CC BY
27
УДК 577.122.2
11S АКТИВАТОР ПРОТЕАСОМЫ: ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ МОЗГА МЫШЕЙ И ВЛИЯНИЕ НА ГИДРОЛИЗ ПЕПТИДНЫХ СУБСТРАТОВ 20S И 26S ПРОТЕАСОМОЙ
А.В. Бачева, О.В. Коробкина, П.С. Нестерова, В.А. Крячков, А.Г. Габибов*
(кафедра химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; e-mail: [email protected])
Оптимизирована методика выделения регуляторной субчастицы протеасомы 11S из гомогената мозга мыши; определен субъединичный состав выделенного белка. Изучена зависимость скорости гидролиза модельного субстрата Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC от мольного соотношения регуляторного белка 11S к протеасоме 20S. Определены константы Михаэлиса протеасомы 20S из головного мозга мышей линии BALB/c и комплекса протеасомы 20S с регуляторным белком 11S по специфическим флуоресцентным субстратам Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, Ac-Arg-Leu-Arg-AMC, Z-Leu-Leu-Glu-AMC. Показано, что llS-субчастица практически не влияет на связывание специфических флуоресцентных пептидных субстратов протеасомой 20S, но значительно увеличивает скорость гидролиза по всем трем субстратам, при этом не изменяет скорость гидролиза пептидного субстрата протеасомой 26S.
Ключевые слова: протеасома, регулятор протеасомы 11S, активность протеасомы, субъединичный состав.
Протеасома функционирует в каждой эукарио-тической клетке, участвуя в деградации большей части внутриклеточных белков, в том числе неправильно фолдированных и мутантных белков. В клетке протеасома работает в комплексе со специальными регуляторными белками, которые, присоединяясь к основной субъединице, открывают белкам доступ в протеолитическую камеру и могут оказывать влияние на каталитические свойства всего фермента. Один из таких регуляторов - субчастица 19S, обладающая АТФазной активностью и сайтом узнавания убиквитина. Вместе с протеасомой 20S она образует комплекс, называемый протеасома 26S, который занимает центральное место в процессе убиквитин-зависимой деградации белков [1, 2]. Кроме субчастиц 19S эукариотические клетки содержат другие регу-ляторные частицы (PA28, PA200, PI31), которые могут взаимодействовать с протеасомой 20S, тем самым формируя альтернативные формы про-теасомы. Встречаются асимметричные изоформы протеасомы 26S, содержащие разные регулятор-ные частицы на концах 20S. Многие из этих белков влияют на протеолитическую активность про-теасомы, но в отличие от 19S эти альтернативные регуляторы не являются ATP азами и не имеют сайтов связывания поли-убиквитиновых цепей, т.е.
регулируют убиквитин-независимую деградацию субстратов протеасомой.
Семейство регуляторов PA28 (proteasome activator of apparent subunit molecular weight 28 kDa), отсутствующее в клетках низших эука-риот, но обнаруженное у видов от Trypanosoma до млекопитающих, состоит из двух родственных комплексов: PA28a/p и PA28y [3]. Субчастица 11S, иначе называемая REG белок или PA28, способна в отсутствие АТФ увеличивать скорость гидролиза протеасомой субстратов, не меченных убиквитином, открывая вход и выход из протеолитической камеры для продуктов гидролиза. Регулятор протеасомы 11S был впервые идентифицирован в бычьих [4] и человеческих [5] красных кровяных тельцах по способности усиливать пептидазную активность протеасомы 20S по небольшим флуорогенным субстратам в 100 раз. Кроме того, 11S может ассоциировать с комплексом протеасомы 20S и 19S-субчастицы, и для этого процесса также не требуется энергии АТФ [6, 7]. Считается, что в случае образования гибридного комплекса 19S-20S-11S, 19S открывает субстратам доступ в протеолитическую камеру, а 11S регулирует вывод белковых продуктов гидролиза из протеасомы, влияя при этом на длину образующихся фрагментов [8].
*ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Три типа 118-регулятора, идентифицированные у млекопитающих, довольно консервативны, имеют обширное распределение по тканям [9, 10] и называются а-, в- и у-гомологами. Идентичность первичной структуры а- и в-гомологов составляет 50% и около 30-40% с 118-у белком [11]. Все три типа 118-регулятора имеют сходные биохимические свойства - обладают способностью связываться с протеасомой 208 и активировать ее пеп-тидазную активность, но при этом не утилизируют АТФ и не стимулируют деградацию белков [12]. При изучении кристаллической структуры 118а человека показано, что мономеры, составленные из четырех длинных альфа-спиралей, собираются в гептамер массой около 200 кДа, окружающий центральное отверстие, которое служит каналом для прохода пептидных субстратов внутрь про-теасомы или из нее, но не позволяет проходить белкам, обладающим сформированной пространственной структурой [13]. В составе регулятор-ного белка были выделены три функциональных структурных домена: С-концевые остатки, акти-вационная петля и гомолог-специфичная вставка. С-концевой участок 118 играет очень важную роль при связывании с протеасомой 208 [14]. Гепта-мерное кольцо субчастицы 118 имеет форму бочки и содержит центральный канал диаметром 20 А с одного конца и 30 А с другого, связывающегося с протеасомой. Связывание 118 с протеасомой вызывает изменения конформации Н-концевых участков а-субъединиц протеасомы, в результате чего открывается пора, образованная а-кольцом протеасомы, что позволяет субстратам проходить внутрь каталитической полости и делает активные центры фермента более доступными для связывания и гидролиза субстрата [15].
Субъединицы а и в имеют большое сродство друг к другу и склонны образовывать смешанный а/в-гептамерный комплекс стохастического состава, в то время как у-субъединицы чаще образуют гомо-гептамерный комплекс [16]. Разный состав 118-регулятора влияет на то, в каких процессах будет участвовать протеасома. Так, регуляторы, имеющие смешанный а/в-состав, являются интерферон-у-индуцируемыми и принимают участие в презентации антигенов [17]. Кроме того, комплексы, состоящие из а- и в-субъединиц, прочнее связываются с протеасомой и сильнее увеличивают ее пептидазную активность, по всем типам субстратной специфичности, в отличие от у-комплексов, которые усиливают только трипси-ноподобную активность.
Цель настоящей работы состояла в выделении 118-активатора протеасомы из мозга мышей
и изучении его влияния на гидролиз пептидных субстратов 20S и 26S протеасомой.
Экспериментальная часть
Приборы и материалы. Все использованные в работе реактивы были квалификации «х.ч.» или «для молекулярной биологии». Трис-гидроксиметиламинометан (Трис), глицин, гли-церин, ЭД^, лейпептин, MgCl2, дитиотреитол (ДТТ), пептидные флуоресцентные субстраты Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, Z-Leu-Leu-Glu-AMC, Ac-Arg-Leu-Arg-AMC, Н^^^'-тетра-метилэтилендиамин, натриевая соль аденозин-трифосфорной кислоты ^ТФ ), набор белков для калибровки с диапазоном масс от 65 до 669 кДа, голубой декстран («Sigma», CШA); NaCl, (NH4)2SO4, Na,,HPO4, NaH2PO4, диметилсульфоксид (ДМШ), (NH4)2S2O8, додецилсульфат натрия ^CH), акри-ламид, ^^метиленбисакриламид («Хеликон», Россия); бортезомиб («LC Laboratories», CШA), блокирующий реагент ECL+, система проявки для иммуноблоттинга ECL+, нитроцеллюлозная мембрана Hybond С extra («GE Healthcare», CШA); маркеры молекулярной массы Protein Molecular Weight Marker 14,4-116,0 кДа, Prestained Protein Molecular Weight Marker 19,0-118,0 кДа («Fermentas», Литва). Моноклональные антитела мыши к субъединицам a1,2,3,5,6 и 7 20S протеасомы, к субъединице Rpt6 19S регулятора, к субъединицам a, ß и у 11S регулятора; моноклональные антитела кролика к субъединице LMP7; конъюгаты вторичных антивидовых антител с пероксидазой хрена («Enzo Life Sciences», «Santa Cruz», CШA).
Центрифугирование проводили на центрифугах «Eppendorf» (Германия); определение концентрации белка проводили на приборе «NanoDrop-2000» («Thermo Scientific», OTA); флуориметрические измерения выполняли на микропланшетном флуориметре «Multilabel Reader VictorX5» в черных 96-луночных планшетах («Greiner Bio-One», Германия); электрофорез проводили на приборе «MiniPROTEAN» («BioRad», CШA), перенос на мембрану проводили на приборе для полусухого электропереноса «TE77 ECL Semi-dry Transfer Unit» («GE Healthcare», CШA), изображения блоттинг-мембран получали на сканере «ChemiDoc» («BioRad», CШA). Все хроматографические стадии проводили на приборе для скоростной высокоэффективной жидкостной хроматографии («AKTA Purifier», «GE Healthcare») c использованием колонок Superose 6 10/300 GL, Superdex 200 10/300 GL, MonoQ 5/50 («GE Healthcare»), «DEAE TOYOPEARL 650M» («TOYO SODA», Япония).
Растворы. Все растворы готовили на дистиллированной воде или на воде особой чистоты из установки «Milli-Q» («Millipore»).
Буферные растворы для выделения протеасо-мы 20S: Буфер А (20 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 10% глицерина, pH 7,5), Буфер Б (20 мМ Трис-HCl, 250 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 20% глицерина, pH 7,5), Буфер Г (20 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, pH 7,5), Буфер Е (20 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 10% глицерина, pH 7,8).
Буферные растворы для выделения протеа-сомы 26S: Буфер А + 2мМ АТФ, 5 мМ MgCl2; Буферы Б, Г и Е готовили аналогично, с добавлением 5 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ.
Буферные растворы для выделения 11S субчастицы: Буфер А + 10 мкМ лейпептин; Буфер TSD (20 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 10% глицерина, pH 7,5).
Методики. Выделение протеасомы 20S и 26S проводили по методике, описанной в [1820]. Для калибровки колонки Superdex 200 использовали набор белков для гель-фильтрации с диапазоном масс от 65 до 669 кДа и голубой декстран для определения мертвого объема колонки. Элюцию проводили в буфере TSD A. Результаты обрабатывали в программе Microsoft Excel и представляли в виде графика зависимости KJln MW), где значение Kav рассчитывали по формуле
_ Ve - Vo
av _ V-Vo'
где Kav - коэффициент доступности; Ve - объем удерживания белка; Vt - общий объем колонки; V0 - «мертвый» объем колонки.
Выделение регуляторного белка 11S осуществляли по методике, аналогичной той, что использовалась для протеасомы 20S, с некоторыми модификациями: в буфер А для гомогената добавляли лейпептин; высаливание проводили (NH4)2SO4 при 85% от насыщения; полученные осадки растворяли в небольшом количестве буфера TSD и проводили диализ против буфера TSD. Ионообменную хроматографию осуществляли на колонке DEAE TOYOPERL, уравновешенной буфером TSD, элюировали градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,3 М; гель-фильтрацию проводили на колонке Superdex 200, уравновешенной буфером TSD. После каждой хроматографии собранные фракции анализировали на наличие белка 11S флуориметрическим методом по увеличению активности протеа-сомы 20S по специфическому флуоресцентно-
му субстрату (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC). Для этого добавляли очищенную протеасому 20S ко всем фракциям и отбирали те, где наблюдалось резкое увеличение активности протеасомы по сравнению с контролем. Фракции, содержащие US-белок, переводили в буфер для хранения (буфер Г + 10% глицерина) методом диализа (ночь при +4°C). Концентрацию белка определяли по поглощению при 280 нм на приборе «NanoDrop». При необходимости проводили концентрирование на мембранных микроколонках «Amicon Ultra» с пределом отсечения 3 кДа.
Денатурирующий электрофорез в полиакрил-амидном геле проводили по стандартной методике Леммли [21], использовали 12%-й разделяющий гель.
Иммуноблоттинг гомогенатов тканей и фракций, содержащий протеасому 20S, 26S и субчастицу 11S проводили по стандартной методике, например [22, 23], с использованием подходящих первичных антител и вторичных антивидовых антител, коньюгированных с пероксидазой хрена в соответствии с инструкциями производителей. Изображения получали на сканере ChemiDoc с выдержкой 15-30 мин.
Кинетические измерения. Для определения скорости гидролиза пептидных субстратов в непрозрачный черный 96-луночный планшет помещали раствор субстрата в ДМСО, смешанный с буфером Г ([5] = 4-150 мкМ), раствор протеасомы в буфере Г и, если необходимо, раствор активатора 11S, доводили общий объем в лунке до 120 мкл раствором буфера Г. Концентрацию субстратов в ДМСО определяли по поглощению при 324 нм, используя значение коэффициента молярного поглощения, равное 13500 [лхм^моль-1]. Измерение интенсивности флуоресценции проводили в течение 1 ч с интервалом измерений 30 с при длине волны возбуждения 355 нм, длине волны флуоресценции 460 нм и температуре 37°С. Результаты измерений обрабатывали в программе MO Excel. Для определения интенсивности флуоресценции I100 свободного 4-амино-7-метилкумарина (AMC) проводили калибровочное измерение в диапазоне концентраций AMC от 10-6 до 5-10-5 М. Скорость гидролиза рассчитывали по формуле
dl
V =
(i 100 -10 у
где dI/dt - изменение интенсивности флуоресценции за соответствующее время; с - концентрация субстрата; I100 - интенсивность флуорес-
c
ценции AMC; 10 - начальная интенсивность флуоресценции субстрата.
Результаты и их обсуждение
Выделение и очистку протеасомы 20S и 26S осуществляли по трехстадийной схеме; за основу взята методика, описанная в [18-20, 24]. На каждом этапе выделения и очистки протеасомы 26S использовали тот же буферный раствор, что и в случае выделения протеасомы 20S, но с добавлением АТФ, необходимого для осуществления сборки комплекса 20S с субчастицей 19S. Для подтверждения отсутствия других протеаз в образцах, содержащих протеасомы 20S и 26S, проводили ингибиторный анализ с использованием специфического ингибитора бортезоми-ба (PS-341). По литературным данным, борте-зомиб не ингибирует in vitro другие протеазы при концентрации 50 нМ, использованной нами [25]. При добавлении ингибитора в реакционную смесь, содержащую протеасому и флуоресцентный субстрат, наблюдалась полная потеря каталитической активности фермента. Идентификацию протеасомы 20S и 26S в полученных образцах проводили методом Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител на сумму а-субъединиц протеасомы 20S и на Rpt6-субъединицу 19S-субчастицы, входящую в состав комплекса 26S (рис. 1). Представленные результаты доказывают наличие протеасом 20S и 26S в полученных препаратах.
Выделение и очистка 11Sрегуляторного белка протеасомы
Выделение HS-субчастицы осуществлялось по трехстадийной схеме (аналогичной той, что применялась для протеасомы 20S) с использованием некоторых модификаций; за основу взята методика, описанная в [5]. На первом этапе приготовления гомогената тканей в буферный раствор для образца добавляли лейпептин, специфично ингибирую-щий цистеиновые, сериновые и треониновые кар-боксипептидазы, для предотвращения возможного протеолиза выступающих C-концевых участков, присутствующих в структуре US-белка, которые необходимы для связывания с альфа-кольцом про-теасомы 20S [26]. Далее проводили высаливание (NH4)2SO4 при 40% от насыщения для отделения высокомолекулярных белков и вторичное высаливание при 85% для последующего выделения US-белка из полученного образца. Использование данных условий позволяет отделить 11S от про-теасомы 26S, однако остается вероятность соосаж-дения различных белковых примесей.
1 2
Рис. 1. Анализ полученных препаратов протеасом 20S и 26S методом иммуноблотинга: 1 - на сумму а-субъединиц (а 1, 2, 3, 5, 6, 7) 208-субчастицы; 2 - на субъединицу Rpt6 регуляторной субчастицы 19S протеасомы 26S
Для проведения гель-фильтраци полученного образца мы выбрали колонку Superdex 200. Для того чтобы выбрать фракции, содержащие белки с молекулярной массой ~200 кДа, колонку откали-бровали с помощью набора калибровочных белков. Полученный график зависимости коэффициента доступности (Kav) от логарифма молекулярной массы (MW) приведен на рис. 2.
Далее мы проводили ионообменную хроматографию с использованием колонки, заполненной носителем DEAE TOYOPERL. Элюцию осуществляли градиентом NaCl от 0 до 0,3 М в буфере TSD. После каждой хроматографии собранные фракции анализировали на наличие 1 IS-белка. Для этого добавляли выделенную ранее протеасому 20S ко всем фракциям и отбирали те, где наблюдалось резкое увеличение активности протеасомы. Отобранные фракции сами по себе (без добавления протеасомы 20S) не обладали активностью по специфическому субстрату. Кроме того, детектируемое изменение активности протеасомы в присутствии выбранных фракций многократно превосходило значение, полученное в случае гидролиза специфического субстрата отдельно протеасомой 20S. Профили элю-ции и относительная активность полученных фракций представлены на рис. 3.
Рис. 2. Калибровочный график зависимости коэффициента доступности (Kav) от натурального логарифма молекулярной массы белков (ln MW) для разделения глобулярных белков на колонке Superdex 200
Рис. 3. Фрагменты профилей элюции этапа очистки 118-регулятора протеасомы методом гель-фильтрации (а) и ионообменной хроматографии (б). Относительная активность протеасомы по субстрату 8ие-Ьеи-Ьеи-Уа1-Туг-ЛМС в присутствии выбранных фракций представлена в виде столбиков. Градиент концентрации №С1 в элюенте изображен наклонной линией
Идентификацию, а также определение субъединичного состава HS-субчастицы в полученных образцах проводили методом Вестерн-блоттинга с использованием антител на а-, в- и у-субъединицы 11S регуляторного белка. Результаты иммунобло-тинга препарата 11S из головного мозга мышей представлены на рис. 4.
Согласно литературным данным, гептамерное кольцо 11S регулятора может либо иметь стохастический а/в-состав (такой регулятор локализуется в основном в цитоплазме), либо представлять собой моногептамер PA28y, состоящий исключительно из у-субъединиц, который в отличие от PA28a/e обнаруживается в ядре клеток [6, 10]. Комплекс PA28y локализуется в основном в нейронах и предположительно участвует в процессе деления клетки и в онкогенезе [3]. Таким образом, детектированные сигналы, соответствующие всем трем типам субъединиц (а, в и у), свидетельствуют о наличии в полученном нами образце двух типов HS-субчастиц с разным составом.
Изучение зависимости скорости гидролиза модельного субстрата от мольного соотношения регуляторного белка 11S к протеасоме 20S
Для оценки сродства регуляторного белка 11S к протеасоме 20S нами был проведен эксперимент, в котором при увеличении мольного соотношения US-белка к протеасоме детектировалась скорость гидролиза флуоресцентного субстрата Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, отвечающего химотрипсиновой специфичности протеасомы. Из графика зависимости (рис. 5) видно, что скорость гидролиза линейно возрастает при увеличении мольного соотношения белка 11S к про-теасоме 20S от 1:1 до 10:1. Концентрацию белка рассчитывали, исходя из значения оптического поглощения при 280 нм с учетом усредненного коэффициента экстинкции, равного 0,62 для раствора с концентрацией 1 мг/мл (расчет проводился с использованием онлайн-ресурса PROTEIN CALCULATOR v3.4). Полученные нами результаты эксперимента соотносятся с литературными данными. В работе [12] показано, что в интервале
Рис. 4. Определение количества a-, ß - и у-субъединиц регуляторного белка 11S протеасомы в очищенном препарате 11S из мозга мышей линии Balb/C методом иммуноблотинга
0,4
«(11S): п (20S)
Рис. 5. Зависимость скорости гидролиза Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (с = 40 мкМ) от мольного соотношения регуляторного белка 11S к протеасоме 20S
соотношений регулятора 11S к протеасоме 20S от 1:1 до 10:1 наблюдается линейное возрастание скорости гидролиза модельного субстрата (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC). Выход на плато достигается при соотношении 30:1 (11S к 20S), когда в растворе, вероятно, образуется максимальное число комплексов 20S-11S. Для проведения последующих экспериментов мы выбрали мольное соотношение белка 11S и протеасомы 20S, равное 1:2.
Определение кинетических параметров гидролиза модельных флуоресцентных субстратов протеасомой 20S и комплексом протеасомы с регуляторным белком 11S
Одной из важных характеристик фермента являются его кинетические параметры - константы Михаэлиса по специфическим субстратам. Для определения кинетических параметров гидролитической активности протеасомы, а также комплекса 20S с регуляторным белком 11S использовали модельные пептидные субстраты Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, Ac-Arg-Leu-Arg-AMC, Z-Leu-Leu-Glu-AMC, образующие при гидролизе флуоресцентный продукт 7-амино-4-метилкумарин (АМС), и детектировали изменение интенсивности флуоресценции во времени. Мольное соотношение протеасомы 20S к белку 11S составляло 1:2. Измеряли скорость гидролиза при различных концентрациях субстратов (1-150 мкМ), расчет кинетических параметров проводили по методу Лайнуивера-Берка. Полученные значения констант Михаэлиса, сопоставленные с литературными данными, а так же константы Михаэлиса для комплекса протеасомы с US-регулятором и отношение максимальных скоростей гидролиза комплексом 20S + 11S к 20S представлены в табл.1.
Мы выбрали три наиболее часто используемых субстрата, которые соответствуют химотрипси-новой (8ис-Ьеи-Ьеи-Уа1-Туг-АМС), трипсино-вой (Ас-А^-Ьеи-А^-АМС) и каспазоподобной (2-Ьеи-Ьеи-С1и-АМС) типам специфичности протеасомы. Соответствие экспериментально определенных значений констант Михаэлиса литературным данным [27] свидетельствует о высокой степени очистки протеасомы и об отсутствии других протеаз в полученном препарате. Кроме того, полученные нами значения констант Михаэлиса для комплекса протеасомы 208 с 118-регулятором практически не отличаются от значений констант, полученных отдельно для протеасомы, из чего можно сделать вывод о том, что 118-белок не влияет на степень сродства ферментативного комплекса к субстратам, отвечающим трем основным типам специфичности. Однако, как видно из последнего столбца табл. 1, 118-регулятор способствует увеличению скорости гидролиза всех трех субстратов, особенно в случае субстрата, отвечающего химотрипси-новой специфичности. Согласно литературным данным, с использованием небольших флуоро-генных пептидных субстратов установлено, что связывание регулятора 118 а/р с протеасомой увеличивает скорость гидролиза по всем трем типам субстратной специфичности, в то время как регулятор 118-у усиливает активность только по типу трипсина и в некоторой степени инактиви-рует два других типа активности [12]. С помощью Вестерн-блоттинга показано, что в полученном нами образце присутствуют а-, в- и у- субъединицы 118-белка, однако из кинетических данных видно, что увеличение активности по типу трипсина гораздо меньше по сравнению с двумя другими. Поэтому можно сделать вывод о том, что 118-белок, представленный у-субъединицами, в нашем образце практически отсутствует.
В реакции гидролиза 8ис-Ьеи-Ьеи-Уа1-Туг-АМС протеасомой 268 (как в присутствии 118-белка, так и без него) измеряли скорость реакции для концентраций субстрата от 1 до 100 мкМ. Расчет констант проводили по методу Лайнуивера-Берка, результаты представлены в табл. 2. Константа Ми-хаэлиса, полученная нами, хорошо согласуется с литературными данными [27]. Кроме того, видно, что тенденция, намеченная для протеасомы 208 и ее комплекса с регулятором 118, прослеживается и в случае протеасомы 268: присутствие регулятора 118 практически не влияет на константу Михаэлиса, однако и скорость реакции гидролиза протеасомой 268, в отличие от протеасомы 208, не меняется.
Т а б л и ц а 1
Константы Михаэлиса протеасомы 20S и комплекса протеасомы 20S с регуляторным белком 11S из головного мозга мышей линии BALB/c по различным субстратам и их сравнение с литературными
данными
Субстрат Км, мкМ (литературные данные для 20S PR из других тканей) КМ (20S), мкМ КМ (11S + 20S), мкМ Кмакс (11S + 20S)/VмШœ (20S)
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC 44 ± 4 [27] 72 ± 7 84 ± 8 28
Ac-Arg-Leu-Arg-AMC 28 ± 3 [27] 26 ± 3 28 ± 3 4
Z-Leu-Leu-Glu-AMC 49 ± 8 [27] 70 ± 7 95 ± 10 16
Т а б л и ц а 2
Кинетические параметры гидролиза Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC протеасомой 26S в присутствии и в отсутствие регуляторного белка 11S из головного мозга мышей линии BALB/c
и сравнение их с литературными данными
Протеасома Км, мкМ КМ, мкМ [литературный источник] V (11S + PR)/V (PR) макс v ' макс v '
26S 46 ± 4 44,2 ± 3,9 [28] 1
26S+11S 99 ± 10 данные отсутствуют
Таким образом, нами отработана и оптимизирована методика выделения регуляторной субчастицы 118 из гомогената тканей мыши; впервые определен субъединичный состав очищенного 118-регулятора из мозга мышей Ба1Ь/С. Показано, что в полученном образце присутствуют 118-субчастицы, составленные из всех трех типов субъединиц (а, в и у). Определены кинетические параметры гидролиза специфических флуорес-Работа выполнена при финансовой поддержке Р
та РНФ (№
центных субстратов (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, Ac-Arg-Leu-Arg-AMC и Z-Leu-Leu-Glu-AMC) комплексом протеасомы 20S c регуляторным белком 11S из головного мозга мышей линии BALB/c. Показано, что HS-субчастица значительно ускоряет гидролиз протеасомой 20S пептидных субстратов, при этом она не оказывает влияния на константу Михаэлиса и не изменяет кинетических параметров протеасомы 26S.
ФИ (проект № 16-04-01446) и при поддержке гран--50-00131).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lander G.C., Estrin E., Matyskiela M.E., Basho-re C., Nogales E., Martin A. // Nature. 2012. Vol. 482. P. 186.
2. Lecker S.H., Goldberg A.L., Mitch W.E. // JASN. 2006. Vol. 17. N 7. P. 1807.
3. Gao X., Li J., Pratt G., Wilk S., Rechsteiner M. // Arch. Biochem. Biophys. 2004. Vol. 425. P. 158.
4. Ma C.-P., Slaughter C.A., DeMartino G.N. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. N 15. P. 10515.
5. Dubiel W., Pratt G., Ferrell K., Rechsteiner M. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. N 31. P. 22369.
6. Tanahashi N., Murakami Y., Minami Y., Shimba-ra N., Hendil K.B., Tanaka K. //J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 14336.
7. Cascio P., Call M., Petre B.M., Walz T., Goldberg A.L. // The EMBO J. 2002. Vol. 21. N 11. P. 2636.
8. Kloetzel P.M. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001. Vol. 2. N 3. P. 179.
9. Jiang H., Monaco J. // 1997. Vol. 46. P. 93.
10. Soza A., Knuehl C., Groettrup M., Henklein P., Tanaka K., Kloetzel P.M. // FEBS Lett. 1997. Vol. 413. N 1. P. 27.
11. Ahn J.Y., Tanahashi N., Akiyama K., Hisamatsu H., No-da C., Tanaka K., Chung C.H., Shibmara N., Willy P. J., Mott J.D., Slaughter C.A., DeMartino G.N. // FEBS Lett. 1995. Vol. 366. N 1. P. 37.
12. Realini C., Jensen C.C., Zhang Z., Johnston S.C., Knowlton J.R., Hill C.P., Rechsteiner M. // J. Biol. Chem., 1997. Vol. 272. N 41. P. 25487.
13. Whitby F.G., Masters E.I., Kramer L., Knowlton J.R., Yao Y., Wang C.C., Hill C.P. // Nature. 2000. Vol. 408. P. 115.
14. Song X., Mott J.D., von Kampen J., Pramanik B., Tanaka K., Slaughter C.A., DeMartino G.N. // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. N 42. P. 26410.
15. Knowlton J.R., Johnston S.C., Whitby F.G., Realini C., Zhang Z., Rechsteiner M., Hill C.P. // Nature. 1997. Vol. 390. N 6660. P. 639.
16. Zhang Z., Krutchinsky A. // Biochemistry. 1999. Vol. 38. N 17. P. 5651.
17. Groettrup M., Soza A., Eggers M., Kuehn L., Dick T.P., Schild H., Rammensee H.-G., Koszinowski U.H., Kloetzel P.-M // Nature, 1996. Vol. 381. N 6578. P. 166.
18. Белогуров А.А., Пономаренко Н.А., Говорун В.М., Габибов А.Г., Бачева А.В. // Докл. АН. Сер. Биохимия и биофизика. 2009. Vol. 425. N 2. P. 251.
19. Bacheva A.V., Belogurov A.A., Ponomarenko N.A., Knorre V.D., Govorun V.M., Serebryakova M.V., GabibovA.G. // 2009. Vol. 1. N 1. P. 84.
20. Бачева А. В., Белогуров А .А., Кузина Е. С.,
Серебрякова М.В., Пономаренко Н.А., Кнорре В.Д., Говорун В.М., Габибов А.Г. // Биоорг. Химия. 2011. Vol. 37. N 1. P. 39.
21. Laemmli, U.K. // Nature. 1970. Vol. 227. N 5259. P. 680.
22. Belogurov A.Jr., Kuzina E., Kudriaeva A., Ko-nonikhin A., Kovalchuk S., Surina Y., Smirnov I., Lomakin Y., Bacheva A., Stepanov A., Karpova Y., Lyupina Y., Kharybin O., Melamed D., Ponoma-renko N., Sharova N., Nikolaev E., Gabibov A. // FASEB J. 2015. Vol. 29. N 5. P. 1901.
23. Кузина Е. С., Черноловская Е. Л., Кудряева А .А., Зенкова М.А., Кнорре В .Д., Сурина Е. А., Пономаренко Н.А., Бобик Т.В., Смирнов И.В., Бачева А.В., Белогуров А.А., Габибов А.Г., Власов В.В. // Докл. АН. Сер. Биохимия и биофизика. 2013. Vol. 453. N 4. P. 446.
24. Абрамова Е.Б., Астахова Т.М., Ерохов П.А., Шарова Н.П. // Изв. РАН. Сер. биологическая. 2004. Vol. 2. P. 150.
25. Arastu-Kapur S., Anderl J.L., Kraus M., Parlati F., Shenk K.D., Lee S.J., Muchamuel T., Bennett M.K., Driessen C., Ball A.J., Kirk C.J. // Clin. Cancer. Res. 2011. Vol. 17. P. 2734.
26. Ma C.-P., Willy P.J., Slaughter C.A., DeMartino G.N. // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. N 30. P. 22514.
27. Piccinini M., Tazartes O., Mostert M., Musso A., DeMarchi M., Rinaudo M.T. // Brain Res. Mol. Brain Res. 2000. Vol. 76. N 1. P. 103.
Поступила в редакцию 01.12.15
11S PROTEASOME ACTIVATOR: ISOLATION FROM MICE BRAIN AND INFLUENCE ON PEPTIDE SUBSTRATE HYDROLYSIS BY 20S AND 26S PROTEASOME
A.V. Bacheva, O.V. Korobkina, P.S. Nesterova, V.A. Kryachkov, A.G. Gabibov
(Chair of Chemistry of Natural Compounds, Chemistry Department, M.V. Lomonosov Moscow State University)
Purification of 11S proteasome regulator from mice brain was optimized; subunit composition of isolated protein was determined by Western-blot. The dependency of peptidase activity of 20S proteasome on molar concentration of 11S regulator was examined. Michaelis constants of hydrolysis of specific fluorescent substrates Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, Ac-Arg-Leu-Arg-AMC, Z-Leu-Leu-Glu-AMC by 20S proteasome from BALB/c mice brain and by 20S-11S complex. It was shown that 11S subparticle has almost no influence on binding of specific fluorescent substrates by 20S proteasome, but strongly accelerates hydrolysis of all three substrates. At the same conditions 11S proteasome regulator did not change kinetic parameters for 26S proteasome.
Key words: proteasome, 11S proteasome regulator, proteasome activity, subunit composition.
Сведения об авторах: Бачева Анна Владимировна - доцент кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук ([email protected]); Коробкина Ольга Владимировна - студентка химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Нестерова Полина Сергеевна -аспирантка Университета Южной Калифорнии ([email protected]); Крячков Вячеслав Александрович - студент химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (korsatheo@ yandex.ru), Габибов Александр Габибович - заведующий лабораторией биокатализа ИБХ РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, профессор кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, чл.-корр. РАН, докт. хим. наук ([email protected]).
