Влияние многократного рассеяния на спектры аутофлуоресценции и квантовый выход патологических состояний живых объектов Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

УДК 535.33/.34 535.3

ВЛИЯНИЕ МНОГОКРАТНОГО РАССЕЯНИЯ НА СПЕКТРЫ АУТОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И КВАНТОВЫЙ ВЫХОД ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ЖИВЫХ ОБЪЕКТОВ

© 2007 г. К.М. Гираев, Н.А. Ашурбеков, О.А. Омаров, Р. Т. Меджидов

The spectra of steady-state fluorescence and diffuse reflection for in vivo mucous duodenum tissues in norm and with callus ulcer defects have been studied. The factors distorting the fluorescence spectral contour form have been determined, and the spectral distribution of autofluorescence and quantum yield for bioobjects under investigation has been obtained.

В последнее время стационарная лазерно-индуци-рованная флуоресцентная спектроскопия нашла широкое применение в медицинской диагностике при обнаружении патологических процессов (отклонений от нормы), включая процессы малигнизации в тканях кожи, нервной системы, органов грудной клетки, брюшной полости (например, [1-3]). Анализ результатов таких исследований часто является неоднозначным. Как правило, наблюдаемые спектры испытывают значительные искажения вследствие объемного рассеяния фотонов флуоресценции на оптических неоднородно-стях биотканей (структурные элементы биоткани, клеточные элементы и надмолекулярные агрегаты) и их реабсорбции кровью, пигментами и эндогенными хромофорами. В таких случаях оценить величину искажения формы спектрального контура и интенсивности флуоресценции можно при последовательном измерении и совместном анализе спектров диффузного отражения Rd (Лет) и лазерно-индуцированной флуоресценции F(Яет) биотканей, измеренных в едином спектральном интервале - эмиссии флуоресценции Хет .

Настоящая работа посвящена изучению влияния эффектов реабсорбции и многократного рассеяния на излучательные свойства биологических тканей. С этой целью проводились исследования спектральной зависимости стационарной флуоресценции и диффузного отражения объектов in vivo по мере развития в них патологических процессов. На основе полученных данных учитываются факторы, вносящие искажения в спектры свечения, а также определено спектральное распределение коэффициента собственной флуоресценции (аутофлуоресценции) в(Лет) и квантового выхода р(Лет) для исследуемых объектов.

Материалы и методы

Изучение флуоресцентных свойств патологических состояний биотканей проводилось на 35 образцах слизистой 12-перстной кишки с каллезной формой язвенных дефектов во время плановых операций, непосредственно перед удалением органа или сразу же после удаления в течение первых ~5-10 мин. При этом исследовался край язвенного дефекта и участок биоткани, удаленный на ~10 см от видимой границы патологического очага. Гистохимический анализ биотканей установил, что в ~90 % случаев таких патологий для участков удаленных на ~10 см от видимого края поражения характерны функциональные рас-

стройства или легкие поверхностные дефекты с незначительные морфологические изменения. Такие биоткани считались здоровыми и были выбраны в качестве контрольной группы.

Все удаленные объекты сразу же после их резекции помещались в контейнер с гомологической плазмой для предотвращения наступления тканевого окоченения и находились там до начала эксперимента при температуре ~0 °С. Данная методика активно используется в трансплантологии при пересадке органов и позволяет их считать как живые объекты [4].

Измерение спектров ^(Лет) и Я^ (Лет) проводилось с разверткой по длинам волн в диапазоне 300800 нм с применением пары волоконных световодов (диаметр ~200 мкм, числовая апертура —0,12), один из которых использовался как передающий, а другой -принимающий. Во избежание бликов зеркального отражения, передающий световод был ориентирован вертикально к поверхности объекта, а принимающий -под углом ~25°. В качестве спектрального прибора использовался монохроматор МДПС-2 с дифракционной решеткой 600 штр./мм и линейной дисперсией ~2,8 нм/мм в первом порядке решетки. Возбуждение спектров флуоресценции осуществлялось при помощи излучения азотного лазера ЛГИ-505 на длине волны ~337,1 нм, а спектров диффузного отражения - ксе-ноновой лампой ДКсШ-150, совмещенной с электромеханическим модулятором. Сигнал детектировался при помощи ФЭУ и, пройдя каскад селективного усилителя, подавался на вход АЦП, согласованного с компьютером.

Для каждого исследуемого участка было проведено по 10 серий измерений. Разница в результатах каждой серии не превышала —10-15 %. Окончательный результат по каждому исследуемому участку и случаю заболевания определялся путем усреднения серийных измерений.

Проведение спектральных исследований ^(Лет) и Яй (Лет) при одинаковой геометрии возбуждения и

регистрации фотосигналов позволило воспользоваться аналитической моделью, предложенной в [5] и развитой в [6, 7]. Согласно этой модели, определить факторы, вносящие искажения в спектры свечения, и получить спектральное распределение коэффициента аутофлуоресценции в(Лет) биосред можно по известным данным показателей поглощения /иа, рассеяния и фактора анизотропии g [8] и измеренному коэффициенту

диффузного отражения К^ (Лет) на длинах волн возбуждения и эмиссии Лет флуоресценции как

( 1 - 8(Кт ) ^

ßi^em )=Ma (л ex )qF (л em

( + Seff (Лет \

r,d +(( - rd )

(Лет )

Mt (Лех У

(()

Rd (Лет )

-(

+ (1

где м = иа + /л8 - коэффициент экстинкции; ц -форм-фактор спектрального контура; =

= (N -1), N(1 - g) и 2 ; гш - коэффициент внутреннего отражения биоткани, определяемый как гш и-1,44л"2 + 0,71л_1 + 0,668 + 0,0636п [9], п - относительный показатель преломления биоткани. При этом в(Лет) и р(Лет) связаны между собой соотношением в(Яет ) = И а (Лех МЛет ) .

В то же время выражение для спектральной зависимости квантового выхода флуоресценции р(Лет) может быть получено в рамках диффузионного приближения теории переноса излучения как [5, 9, 10].

р(Яет ) = Р (Лет Ж ^-iПЛ±FL

+ 4лО(ЛеХ)

ие// (Лех ) + Ме// (Лет )

где Р0

М((л ех ) + Veff (Лет )

(2)

- интенсивность

падающего

света;

Ие/ = - коэффициент эффектив-

ного ослабления в приближении ДТ [9], з(Ма + (1 - g)

A =

3(Ma + (( - S)MS ) + 2Meff

B, C - постоянные

интегрирования для уравнения диффузионного приближения [9].

Результаты и обсуждение

Характерные спектры флуоресценции Р(Лет) и диффузного отражения К^ (Лет), усредненные по сериям измерений, а также спектры коэффициента собственной флуоресценции в(Лет) и квантового выхода р(Лет) для здоровых участков биотканей и участков, пораженных каллезной формой язвенных дефектов, показаны на рис. 1 и 2.

Как видно из рисунков, спектральный контур флуоресценции здоровых объектов имеет максимум при ~475±10 нм и четыре плеча вблизи длин волн ~405±10, 515±10, 550±10 и 610±10 нм. По мере развития каллезных дефектов происходит снижение интенсивности флуоресценции до ~2,5-3 раз с незначительным сдвигом максимума в коротковолновую область спектра примерно на ~15 нм и возгорание полос при длинах волн ~405±10 и 610±10 нм. Статистический разброс значений для спектров флуоресценции биотканей не превышал ~10 %, за исключением дан-

ных, соответствующих длинам волн ~405±10 и 610±10 нм, где разброс Р(Лет) достигал ~25 %.

0,06

300

400

700

800

500 600

X, нм

Рис. 1. Спектры флуоресценции Р(Лет ), диффузного отражения К^ (Лет ), коэффициента собственной флуоресценции в(Лет ) и квантового выхода р(Лет ) для здоровых участков слизистой оболочки 12-перстной кишки: пунктирная линия -данные, рассчитанные по формуле (1), круги - данные, рассчитанные по (2) с учетом оптических показателей (иа, М, g ) ■ Спектры в(Лет ) и р(Лет) нормированы к максимуму спектра флуоресценции Р (Лет )

0,08

300

400

700

800

500 600

Я, нм

Рис. 2. Спектры флуоресценции Р(Лет ), диффузного отражения К^ (Лет ), коэффициента собственной флуоресценции в(Лет ) и квантового выхода ррЛет ) для биотканей пораженных каллезной формой язвенных дефектов: пунктирная линия - данные, рассчитанные по формуле (1), круги - данные,

рассчитанные по (2) с учетом оптических показателей (иа М, g) . Спектры в(Лет ) и р(Лет ) нормированы к максимуму спектра флуоресценции Р (Лет )

(

х

Результаты исследования стационарных спектров диффузного отражения показали наличие минимумов на длинах волн —350, 420, 545 и 577 нм, соответствующих фундаментальным полосам поглощения крови и интенсивного отражения в области терапевтического окна [10]. Характер изменения в спектрах Яd (Лет) указывает на увеличение геометрических размеров и плотности оптических неоднородностей в пораженных тканях, в результате чего происходит рост анизотропии рассеяния g и снижение коэффициента диффузного отражения для изъязвленных тканей. Типичные значения Яd (Лет) для здоровых и пораженных биообъектов лежат в пределах от —0,06±0,01 и —0,08±0,01 в УФ до —0,5±0,03 и —0,42±0,02 в красноволновой областях спектра. При этом разброс данных Яd (Лет) для исследуемых биообъектов составил в среднем —15 %.

Определение спектральной зависимости коэффициента собственной флуоресценции и квантового выхода для исследуемых объектов показало, что в отличие от измеренных спектров флуоресценции для в(Лет) и р(Лет) характерно наличие единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область на —15-20 нм относительно максимума спектров Р (Лт), и отсутствие спектральных компонентов на длинах волн поглощения крови, за исключением незначительного провисания контура вблизи —415 нм. Наличие данной компоненты, скорее всего, связано с остаточным перепоглощением фотонов флуоресценции эндогенными хромофорами биотканей - производными флавиновых и порфириновых групп [11, 12]. Кроме того, установлено, что в процессе развития поражения наблюдается монотонное убывание как в(Лет), так и р(Лет). Вблизи спектрального максимума значения в(Лет) и р(Лет) для нормальных биотканей составили —0,012±2е-3 и 0,004±5е-4 и для каллезной формы язвенных дефектов —0,0024±3е-4 и 0,0012±2е-4. Данный факт достоверно указывает на рост безизлучательной дезактивации вследствие процессов тушения и миграции энергии в биотканях по мере развития патологических процессов.

Амплитудный анализ данных Р (Лет), Яd (Лет), в(Лет) и р(Лет) показал, что наличие спектральных компонент в близи длин волн —405, 555 и 585 нм в спектрах флуоресценции скорее всего обусловлено реабсорбцией фотонов флуоресценции этих длин волн смесью окси- и дезоксигемоглобина [10]. Основной вклад в форму спектрального контура флуоресценции вносит свечение таких эндогенных флуорофоров, как молекулы МАЭ(РуИ (восстановленная форма никоти-намидадениндинуклеотида) с максимумом возбуждения/эмиссии (Лех1 Лет ) вблизи длин волн —340/465 нм, а также группы коллагена и эластина с максимумами Л^/Л при —325/400 и —325/405 нм [11, 12]. При этом развитие каллезных дефектов в биотканях приводит к возгоранию последней группы флуорофоров до —2 раз, что, по-видимому, связано с активным разрастанием фиброзной ткани, неизбежно сопровождающим про-

цессы длительного хронического поражения [13]. Кроме вышеупомянутых, потенциальными флуорофора-ми, ответственными за формирование спектров ау-тофлуоресценции исследуемых биотканей, также могут являться пиридоксин (витамин B6) и его производные с максимумом возбуждения/эмиссии при ~330/425 нм, витамины A ( lxlХет - ~325/510 нм) и K ( Xex¡Xem -~33 5/480 нм), липофусцин ( Xex¡Xem -~360/540 нм) и т.п.

Вместе с этим обнаружено, что спектральные компоненты флуоресценции при длинах волн ~515±10 и 610±10 нм, соответствующие свечению молекул производных флавиновых групп и эндогенных порфири-нов (максимум Xex¡Xem при ~450/530 и ~450/610 нм), по-видимому, является артефактом. Скорее всего первый из этих компонентов образован реабсорбцией «синих» фотонов флуоресценции молекулами рабоф-лавина (витамин B2), тогда как второй - дополнительным рассеянием «красных» фотонов флуоресценции волокнами соединительной ткани, формирующими структуру биообъектов, а также клеточными органел-лами (ядра, митохондрии, аппарат Гольджи и т.д.) и надмолекулярными комплексами [13].

Следует отметить, что данные предположения также подтверждаются оптическими исследованиями язвенной болезни биотканей и хорошо согласуются с результатами работы [3].

Таким образом, на основании исследований, приведенных в данной работе, можно сделать следующие выводы.

Спектры коэффициента аутофлуоресценции и квантового выхода характеризуется наличием единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область на ~ 20 нм относительно максимума спектров флуоресценции, и отсутствием спектральных компонентов на длинах волн поглощения крови.

Типичные значения в(Хгт ) и р(Хет ) вблизи максимума эмиссии для исследуемых биообъектов лежат в пределах ~10-3 и -10-4.

Основной вклад в спектральный контур флуоресценции вносят свечение молекул NAD(P)^H и группы коллагена и эластина. Спектральные компоненты, соответствующие свечению молекул флавиновых и пор-фириновых производных, несколько переоценены и являются результатом искажения спектров флуоресценции за счет реабсорбции хромофорами и рассеяния на структурных элементах ткани.

Данная работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы «Развитие научного потенциала высшей школы», проект РНП № 2.1.1.3966, 2006-2007 и гранта РФФИ № 06-02-96609-р_юг_а.

Литература

1. Pena A.-M., Strupler M., Boulesiteix T. // Opt. express. 2005.

Vol. 13. P. 6268-6274.

2. Lin W.C. et al. // Photochem. Photobiol. 2001. Vol. 73.

P. 396-402.

3. Соколов В.В. и др. // Квант. электрон. 2002. Т. 32. С. 963-

969.

4. Денисов В.К. Трансплантология. Киев, 1998.

5. Wu J, Field M.S., Rava R. // Appl. Optics. 1993. Vol. 32.

Р. 3585-3596.

6. Zhang Q.G. etal. // Opt. Lett. 2000. Vol. 25. P. 1451-1453.

7. Muller M.G. et al. // Appl. Opt. 2001. Vol. 40. P. 4633-4646.

8. Giraev K.M., Ashurbekov N.A., Kobsev O. V. // Int. J. Modern

Phys. B. 2006. Vol. 20. P. 25-36.

9. Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случай-

но-неоднородных средах: Пер. с англ. М., 1981. Т. 1.

Дагестанская государственная медицинская академия

10. Sung K. Chang et al. // J. Biomed. Opt. 2004. Vol. 9.

P. 511-522.

11. http://omlc.ogi.edu/spectra/index.html

12. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и

медицине: Пер. с англ. М., 1965.

13. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Меджидов Р.Т. // Опт. и

спектр. 2003. Т. 95. С. 874-879.

17 ноября 2006 г.