamedov1, A.L. Chernyshova1, N.P. Sharova3 Cancer Research Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk1 Siberian State Medical University, Tomsk2 Koltzov Institute of Developmental Biology RAS, Moscow1 5, Kooperativny Street, 634009-Tomsk, e-mail: KondakovaIV@oncology.tomsk.ru1
Proteasome activity in cancer tissues was studied. Proteasome activity was decreased in kidney cancer tissue compared with surrounding normal tissue. No difference in proteasome activity was observed between malignant and normal bladder tissue. Proteasome activity was higher in endometrial and head and neck squamous cell cancer tissues than in surrounding normal tissue. The elevated proteasome activity in cancer patients was associated with increased activity of 20S proteasome.
Key words: proteasome activity, 20S and 26S proteasomes, kidney cancer, bladder cancer, endometrial cancer. head and neck squamous cell carcinoma.
Развитие злокачественных новообразований тесно связано с комплексом протеаз, получивших название «раковый деградом», которые определяют такие важные свойства опухолей, как инвазия и метастазирование [13]. Кроме того, внутриклеточные протеолитические системы, расщепляя регуляторные и сигнальные белки, принимают участие в различных процессах - пролиферации, апоптозе и др. Наиболее важную роль в деградации белков клетки играет протеасомная система. которая представляет собой внутриклеточный ферментативный комплекс, отвечающий за специфический протеолиз белков. Протеасома обладает трипсиноподобной, химотрипсино-подобной, каспазной активностями. Выделяют 20S и 26S пулы протеасом [4, 8, 17]. Полный протеолиз происходит в 26S протеасоме, однако каталитической активностью обладает также 20S пул. Узнавание белков-мишеней, подлежащих расщеплению, осуществляется компонентами,
не принадлежащими протеолитическому комплексу, а именно, убиквитинами и белками, их переносящими [3, 16]. 26S протеасомы осуществляют убиквитин- и АТФ-зависимый протеолиз благодаря наличию в их составе 19S-субчастицы. способной распознавать убиквитинированные белки, а также расплетать их и проталкивать в протеолитическую камеру [8, 16]. 20S протеасо-мы гидролизуют белки, главным образом, с поврежденной третичной структурой независимо от убиквитина [11].
Протеасомы играют важную роль в поддержании функциональной активности клеток, в частности в регуляции работы сигнальных систем, которые активируются при взаимодействии ростовых факторов с соответствующими рецепторами [10, 12]. Нарушение в функционировании протеасомного комплекса связано со многими патологиями и имеет большое значение в развитии онкологических заболеваний. В экс-
периментальных условиях показано изменение активности и состава пула 26S протеасом в онкогенезе [2]. В настоящее время активно изучается роль убиквитинзависимого протеолиза в патогенезе злокачественных образований различных локализаций, в частности предстательной железы [14], молочной железы [7], кишечника [18] и др. Однако в этих исследованиях большое внимание уделяется изучению убиквитинирова-ния белков, в то время как активность протеасом исследована недостаточно.
В связи с этим целью данной работы явилось изучение изменения активности протеасомной системы при раке почки, мочевого пузыря, эндометрия и при плоскоклеточном раке головы и шеи.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 12 больных раком почки Т2-3К0-1М0-1 (средний возраст - 53,4 ± 3,1 года), 13 больных раком мочевого пузыря Т2-3К0М0 (средний возраст - 56,0 ± 2,3 года), 7 больных раком эндометрия Т1-2^М0 (средний возраст - 66,57 ± 2,1 года) и 12 больных с опухолями гортани и гортаноглотки Т1-4К0-2М0 (средний возраст - 57,7 ± 2,19 года), проходивших комбинированное лечение в клиниках НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск. Материалом исследования являлись опухолевая ткань почки, мочевого пузыря, эндометрия, гортани и гор-таноглотки и визуально не измененная ткань, находящаяся на расстоянии не менее 1 см от границы опухолей. В 10 случаях опухоли почки диагностирован светлоклеточный почечноклеточный рак, в 2 - папиллярный почечноклеточный рак. В группе больных со светлоклеточным раком почки регионарные и отдаленные метастазы имели 2 больных. Среди больных раком мочевого пузыря не было больных с регионарными метастазами. Больные раком эндометрия были распределены по стадиям заболевания следующим образом: 5 пациентов имели 1В стадию, 2 - II стадию. При гистологическом исследовании ткани рака эндометрия верифицирован эндометриоидный рак в 6 образцах и в 1 случае - неэндометриоидный рак. Опухоли головы и шеи представляли собой плоскоклеточную карциному гортани и гортаноглотки. Регионарные лимфогенные метастазы имели 7 больных опухолями головы и шеи
Получение осветленных гомогенатов. Замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мM трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мM ATФ, 5 мM хлорид магния, 1 мM дитиотреитол, ^M ЭДTA и 100 мM хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 мин при 10000g и 4оС. Супернатант (осветленный гомогенат) использовали для определения активности протеасом.
Фракционирование протеасом. Все процедуры проводили при 4°С. 100 мг ткани гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 1000 мкл 50 мM трис-HCl буфера (pH=7,8), содержащего 2 мM ATФ, 5 мM хлорид магния, ^M ЭДTA и 100 мM хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 мин при 10000g и 4оС на микроцентрифуге Eppendorf Centrifuge 5415R (Германия). Белки осветленных гомоге-натов фракционировали с помощью сульфата аммония в два этапа. Фракцию, обогащенную 26S-протеaсомaми, получали добавлением сульфата аммония до 40 % насыщения, фракцию 20S-протеaсом - добавлением сульфата аммония до 70 % насыщения [1]. Сульфат аммония до 40 % насыщения вносили порциями в течение 20 мин на магнитной мешалке. После полного растворения сульфата аммония препарат перемешивали в течение 20 мин, затем центрифугировали при 12500 об/мин в течение 20 мин, осадок растворяли в 250 мкл 20 мM Tрис- HCl буфера (pH 7,5), содержащего 2 мM ATФ, 5 мM хлорид магния, ^M ЭДTA и 20 % глицерин. К полученной надо-садочной жидкости добавляли сульфат аммония до 70 % насыщения. Процедуру высаливания проводили так же, как указано выше. Осадок растворяли в 250 мкл 20 мM Tрис-HCl буфера (pH 7,5), содержащего ^M ЭДTA и 20 % глицерин.
Определение активности протеасом. A^m-ность тотального пула протеасом, содержащего формы 26S и 20S, определяли в осветленных гомогенатах опухолевых и неизмененных тканей по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC, утилизирующегося химотрип-синподобными центрами протеасом [5]. Aot™-ность пулов 26S и 20S протеасом определяли в соответствующих фракциях, полученных из опухолевых и неизмененных тканей. Реакционная смесь для определения активности тотального пула протеасом и пула 26S протеасом содержала
активность протеасом в тканях злокачественных опухолей различных локализаций ------------------------------------------------------------------------------- 51
20 мМ Тш-НС1 (pH 7,5), 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ. Реакционная смесь для определения активности пула 20S протеасом имела такой же состав за исключением MgCl2 и АТФ. Реакцию проводили при 370С в течение 20 мин. Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре «НйасЫ-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури [15].
В таблице все результаты представлены как т±М, где т - среднее выборочное, М - ошибка среднего. Значимость различий исследовали при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни. Степень и значимость корреляционной связи между показателями оценивали с помощью коэффициента Спирмена. Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение
В результате проведенного исследования выявлено, что протеасомная активность в ткани рака почки значительно выше, чем в прилегающей ткани (таблица). Следует отметить, что на активность протеасом существенное влияние оказывал гистологический тип рака почки. При выделении группы с почечноклеточным светлоклеточным раком протеасомная активность в ткани опухоли была достоверно ниже (в 4,3 раза) по сравнению с неизмененной тканью (37,5 ± 5,0*103 Ед/мг белка). При папиллярном варианте рака почки активность была повышена до 237,4*103 Ед/мг, что требует
дополнительного исследования. Снижение активности ферментов в ткани светлоклеточного рака почки, вероятно, ассоциировано с дефектом Е3 лигазы, фермента внутриклеточной убиквитин-зависимой системы [6, 12].
Протеасомная активность в ткани мочевого пузыря не отличалась от этого показателя в неизмененной ткани (таблица).
В ткани рака эндометрия активность про-теасом была достоверно выше по сравнению с неизмененной тканью (соответственно 65,11 ± 16,94*103 Ед/мг белка и 30,48 ± 1,14*103 Ед/мг белка). В случае неэндометриодного рака активность ферментов повышалась до 150*103 Ед/мг белка.
Активность протеасом в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи была достоверно выше по сравнению с ее активностью в неизмененной ткани (таблица). Для изучения особенностей высокой активности протеасом в опухолях данной локализации было проведено фракционирование протеасом. На рис. 1 представлена активность 26S и 20S пулов про-теасом в неизмененной и опухолевой тканях. В опухолевой ткани была отмечена трехкратная разница между активностями различных пулов протеасом, в то время как в неизмененной ткани активность 26S пула была незначительно ниже 20S пула. Активность 20S фракции в опухолевой ткани была выше на 11,85*103 Ед/мг белка по сравнению с активностью фракции в неизмененной ткани. Однако различий в активности 26S-протеасом в опухолевой и неизмененной тканях не обнаружено. Следовательно, рост активности протеасом в опухолевой ткани происходит за счет 20S фракции. При изучении связи показателей внутриклеточного протеолиза и протеолиза в отдельных фракциях в опухолевой
Таблица
Протеасомная активность при раке почки, мочевого пузыря, эндометрия и при плоскоклеточных карциномах головы и шеи
Вид опухоли п Протеасомная активность неизмененной ткани, х103 Ед/мг белка п Протеасомная активность ткани опухоли, х103 Ед/мг белка
Рак почки 6 117,6 ± 17,3 12 50,7 ± 46,2*
Рак мочевого пузыря 5 43,6 ± 10,5 13 47,2 ± 6,8
Рак эндометрия 7 30,5 ± 1,1 7 65,1 ± 16,9*
Плоскоклеточные карциномы головы и шеи 3 14,4 ± 0,7 12 35,5 ± 4,6*
Примечание: * - различия статистически значимые (р<0,05).
Рис. 1. Активность 26S и 20S протеасом в неизмененной и опухолевой ткани (плоскоклеточный рак головы и шеи). Примечание: * - значимость различий между активностью 20S протеасом неизмененной и опухолевой ткани (р<0,05);
** - значимость различий между активностью 26S и 20S протеасом опухолевой ткани (р<0,05)
ткани показана зависимость общей активности протеасом от активности 20S фракции ^=0,86; р=0,0001). Известно, что 20S протеасома способна разрушать мелкие пептиды [9]. Вероятно, накопление ростовых факторов, метаболитов и других биологически активных веществ приводит к стимуляции внутриклеточного протеолиза и усиленной сборке мультикаталитических субъединиц ферментов. Однако сборка 26S-протеасом требует большого временного периода, поэтому расщепление пептидов в опухолях преимущественно происходит в 20S-протеасомах.
Таким образом, в результате проведенного исследования активности протеасом у больных злокачественными опухолями различных локализаций установлены разнонаправленные их значения. В ткани опухоли почки наблюдается более высокая активность протеасом в окружающей ткани, по сравнению со злокачественной, что, вероятно, может служить признаком распространенности процесса. При переходноклеточном раке мочевого пузыря не было выявлено различий в активности протеасом опухоли и в неизмененной ткани. В опухолевой ткани эндометрия и при плоскоклеточных карциномах головы и шеи происходит увеличение активности протеасом в опухоли по сравнению с окружающей тканью. Активация внутриклеточного специфического протеолиза связана с увеличением активности пула 208
протеасом, который осуществляет разрушение поврежденных белков, метаболитов и биологически активных пептидов, регулируя множество процессов, важных для развития опухолей.
Работа частично выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-00616а)
ЛИТЕРАТУРА
1. Абрамова Е.Б., Астахова Т.М., Ерохов П.А., Шарова Н.П. Множественность форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению // Известия РАН. Серия «Биология». 2006. № 2. С. 150-156.
2. Астахова Т.М., Шарова Н.П. Исключение иммунных протеасом из клеток асцитной карциномы Krebs-II мыши // Известия РАН. Серия «Биология». 2006. № 3. С. 275-283.
3. Ротанова Т.В., Мельников Э.Э. АТР-зависимые протеиназы и протеолитические комплексы внутриклеточной деградации белков // Биомедицинская химия. 2008. Т. 54, вып. 5. С. 512-530.
4. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Бондарева Л.А. и др. Особенности формирования пулов протеасом в селезенке и печени крыс в постнатальном развитии // Биохимия. 2006. Т. 71, вып. 9. С. 1278-1286.
5. Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. 26S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrate // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. (31). P. 21963-21972.
6. CharleswirthP.J.S., HarrisA.L. Mechanism of disease: angio-genesis in urologic malignancies // Nature Clin. Pract. 2006. Vol. 3. P. 157-169.
7. Chen C., Seth A.K., Aplin A.E. Genetic and expression aberrations of E3 ubiquitin ligases in human breast cancer // Mol. Cancer Res. 2006. Vol. 4. P. 695-707.
8. Dahlmann B. Role of proteasomes in disease // BMC Biochemistry. 2007. Vol. 8. P. 2091-3013.
9. Emmerich N.P.N., Nussbaum A.K., Stevanovic S. et al. The Human 26 S and 20 S Proteasomes Generate Overlapping but Different Sets of Peptide Fragments from a Model Protein Substrate // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 21140-21148.
10. GirnitaL., GirnitaA., Larson O. Mdm-2-dependent ubiquiti-nation and degradation of the insulin-like growth factor 1 receptor // PNAS. 2003. Vol. 100. P 8247-8252.
11. Grune T., Reinheckel T., DaviesK.J.A. Degradation of oxidized proteins in K562 human hematopoietic cells by proteasome // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 15504-15509.
12. Kim W.Y., Kaelin W.G. The role of VHL mutation in human cancer // J. Clin. Oncol. 2004. Vol. 22. P. 4991-5004.
13. Lah T.T., Duran Alonso M.B., Van Noorden CJ. Antiprotease therapy in cancer: hot or not? // Expert. Opin. Biol. Ther. 2006. Vol. 6 (3). P. 257-279.
14. Li B., Dou Q.P. Bax degradation by the ubiquitin/proteasomedependent pathway: Involvement in tumor survival and progression // Biochemistry. 2000. Vol. 97 (8). P. 3850-3855.
15. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.
16. Orlowski M., Wilk S. Ubiquitin-independent proteolytic functions of the proteasome // Arch. Biochem. Biophys. 2003. Vol. 415 (1). P. 1-5.
17. Sharova N., Zakharova L. Multiple forms of proteasomes and their role in tumor fate // Recent Patents on Endocrine, Metabolic & Immune Drug Discovery. 2008. Vol. 2 (3). P. 152-161.
18. Voutsadakis I.A. The ubiquitin-proteasome system in colorectal cancer // J. Cell Mol. Med. 2007. Vol. 11(2). P. 252-337.
Поступила 9.12.08
