CC BY
34
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
фосфатное (КФ) покрытие. Физиологической модели репарации соответствовал индекс шероховатости (Ra) размером 2-3 мкм. Ra образцов для репаративной модели учитывал больший объем ремоделирования кости при ее травматических повреждениях и был равен 3-5 мкм. Контролем служила 2D-модель in vitro культивирования клеток на пластике (контроль). Иммунофенотипирова-ние клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием коктейля моноклональных антител, меченных флюоресцентными метками ViaBlue, FITC, PE, (eBioscience, USA) на проточном цитометре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия). Количественное определение IL-2 в супернатантах исследуемых культур клеток проводили методом проточной флюориметрии на автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, BioRad, США) с использованием коммерческих тест-систем (Bio-PlexProHuman cytokine Group I Assays, Bio-Rad, США). Исследование уровня транскрипции мРНК генов (hTERT, ki-67, IL-2) проводили методом ПЦР. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, а также протоколы амплификации описаны ранее. Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20.
Результаты и обсуждение. По истечении срока инкубации (48 ч) в физиологической и в репаративной моделях культивирования было выявлено статистически достоверное увеличение содержания CD4+CD71+ лимфоцитов и продукции IL-2 в сравнении с контрольной 2D-культурой (р < 0,05), при этом уровень относительной экспрессии мРНК гена IL-2 в обеих моделях культивирования был сопоставим с контрольными значениями. Транскрипция мРНК гена ki-67, свидетельствующая о пролиферативной активности клетки, повышалась (в 6 раз) только в репаративной 3D-модели культивирования in vitro. Анализ динамики теломеразной активности, обеспечивающей репликативную способность высокопро-лиферирующих МНК, не выявил статистически значимого изменения относительной экспрессии мРНК гена hTERT как в физиологической, так и в репаративной 3D-моделях культивирования по сравнению с контролем.
Заключение. 3D-матрикс, имитирующий регенерацию костной ткани, стимулирует пролиферативную активность МНК, предположительно за счет эпигеномного характера действия рельефа кальций-фосфатной поверхности. Установлено различие в механизмах пролиферации МНК в репаративной и физиологической моделях 3D-матрикса.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 16-15-10031).
ДОФАМИН КАК РЕГУЛЯТОР РАЗВИТИЯ ТИМУСА У ПЛОДОВ КРЫС
Лифанцева Н.В., Конеева Ц.О., Воронова С.Н., Мельникова В.И.
ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, Москва, Россия
Введение. В последнее время существенно изменились представления о моноаминах как исключительно о передатчиках сигнала между клетками нервной системы. Все больше данных подтверждает их способность выступать в качестве гуморальных регуляторов широкого профиля в различных органах и тканях. Иммунная система является одним из примеров проявления такого действия моноаминов. Известно, что дофамин синтезируется лимфоцитами и участвует в модуляции иммунных реакций посред-
ством ауто- и паракринных механизмов у половозрелых млекопитающих. Исследование роли дофамина в раннем развитии имеет особое значение, поскольку вмешательство в формирование различных структур плода приводит к долговременным необратимым изменениям в постна-тальном периоде онтогенеза. Ранее нами было показано, что дефицит катехоламинов на определенных стадиях пренатального развития приводит к необратимым мор-фогенетическим изменениям в функционировании Т-клеточного звена иммунитета как в препубертатном, так и в постпубертатном периодах жизни. Однако оставалось невыясненным, какой конкретно из катехоламинов ответственен за обнаруженные эффекты. У плодов, в отсутствии гемато-энцефалического барьера, дофамин может выделяться из мозга в систему общей циркуляции, и его концентрация в крови плодов значительно выше, чем уровень норадреналина и адреналина. Высокая концентрация дофамина в крови плодов, а также отсутствие нарушений в развитии иммунной системы у мышей с нокаутом гена дофамин-Р-гидроксилазы, необходимой для синтеза норадреналина и адреналина, позволили нам предположить, что именно дофамин является регулятором формирования тимуса у плодов крыс.
Цель и задачи. В данной работе исследовали экспрессию рецепторов к дофамину и их функциональную активность в эмбриональном тимусе, а также отдаленные последствия пренатального подавления синтеза катехо-ламинов в критический период формирования тимуса на дифференцировку субпопуляций Т-лимфоцитов в этом органе у половозрелых животных.
Материалы и методы. Возрастную динамику экспрессии рецепторов к дофамину в тимусе оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией у плодов, начиная с 16-го дня эмбрионального развития (Э16). Функциональную активность дофаминовых рецепторов на клетках тимуса оценивали in vitro на Э18 по способности дофамина влиять на пролифера-тивный ответ, индуцированный митогеном конканавали-ном А (Кон А, 2,5 мкг/мл). Для подавления синтеза ка-техоламинов у плодов беременным самкам крыс Вистар внутрибрюшинно вводили а-метил-п-тирозин (а-МПТ, 100 мг/кг массы). У родившегося потомства на 40-й день постнатального развития (П40) в тимусе проводили количественную оценку субпопуляций Т-лимфоцитов, путем окрашивания клеток антителами к поверхностным маркерам CD4, CD8 и CD25 (Cederlain, Канада) с последующим анализом на проточном цитофлуориметре Coulter EPICS XL-MCL (Beckman, США).
Результаты. Согласно полученным данным, в эмбриональном тимусе обнаружена экспрессия мРНК рецепторов к дофамину Д1, Д2, Д3 и Д5 типов. Возрастная динамика экспрессии рецепторов всех изученных типов различна. Тем не менее, следует отметить, что на Э17 уровень экспрессии мРНК относительно высокий для всех типов дофаминовых рецепторов. Добавление дофамина в культуру тимоцитов, выделенных из плодов на Э18, достоверно снижало ответ тимоцитов на митоген КонА для всех использованных концентраций (10-8-10-6 М). Полученные данные свидетельствуют о функциональной активности рецепторов к дофамину на тимоцитах и подтверждают возможность прямого влияния дофамина на развивающийся тимус. Анализ клеточного состава субпопуляций тимоцитов у взрослых крыс, которым фармакологически подавляли синтез катехоламинов на стадиях Э16-17 не выявил различий в динамике созревания
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Т-клеток CD4-фенотипа и CD8-фенотипа, при этом обнаружил увеличение численности естественных регуля-торных Т-лимфоцитов CD4+CD25+ фенотипа, основная функция которых заключается в обеспечении толерантности на периферии.
Заключение. Таким образом, подавление синтеза ка-техоламинов в критический период формирования тимуса (Э16-Э17) приводит к долгосрочным изменениям в Т-системе иммунитета, обусловленным усилением продукции естественных регуляторных Т-лимфоцитов. Присутствие и функциональная активность в тимусе плодов рецепторов к дофамину Д1, Д2, Д3 и Д5 типов свидетельствует в пользу того, что именно дофамин ответственен за описанные эффекты, и подтверждает возможность прямого влияния дофамина на формирование тимуса.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-04-00031.
ЭКСПРЕССИЯ КОМПОНЕНТОВ МОНОАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В РАЗВИВАЮЩЕМСЯ ТИМУСЕ
Лифанцева Н.В., Конеева Ц.О., Мельникова В.И.
ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, Москва, Россия
Введение. Исследование роли моноаминов в прена-тальном развитии имеет особое значение, поскольку при формировании различных структур плода реализуются эпигенетические механизмы, обеспечивающие адаптационную пластичность всех систем организма. Ранее было показано, что дефицит серотонина или дофамина в период активного формирования тимуса у плодов крыс приводит к необратимым морфогенетическим изменениям в функционировании Т-клеточного звена иммунитета в постнатальной жизни. Однако механизмы такого действия моноаминов остаются невыясненными. У половозрелых животных все компоненты моноаминергической системы (синтез, захват, рецепторы) тем или иным образом задействованы в модуляции иммунных реакций. Возможность синтеза моноаминов и их захвата в клетках иммунной системы, а также экспрессия рецепторов в пренатальном онтогенезе не изучены.
Цель и задачи. В настоящей работе исследовали возрастную динамику экспрессии рецепторов к серотонину и дофамину, а также возможность синтеза и транспорта моноаминов в клетках тимуса у плодов крыс.
Материалы и методы. Возрастную динамику экспрессии рецепторов к серотонину и дофамину, в тимусе оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией у плодов, начиная с 15-го дня эмбрионального развития (Э15). Экспрессию молекул-транспортеров и ферментов синтеза серотонина и дофамина исследовали методами ПЦР и Вестерн-блоттинга. Способность тимоцитов на 18-й эмбриональный день к захвату внеклеточных моноаминов оценивали с помощью конфокальной микроскопии живых клеток, которые инкубировали с флуоресцирующим субстратом транспортеров моноаминов (ASP+ 10-7 М) в присутствии или без селективных блокаторов захвата серотонина (флюок-сетин 10-5 М) или дофамина (GBR-12909 10-5 М).
Результаты. В тимусе плодов, начиная с Э15-Э16, обнаружена мРНК рецепторов к серотонину (5-НТ-1а, 5-НТ-1Ь-, 5-НТ-2а, 5-НТ-2Ь и 5-НТ-7) и рецепторов к дофамину ф1, D2, D3, D5). Ферменты синтеза серотонина и дофами-
на — триптофангидроксилаза, тирозингидроксилаза и де-карбоксилаза ароматических аминокислот выявлены в тимусе плодов начиная с 16-го дня с помощью методов ПЦР и Вестерн-блоттинга. Инкубация эмбриональных тимусов (Э18) ex vivo в присутствии предшественников серотонина и дофамина (триптофана или тирозина) с последующим иммуногистохимическим выявлением серотонина или дофамина, соответственно, позволила подтвердить функциональную активность обнаруженных ферментов. Подавление транспорта ASP+ в клетки тимуса (Э18) в присутствии селективных ингибиторов транспорта серотонина и дофамина доказывает способность клеток эмбрионального тимуса активно захватывать внеклеточные моноамины.
Заключение. Таким образом, в развивающемся тимусе плодов крыс присутствуют и функционально активны все компоненты серотонинергической и дофаминерги-ческой систем (синтез, транспорт, рецепторы), что подтверждает возможность прямого влияния моноаминов на формирование тимуса. Существование локальной моно-аминергической системы в эмбриональном тимусе, наряду с высоким уровнем моноаминов в крови плодов, свидетельствует о возможности реализации эффектов моноаминов как через паракринные, так и через эндокринные механизмы, а также позволяет предположить различные функции внутритимического и циркулирующего пулов моноаминов в регуляции развития тимуса.
РОЛЬ ПРОТЕАСОМ И ШАПЕРОНОВ В РЕАКТИВНОСТИ МНОГОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ ВИРУСАМИ И ПАТОГЕНАМИ
Люпина Ю.В., Становова М.В., Ерохов П.А., Абатурова С.Б., Горностаев Н.Г., Михайлов В.С., Шарова Н.П.
ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, Москва, Россия
Реактивность при воздействии неблагоприятных факторов у многоклеточных организмов является ключевым звеном в их способности к адаптации. Протеолитическая активность протеасом, их полипептидный состав и физико-химические свойства, регулируются в соответствии с состоянием клеток и действии внеклеточных сигналов. Целью настоящей работы было выяснение особенностей функционирования убиквитин-протеасомной системы (УПС) и шаперонов при индукции бактериальной или вирусной инфекции в клетках беспозвоночных и млекопитающих, а именно: у эволюционно удаленных классов беспозвоночных, в целомоцитах кольчатых червей Arenicola marina (кл. Polychaeta) и Sf 9 клетках кукурузной листовой совки Spodoptera frugiperda (кл. Insecta), и в клетках ЦНС и лимфоидных органов у крыс. Клетки Sf9 были ифици-рованы бакуловирусом AcMNPV, воспаление у кольчатых червей и крыс вызывалось инъекцией липополисахарида. Реакцию УПС и шаперонов в клетках оценивали через 30 мин, 1 час, 6 часов и 24 часа после инфицирования. Для определения характеристик пулов протеасом и изменения соотношения различных форм при инфицировании у беспозвоночных и млекопитающих изучены на-тивные формы протеасом методом модифицированного нативного фореза и определено содержание 20S- и 26S форм протеасом, а также их регуляторов с помощью метода Вестерн-блоттинга и специфичных антител в осветленные экстрактах из целомоцитов аннелид, Sf9 клеток
