CC BY
8РОЛЬ НАНОМОЛЯРНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ЭНДОГЕННЫХ ПОРФИРИНОВ В РЕАЛИЗАЦИИ РЕГУЛЯТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА СПЕРМУ ЖИВОТНЫХ
Плавский В.Ю. 1*, Третьякова А.И. 1, Микулич А.В. 1, Собчук А.Н. 1, Плавская Л.Г. 1, Дудинова О.Н. 1, Ананич Т.С. 1, Нагорный Р.К. 1, Свечко А.Д. 1, Якимчук С.В. 1, Леусенко И.А. 1, Будевич А.И. 2, Богданович Д.М. 2
1 Институт физики имени Б.И.Степанова НАНБеларуси, г. Минск 2 РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству», г. Жодино Минская обл.
* E-mail: v.plavskii@ifanbel.bas-net.by DOI 10.24412/2308-6920-2023-6-29-30
Способность низкоинтенсивного излучения видимого спектрального диапазона оказывать модулирующее действие на функциональные характеристики спермы животных в настоящее время практически не ставиться под сомнение. Светоиндуцированные изменения скорости движения и подвижности сперматозоидов, влияние света на поддержание функциональных характеристик спермы при хранении, а также на оплодотворяющую способность сперматозоидов получены как при воздействии оптического излучения на половые продукту млекопитающих (хряка, лошади, осла, быка, барана, кролика, собаки, мыши), так и птиц и холоднокровных гидробионтов (рыб и морских ежей). Считается, что повышение функциональных характеристик спермы под действием излучения обусловлено увеличением синтеза аденозитрифосфата (АТФ), поскольку наблюдается положительная корреляция между подвижностью сперматозоидов и содержанием в них АТФ. Однако, фотофизические и фотохимические механизмы, определяющие регуляторное действие оптического излучения на сперму животных, по-прежнему остаются не выясненными. Не ясны также молекулы, взаимодействие которых со светом приводит к изменению функциональных характеристик сперматозоидов.
В поисках ответа на поставленные вопросы мы исходили из следующих предположений: а) в основе регуляторного действия света лежит изменение редокс-состоянияа клеток, инициируемое образованием активных форм кислорода (АФК) в результате возбуждения эндогенных фотосенсибилизаторов; б) фотосенсибилизаторами в клетке выступают флуоресцирующие соединения, концентрация которых достаточно низкая, исключающая протекание деструктивных процессов.
Цель настоящей работы - обнаружение и идентификация эндогенных молекул, способных генерировать активные формы кислорода при воздействии оптического излучения видимого спектрального диапазона сперму животных (хряков и козлов).
Для выяснения вклада эндогенных молекул в эффекты сенсибилизированного образования активных форм кислорода исследовались спектры аутофлуоресценции спермы (в том числе с лазерным возбуждением), а также спектры возбуждения флуоресценции. Указанные измерения проводились с использованием спектрофлуориметра Fluorolog-3 (Horiba Jobin Yvon Inc., Франция) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути от 3 до 10 мм. Для выяснения вклада активных форм кислорода в фотобиологические эффекты, инициируемые воздействием на сперму лазерного излучения, использовали метод хемилюминесценции с добавлением перед облучением спермы специфических тушителей АФК. При исследовании спектральной зависимости хемилюминесценции применяли твердотельный Nd:YAG лазер (Model LQ629, Солар ЛС, Беларусь) с плавной перестройкой длины волны излучения в видимом диапазоне, работающий в импульсном режиме (F = 100 Гц, т = 17 нс).
Исследования, выполненные в настоящей работе, впервые показали присутствие в сперме животных (козлов, хряков), наряду с флавиновыми сенсибилизаторами, производных протопорфирина IX (PPIX). Следует отметить, что наличие интенсивной флуоресценции флавиновой компоненты спермы, а также светорассеяния весьма затрудняет регистрацию порфириновых фотосенсибилизаторов, присутствующих в сперме в весьма низкой концентрации (на уровне 1 нМ), и к тому же характеризующихся низким квантовым выходом флуоресценции (для PPIX ффл = 0,04). Для повышения аналитических возможностей детектирования производных PPIX нами разработан новый метод, основанный на предварительной обработке спермы 3М соляной кислотой. Такая обработка резко снижает интенсивность флавиновой компоненты спермы и усиливает флуоресценцию свободных порфиринов за счет их дезагрегации и перехода в дипротонированную мономерную форму.
На рис. 1 представлены спектры аутофлуоресценции и возбуждения флуоресценции спермы различного видового происхождения как без пробоподготовки, так и после предварительной обработки спермы 3М соляной кислотой.
I, отн. ед. 1,0
0,8
0,6
0,4
0,0
400 445
I, отн. ед. 1,0
0,8
0,6
400 500 600
Длина волны, нм
400 500 600 700
Длина волны, нм
Рис. 1. Спектры флуоресценции (1, 3) и возбуждения флуоресценции (2, 4) спермы козла (а) и хряка (б) в отсутствии добавок (1, 2) и в присутствии 3 M HCl: А-возб = 532 нм (1), Яетб = 405 нм (3), Ярег = 623 нм (2); Ярег = 655 нм (4)
Причем для обнаружения порфириновой составляющей в сперме возбуждение флуоресценции осуществлялось как ламповыми, так и лазерными источниками непрерывного режима работы. Представленные данные не оставляют сомнений о присутствии в сперме порфириновых фотосенсибилизаторов, флуоресцирующих в красной области. Наиболее высокие концентрации производных PPIX регистрируются в сперме козла, что позволило зарегистрировать их флуоресценцию в нативной сперме без пробоподготовки. На основании полученных результатов сделан вывод, что протопорфирины наряду с соединениями флавиновой природы, присутствующие в сперме животных и способные эффективно генерировать синглетный кислород, могут выполнять функцию фотоакцепторов оптического излучения видимой области спектра.
С помощью хемилюминесценции впервые получены подтверждения светоиндуцированной генерации активных форм кислорода в сперме указанных животных. Как следует из рис. 2, кинетические зависимости интенсивности хемилюминесценции для предварительно облученных образцов спермы представляют собой ниспадающие кривые, тогда как средняя интенсивность хемилюминесценции для контрольных (интактных) образцов практически остается неизменной на протяжении всего времени регистрации сигнала. Характерно, что внесение перед облучением спермы тушителя синглетного кислорода азида натрия снижает светосумму хемилюминесценции, что указывает на участие данной АФК в фотохимическом процессе. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от длины волны воздействующего излучения, представленная на рис. 3, свидетельствует, что интенсивность хемилюминесценции, инициированной излучением, соответствующим максимуму полосы Соре порфиринов (Я = 405 нм), значительно превышает интенсивность сигнала, инициированного воздействием на сперму излучения с длиной волны Я = 440 нм, соответствующего максимуму поглощения флавинов (флавинмононуклеотида, ФМН или флавинадениндинуклеотида, ФАД).
Рис. 2. Кинетические кривые изменения интенсивности хемилюминесценции облученных и необлученных образцов спермы хряка
390 400 410 420 430 440
Длина войны, нм
Рис. 3. Зависимость интенсивности хемилюминесценции спермы хряка от длины волны воздействующего излучения
Поскольку длина волны излучения X = 405 нм соответствует локальному минимуму в спектре поглощения флавинов, то более высокая интенсивность хемилюминесценции спермы после воздействия указанного излучения позволяет сделать вывод об определяющей роли эндогенных порфиринов в сенсибилизированном образовании активных форм кислорода в сперме животных.
600
405
3
0,4
0,2
0,0
700
