CC BY
303
УДК 577.344.3
ФОТОДИНАМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В КЛЕТКАХ. ПЕРВИЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ
© 2°1° Пиняскина Е.В.
Прикаспийский институт биологических ресурсов ДНИ, РАН
Изложены основные представления о фотодинамическом действии оптического излучения на клеточные структуры и клетки в целом. Рассмотрены механизмы и принципы разделения первичных фотодинамических реакций на реакции типа I и II в биологических системах.
The basic representations about photodynamic act of optical radiance on cellular structures and cells as a whole are stated. Mechanisms and principles of separation ofprimary photodynamic reactions to reactions of type I and type II in biological systems are observed.
Ключевые слова: перекисное окисление, синглетный кислород, свободные радикалы, триплетное состояние, фотодинамическое действие.
Keywords: peroxidation, singlet oxygen, free radicals, triplet state, photodynamic action.
Экспериментально доказано, что весь оптический диапазон электромагнитного излучения Солнца и искусственных источников активно воздействует на организм человека и животных. Наиболее острые эффекты индуцируются ультрафиолетовым светом (200-400 нм), который, наряду с положительным действием, при определенных условиях инициирует фотодеструктивные реакции, приводящие к изменениям структуры и функции ДНК, фотоинактивации белков, повреждению биомембран и др.
Причем, если средневолновый ультрафиолет (275-320 нм) напрямую взаимодействует с нуклеиновыми кислотами и белками, то излучение более длинноволнового диапазона (320-400 нм) инициирует в этих структурах деструктивные реакции через молекулы-
посредники. Вещества, выступающие в качестве первичных акцепторов световой энергии, называют фотосенсибилизаторами (ФС), а процессы, в которых они участвуют, -фотосенсибилизированными [2-3, 5].
В качестве сенсибилизатора в клетках могут выступать как естественные метаболиты -хлорофилл, флавины, порфирины, билирубин (эндогенные сенсибилизаторы), так и широкий круг попадающих в клетки экзогенных веществ - акцепторов видимого света (красители, ароматические углеводороды). Повреждение биологических структур и нарушение их функций под действием фотосенсибилизаторов в присутствии кислорода называют фотодинамическим действием (ФД).
Впервые ФД эффект описали в 1900 году О. Рааб и Херманн фон Таппайнер.
Рассмотрим первичные механизмы основных типов фотохимических реакций, которые индуцируются в клетках светом различных длин волн и обусловливают фотодинамическое действие на клетки.
Фотосенсибилизатор при поглощении кванта света (hv) переходит из основного состояния (Senso) в синглетное (Sens*):
Senso + hv^ Sens*.
Это состояние короткоживущее (10-9-10-8с), поэтому вероятность взаимодействия молекулы ФС в этом состоянии с субстратом мала. Из синглетного возбужденного состояния молекула ФС может вернуться в основное состояние Sens0, высветив квант света люминесценции, либо безызлучательно - в результате внутренней Sens* ^ Sens0, или интеркомбинационной конверсии (переход электрона с обращением спина): Sens* ^ 3Sens* конверсия молекулы ФС в возбужденное триплетное состояние (3Sens*)
Обычно в легких атомах и двухатомных молекулах синглет-триплетные переходы не происходят. Но в тяжелых атомах и многоатомных органических молекулах (к которым относятся ФС) запрет на синглет-триплетные переходы снимается благодаря спин-орбитальному взаимодействию [1, 2].
Фотосенсибилизированные деструктивные реакции во многих случаях протекают с участием кислорода. Эти процессы, названные фотодинамическими, по своему механизму разделяются на два типа в зависимости от того, каким образом энергия светового возбуждения передается от сенсибилизатора к биологическому субстрату. Они могут быть представлены в виде следующей общей схемы [2]:
t 0x01 graphic
Sens* - возбужденный фотосенсибилизатор, подвергшийся первичным изменениям, *Sens + - его окисленная форма, А - молекула биосубстрата, участвующая в реакции на последующей стадии.
В реакциях I типа взаимодействие молекулы ФС с близлежащими молекулами биологического субстрата приводит к переносу электрона или атома водорода [2]. Первичной стадией этих реакций обычно является отрыв электрона (водорода) от молекулы субстрата фотовозбужденной молекулой фотосенсибилизатора ( Sens). Кислород в этом случае является окислителем фотовосстановленного фотосенсибилизатора, который переходит в исходное состояние и образуется супероксидный анион-радикал:
*Sens+X^*Sens-+ *X+
*Sens-+O2^Sens+
^ —I—
В итоге первичной фотореакции образуются два свободных радикала X и *
. Дальнейший сценарий окислительного процесса во многом зависит от природы субстратов и фотосенсибилизаторов. При окислении углеводородов, спиртов, эфиров, органических кислот и липидов первичные радикалы Х*+ или их депротонированные формы могут присоединять кислород, образуя, таким образом, реакционно-способные перекисные радикалы RO 2. В этих реакциях образуются перекиси органических соединений (ROOH, ROOR) и стабильные продукты деградации, содержащие кето- и гидроксильные группы. Супероксидные радикалы и их протонированные аналоги -пергидроксильные радикалы обладают окислительной способностью и при дисмутации образуют перекись водорода. Реакции перекисей с указанными выше свободными радикалами приводит к образованию еще более сильного окислителя - гидроксильного радикала:
Образующиеся активные формы кислорода при взаимодействии с ненасыщенными жирными кислотами биологических мембран инициируют цепное перекисное окисление липидов, повреждение биомембран и нарушение их функций [14, 15, 22]. Поскольку время жизни молекулы ФС в триплетном состоянии (10-4-102 с) намного больше, чем в синглетном, то ФД осуществляется в основном через триплетное состояние красителя [5, 20]; кроме того, молекула в триплетном состоянии способна легче как отнимать электроны (атомы водорода) от других молекул, так и донировать эти частицы молекулам субстрата. Эффективность таких реакций зависит от химической структуры сенсибилизатора и субстрата, а также от условий протекания реакции. Так, фотосенсибилизированные реакции типа I с наибольшей эффективностью протекают при высокой концентрации субстрата и низкой концентрации кислорода, поскольку кислород является сильным конкурентом молекулы субстрата за взаимодействие с триплетным сенсибилизатором. Можно ожидать, что образование нековалентных комплексов между сенсибилизатором и субстратом до облучения увеличит вероятность реакций типа I из-за близости сенсибилизатора к молекулам субстрата. Во-вторых, наиболее эффективно фотодеградируют по механизму I те субстраты, которые легко окисляются или восстанавливаются [16, 20].
Г лавный механизм фотосенсибилизированной реакции типа II заключается в переносе энергии от триплетного сенсибилизатора на основное состояние кислорода с образованием электронно-возбужденного синглетного состояния кислорода (1О2) и основного состояния сенсибилизатора:
t OxO1 graphic
Сенсибилизатор Senso поглощает квант света и переходит в синглетное возбужденное состояние ^ш*. В результате интеркомбинационной конверсии образуется триплетное состояние сенсибилизатора 3Sens*, способного взаимодействовать с невозбужденным кислородом 3О2 и передавать ему энергию с образованием электронно-возбужденного синглетного кислорода 1О2. С меньшей эффективностью некоторые триплетные сенсибилизаторы способны осуществлять одноэлектронное восстановление
молекулярного кислорода с образованием супероксидного анион-радикала
I
Образовавшийся синглетный кислород примерно в 100 раз эффективней невозбужденного О2 и окисляет липиды, белки и другие биомолекулы [14].
Синглетный кислород может существовать в двух возбужденных состояниях: одно 1Дg с высокой энергией (~ 1.6 эВ), другое ^+ - с более низкой энергией (~1 эВ). В состоянии ^+ неспаренные электроны находятся на разных уровнях и пространственно разделены.
1Sg+
t 0x08 graphic
t 0x08 graphic
t 0x08 graphic
t 0x08 graphic
1Ag
t 0x08 graphic
t 0x08 graphic
t 0x08 graphic
t 0x08 graphic
3%
t 0x08 graphic
t 0x08 graphic
t 0x08 graphic
В ^ состоянии занята одна и та же орбиталь. Свойства синглетного кислорода в обоих состояниях различны. Считается, что состояние 3^, как и 12g+, бирадикальное. Время жизни ^+ состояния в растворе составляет 0,01-0,1 нс, тогда как -состояние обладает намного более длительным временем жизни (от 2-4 мкс в воде до нескольких десятков мкс в липидах) [7, 20]. Поэтому 1Дg состояние является основной формой синглетного кислорода, участвующей в фотодинамических реакциях. Наличие переноса энергии на кислород от триплетного сенсибилизатора и перевод его в 1Дg состояние показано прямым методом измерения флуоресценции с максимумом при 1272 нм [7]. Эффективный перенос энергии от 3Sens на 3О2 возможен лишь в том случае, если энергия 3Sens - состояния больше энергии синглетного уровня кислорода. Так как для молекулы кислорода величина энергии перехода в - состояние весьма мала, то практически любая органическая молекула, находящаяся в триплетном состоянии, способна сенсибилизировать образование синглетного кислорода.
Выше отмечалось, что к механизму фотосенсибилизации типа II можно отнести и реакции, в которых происходит перенос электрона от молекулы триплетного сенсибилизатора на кислород.
Образующийся (
!
) является относительно долгоживущей формой кислорода (~2 мс при физиологических рН) и способен вызывать депротонирование некоторых молекул [20]:
» 0x01 дгарЫо
где КН - донор водорода.
Однако, поскольку он характеризуется относительно низкой реакционной способностью, его повреждающее действие на биоструктуры реализуется главным образом за счет образования других реакционных частиц (НО 2, Н2О2, ОН 4
гидроксильного радикала ОН*, который может образовываться из ) в катализируемых ионами железа реакциях Габера-Вейса:
и в первую очередь -
Ї
» 0x01 дгарЫо
где Н2О2 является продуктом либо дисмутации
!
0
□
» 0x01 дгарЫо
либо его одноэлектронного восстановления:
t OxO1 graphic
Наиболее реакционноспособный радикал ОН* легко взаимодействует с большинством биомолекул, отрывая или присоединяя атом водорода. В воде время жизни ОН <1 мкс, вследствие чего он, как и синглетный кислород, реагирует с молекулами биосубстрата в ближайшем микроокружении [7, 16, 20].
Реакции типа II подобны фотореакциям типа I, поскольку ведут к образованию свободных радикалов и включению их в деструктивные процессы.
Главное различие между фотореакциями типа I и II состоит во вкладе синглетного кислорода в эти фотопроцессы. В фотореакциях типа I его роль несущественна. Реакции типа II, наоборот, определяются преимущественно активностью 1O2. В реальных химических и биологических системах, как правило, оба механизма действуют одновременно и их относительный вклад сильно зависит от концентрации кислорода, концентрации и природы окисляемых реагентов, природы фотосенсибилизаторов и многих других факторов, причем относительный вклад механизмов типа I или типа II может изменяться в ходе фотохимического процесса [7, 16].
Реакции обоих типов (I и II-го) ведут к повреждению клеточных структур и, как правило, гибели клетки. Они могут протекать одновременно, конкурируя друг с другом. Эффективность каждого типа зависит от конкретного ФС, субстрата, концентрации кислорода, а также сродства ФС с субстратом. Некоторые классы фотосенсибилизаторов (например, флавины, кетоны) участвуют в ФД реакциях I типа [2, 14].
В качестве эндогенных сенсибилизаторов при фотосенсибилизированном образовании кислородозависимых одноцепочечных разрывов в ДНК могут выступать такие распространенные биохимические компоненты, как НАДН, 4-тиоуридин и 2-тиоурацил, которые имеют максимум поглощения в длинноволновой ультрафиолетовой области спектра (ДУФ 340 нм) [1, 13, 21]. Показано, что фотосенсибилизированная этими соединениями инициация разрывов в ДНК осуществляется по фотодинамическому механизму с участием активированных форм кислорода. При этом первичной
фотогенерируемой формой кислорода является супероксидный анион-радикал (*
). Сам он обладает сравнительно малой реакционной активностью в отношении компонентов ДНК. Поэтому в качестве непосредственного инициатора разрывов в ДНК выступает его значительно более реакционноспособный продукт - гидроксильный радикал ОН. Фотосенсибилизированные НАДН реакции образования кислородных радикалов, приводящие к одноцепочечным разрывам в ДНК, можно представить в виде следующей схемы [1, 13]:
Отсутствие зависимости выхода пиримидиновых димеров от кислорода при облучении ДНК ДУФ-светом свидетельствует о том, что их образование осуществляется не по фотодинамическому механизму, а путем молекулярной фотосенсибилизации, при которой энергия возбуждения с молекулы хромофора, поглотившей квант света, переносится на пиримидиновые основания ДНК.
ДУФ-свет индуцирует в ДНК образование двух основных фотопродуктов: пиримидиновых димеров и одноцепочечных разрывов [1-3, 5, 17, 18, 20]. Выход димеров
не зависит от того, в каких условиях производят облучение ДНК - аэробных или анаэробных, то есть процесс не является кислородозависимым.
1 0x08 дгарЫо
» 0x01 дгарЫо
В то же время разрывы наблюдаются только при облучении ДНК в присутствии кислорода. Эти данные свидетельствуют о различных механизмах образования двух типов фотопродуктов. Поскольку, молекула ДНК не может служить первичным хромофором при действии УФ-излучения длин волн больше 320 нм, (так как длинноволновая граница ее поглощения лежит при 300-310 нм), значит, и димеры, и разрывы должны образовываться не за счет прямого поглощения квантов молекулой ДНК, а косвенным путем с участием определенных молекул-хромофоров, выступающих в качестве эндогенных сенсибилизаторов. Очевидно, что как сами хромофоры, так и механизмы сенсибилизируемых ими фотохимических реакций, приводящих к образованию димеров и разрывов, должны быть различными.
Зависимость выхода разрывов от содержания кислорода позволяет считать, что образование этих фотопродуктов идет по фотодинамическому механизму. Такой механизм, как известно, осуществляется при наличии трех компонентов: свет + хромофор + О2. Молекула возбужденного хромофора (сенсибилизатора) может непосредственно взаимодействовать с субстратом либо, альтернативно, с кислородом в реакционной смеси, приводя к образованию активных интермедиатов, которые, в свою очередь, способны реагировать с субстратом [14, 16-18, 20]. Таким образом, как и любая фотохимическая реакция, фотосенсибилизированный процесс имеет начальную «световую стадию», за которой следуют «темновые стадии». Большинство фотосенсибилизированных реакций протекает по весьма сложному механизму, включающему несколько конкурентных процессов. Наиболее характерные типы реакций, в которые вступают возбужденные (главным образом триплетные) сенсибилизаторы с молекулами биосубстрата, заключаются либо в переносе электронов (или атомов водорода) (реакция типа I), либо в переносе энергии (электрона) на кислород (реакция типа II) [16, 20, 21].
При облучении фотосенсибилизаторы обычно не претерпевают химических превращений, а выступают в роли триплетных фотокатализаторов.
Наряду с фотодинамическими деструктивными процессами, известны механизмы фотосенсибилизации, не требующие участия кислорода. Такие фотосенсибилизированные реакции, протекающие, в частности, в ДНК, реализуются с участием молекул сенсибилизаторов, которые либо передают энергию на азотистые основания, обеспечивая тем самым их последующую димеризацию, либо в возбужденном состоянии реагируют с мононуклеотидами, образуя аддукты [3, 21]. К первой группе фотосенсибилизаторов относятся некоторые кетоны; вторую группу составляют производные фурокумаринов (псоралены).
Известно, что основной мишенью фотодинамического повреждающего действия, как правило, является клеточная мембрана [5-10]. Вызываемые фотодинамическим действием
процессы деструкции мембран связаны с нарушением барьерной функции мембран и, главным образом - с фотолизом липидов [2, 5, 7, 9, 11, 13-15, 18, 22]. В результате фотоокисления образуются гидроперекиси и продукты их дальнейшего превращения. При этом протекают две фотохимические реакции: кислородзависимая цепная реакция перекисного окисления, заканчивающаяся образованием гидроперекисей, и реакция разложения гидроперекисей, при которой накапливаются различные продукты, в частности, альдегиды и кетоны.
Фотодинамические реакции наблюдаются при наличии в клетках экзо- и эндогенных сенсибилизаторов (НАДН, хлорофиллы, порфирины и др.). Выше рассматривались возможные механизмы фотодинамического действия, связанные со вступлением сенсибилизатора в окислительно-восстановительные реакции с биосубстратом или образованием синглетного кислорода.
Большой интерес для практической фотобиологии представляют сенсибилизаторы порфиринового ряда. В биосистемах в присутствии кислорода порфирины обычно вступают в фотореакции II типа. Энергии первого триплетного состояния порфиринов (200 кДж/моль) достаточно для образования Ю2 (95 кДж/моль). Эффективность генерации 1О2 зависит от вида порфирина, причем она резко падает при включении в кольцо атома металлов.
Основной мишенью при порфириновой фотосенсибилизации являются мембранные структуры клеток [1-2, 13-15, 22]. Эффективность фотосенсибилизированных порфиринами реакций в мембранах определяется в первую очередь чувствительностью к фотоповреждению их основных компонентов липидов и белков. Сенсибилизированное фотоокисление липидов вызывает увеличение вязкости липидной фазы мембран, а также структурные изменения, что приводит к резкому снижению барьерных свойств липидных бислоев [1-2, 8-10, 15].
В липидах мембран сенсибилизированному фотоокислению подвергаются практически только ненасыщенные жирные кислоты, причем чувствительность их растет пропорционально количеству двойных связей в углеводородных цепях. Реакции фотосенсибилизированного окисления ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов, а также холестерина сходны с реакциями, протекающими при ПОЛ [8, 9, 13-15, 17, 22].
В белках мембран фотосенсибилизированные изменения проявляются в первую очередь в образовании ковалентных сшивок между различными полипептидными цепями [3, 5, 17]. Получено большое количество данных, указывающих на то, что основным интермедиатом в реакции фотоповреждения ферментов служит 1О2 [2, 4, 5, 9, 12, 13, 15,
21, 22]. Константы скорости реакции 1О2 с белками весьма велики (109-1010М-1с-1), на несколько порядков выше, чем с другими биологически важными молекулами, что обусловливает высокую эффективность повреждения мембранных белков при фотосенсибилизации.
Рассмотренные процессы фотосенсибилизированного окисления белков и липидов мембран, приводящие к потере их важнейших биологических функций, обусловливают гибель клеток при фотодинамическом действии видимого света в присутствии экзогенных порфириновых сенсибилизаторов.
Есть экспериментальные данные об участии в фотодинамической инактивации клеток и эндогенных порфиринов [10-12]. В частности, было показано, что основной мишенью при инактивации дрожжевых клеток, вызываемой видимым светом, является не ДНК, а плазматическая мембрана, нарушение барьерной функции которой связано преимущественно с фотосенсибилизированным окислением мембранных липидов с участием синглетного кислорода [1, 2, 6-9, 11, 13, 15-17, 21, 22].
В большинстве случаев живые системы, содержащие эндогенные сенсибилизаторы, надежно защищены от повреждающего действия видимого света. В фотосинтезирующих клетках возможность сенсибилизированного хлорофиллом фотоповреждения минимизирована присутствием большой концентрации каротиноидов, которые являются тушителями как синглетного кислорода, так и хлорофилла в триплетном состоянии [14]. Однако некоторые нарушения метаболизма клеток могут привести к чрезмерному накоплению фотосенсибилизаторов и к протеканию фотодеструктивных реакций.
В естественных условиях фотодинамическое действие является причиной многообразных биологических эффектов, которые определяют фоторегуляцию метаболизма отдельных клеток, тканей, организмов и целых экосистем. В клетках, не имеющих эффективных фоторецепторных систем, фотодинамическое действие как часть окислительного стресса играет сигнальную функцию, активируя экспрессию генов и синтез каскада ферментов, ответственных за защитные реакции клеток [2, 4, 7-9, 22].
Примечания
1. Бурчуладзе Т. Г., Фрайкин Г. Я. Изучение механизма НАДН-сенсибилизируемого образования разрывов в ДНК при облучении ближним УФ-светом // Молекулярная биология. 1991. Т. 25. С. 955-959. 2. Владимиров Ю. А., Потапенко А. Я. Физикохимические основы фотобиологических процессов. М. : Высшая школа, 1989. 3. Завильгельский Г. Б. Фотохимия нуклеиновых кислот // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М. : Наука, 1988. С. 5-22. 4. Кару Т. И. Клеточные механизмы низкоинтенсивной лазерной терапии // Усп. совр. биол. 2001. № 121(1). С. 110-120. 5. Конев С. В., Волотовский И. Д. Фотобиология. Минск : Изд-во БГУ, 1979. 385 с. 6. Красновский A. A. мл., Дроздова Н. Н., Иванов A. В., Амбарцумян Р. В. Активация молекулярного кислорода инфракрасным лазерным излучением в аэробных системах, не содержащих пигментов // Биохимия. 2003. № 9. С. 1178-1182. 7. Красновский А. А. Фотодинамическая регуляция биологических процессов: первичные механизмы // Проблемы регуляции в биологических системах / под общей ред. А. Б. Рубина. М.-Ижевск : НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2006. 480 с. 8. Красновский А. А. Первичные механизмы фотоактивации молекулярного кислорода. История развития и современное состояние исследований // Биохимия. 2007. Вып. 10. С. 1311-1331. 9. Красновский А. А. Фотодинамическое действие и синглетный кислород // Биофизика. 2004. № 2. С. 305-322. 10. Пиняскина Е. В., Беленикина Н. С., Фрайкин Г. Я., Рубин А. Б. Индуцированное красным светом восстановление жизнеспособности дрожжей при фотодинамическом действии оптического излучения // Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2007. №1. С. 31-34. 11. Страховская М. Г., Фрайкин Г. Я., Пиняскина Е. В. O локализации порфиринового соединения в плазматических мембранах дрожжей и его участии в фотосенсибилизации перекисного окисления липидов // Биохимия. 1995. Т. 60. № 7. С. 1155-1160. 12. Страховская М. Г., Власова Е. В (Пиняскина), Фрайкин Г. Я. Исследование флуоресценции изолированных плазматических мембран дрожжей в видимой области спектра // Биофизика. 1998. Т. 43. Вып. 3. С. 447-452. 13. Фрайкин Г. Я., Поспелов М. Е., Кирпичникова Н. А., Тимофеев К. Н. НАДН-эндогенный сенсибилизатор клеток дрожжей при их фотоинактивации длинноволновым УФ-светом // Биофизика.
1989. Т. 34. С. 251-254. 14. Черницкий Е. А., Воробей А. В. Фотосенсибилизированные повреждения биологических мембран // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М. : Наука, 1988. С. 102-111. 15. Girotti A. W. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems // Photochem. Photobiol. 1990. V. 51. P. 497-509. 16. Grossvainer L. A., Patel A. S. and Grossvainer J. B. Type I and Type II mechanisms in the
photosensitized lysis of phosphatidylcholine liposomes by hematoporphyrin // Photochem. Photobiol. 1982. V. 38. P. 159-167. 17. Jagger J. Near-UV radiation effects on microorganisms // Photochem. Photobiol. 1981. V. 34. P. 761-768. 18. Moan J. Q. Peng. 2003. An outline of the hundred-year history of PDT // Anticancer Res. 23: 3591-3600. 19. Scott J., Quiruke J. M. E., Vreman H. J., Stevenson D. K., Downum K. R. Metalloporphyrin phototoxicity // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 1990. V. 7. P. 149-157. 20. Spikes J. D. Photosensitization // The Science of photobiology. N. Y. : Plenum Publishing Corporation. 1989. P. 79-110. 21. Tyrrell R. M., Keyse S. M. The interaction of UVA radiation with cultured cells // J. Photochem. Photobiol. 1990. V. 4. P. 349-361.
22. Vladimirov Yu. A., Olenev V. I., Suslova T. V., Cheremisina Z. V. Lipid peroxidation in mitochondrial membrane // Adv. Lipid Res. 1980. V. 17. N 1. P. 173-249.
Статья поступила в редакцию 15.02.2010 г.
Естественные и точные науки •••
НАДН НАДН* НАД+ Н2О2
ДНК
Ьу
* ОН
О2
*О2
одноцепочечные разрывы
