CC BY
9УДК 535.33/34.535.3
Исследование влияния патологических процессов на структурные и физилогические свойства ткани печени методом флуоресцентной микроскопии
К.М. Гираев (ДГУ), Н.А. Ашурбеков (ДГУ), Р.Т. Меджидов (ДГМА)
Введение
Как известно (см., например, [1 - 3]), флуоресцентный анализ благодаря своей высокой чувствительности, универсальности и простоте реализации, в сравнении, например, с абсорбционно-трансмиссионными методами, занял прочное место в арсенале физических методов, используемых в биологии и медицине при аналитических и диагностических исследованиях. Например, метод флуоресцентной микроскопии нашел широкое применение в гематологии - для диагностики различных заболеваний системы крови, в иммунологии - при диагностике многих вирусных инфекций, в цитодиагностике раковых опухолей, в определении концентрации свободного кальция (Ca2 ) в клетках in situ и пр. Эти методы основаны на изучении вторичной флуоресценции, обусловленной подкрашиванием исследуемых образцов флуоресцирующими красителями - зондами или метками (см., например, [4, 5]). В то же время наиболее простым и не менее информативным приемом флуоресцентной микроскопии является непосредственное наблюдение собственной флуоресценции (аутофлуоресценции) веществ, содержащихся в биотканях (эндогенные флуорофоры), когда видны флуоресцирующие структуры, интенсивность и цвет свечения которых определяются составом и количеством находящихся в них флуорофоров. В ряде случаев аутофлуоресценция дает возможность не только отчетливо видеть форму соответствующих микроструктур, но и судить по спектральному составу и интенсивности свечения о содержании биологически-активных веществ в биосредах, а также изучать связь между излучатель-ными параметрами и функциональным состоянием живых клеток и клеточных структур.
Данная работа посвящена изучению структурных и физиологических свойств биологических тканей по мере развития в них патологических процессов методом флуоресцентной микроскопии. С этой целью были исследованы образцы биоткани печени при поражении гидатидозным эхинококком различной степени тяжести с использованием фотографического варианта регистрации аутофлуоресценции с последующим «компьютерным анализом» полученных данных.
Материалы и методы
Для исследований по флуоресцентной микроскопии биологических тканей были отобраны 23 случая поражения печени гидатидозным эхинококком. При этом исследовались участки биотканей, прилежащие к очагу поражения, и из переходной области, находящейся на расстоянии ~5 - 7 см от видимого края зоны поражения. Гистохимический анализ образцов биотканей с этих участков показал, что в ~80 - 90 % случаев для данной патологии для прилежащей области были характерны процессы выраженного гепатосклероза (крайняя стадия поражения), а
для переходной зоны - нарушения, соответствующие хроническому гепатиту различной степени тяжести (средняя и высокая стадия поражения).
Исследуемый материал представлял собой биоптаты размером до ~10 мм3. Получение биоптатов производилось стандартными биопсийными щипцами во время плановых операций по поводу эхинококкоза печени. Полученный материал в течение ~10 - 15 минут ополаскивался в ~0,9 % физиологическом растворе для удаления крови и замораживался. Далее при помощи криостатного микротона с этих образцов получали гистологические срезы толщиной до ~100 мкм, которые помещались между двумя кварцевыми пластинами с добавлением капли физиологического раствора. Промежуток между краями пластин герметично заливался клеем для предотвращения высыхания ткани. В работе исследовались нативные гистологические срезы, поскольку раствор формалина, применяемый для фиксации, и парафин изменяют уровень кислотности биоткани, влияющий как на свечение флуорофоров, так и в целом на оптические свойства образца.
Микрофлуориметрические исследования биотканей проводились на базе отечественного серийного люминесцентного микроскопа «ЛЮМАМ-И1». Возбуждение флуоресценции осуществлялось при помощи излучения ртутной лампы ДРШ-150 на длине волны ~365±10 нм, которое подводилось к биотканям фронтально через объектив микроскопа. Свет флуоресценции собирался объективом микроскопа и, пройдя систему запирающих светофильтров с полосой пропускания ~400 - 700 нм, проецировался в фокальную плоскость визуального окуляра или фотоокуляра. Для данных исследований применялся объектив «10*0.40Л» с собственным увеличением *10 раз, числовой апертурой ~0.4, рабочим расстоянием менее ~2 мм и линейным полем в пространстве предметов до ~1 мм. Общее увеличение микроскопа (объектив*гомаль) составило до *100 раз. Фотометриро-вание осуществлялось при помощи встроенной зеркальной фотокамеры на цветную фотопленку марки Kodak-400 с оптимальной длительностью выдержки около 15 секунд. Градуировка чувствительности фотопленки к цвету производилась путем подбора длительности выдержки, при которой плотность цветовой гаммы фотоснимков больше соответствовала изображению объекта в свете флуоресценции. При этом мы учитывали как низкий уровень квантового выхода флуоресценции биотканей, так и способность их к быстрому фотообесцвечиванию. Печать фотоснимков осуществлялась в стандартном режиме.
Далее флуоресцентные микроснимки вводились в память персонального компьютера, где на базе программного пакета Mathcad выполнялось трехцветное ^С5-разложение (red, green, blue) фотоснимков и представление их в виде трехмерных кривых зависимости спектрального распределения интенсивности свечения вдоль пространства снимка. Мы полагали, что каждый из цветовых компонентов спектрального разложения обусловлен флуоресценцией различных групп эндогенных флуорофоров:
• синий (blue) компонент разложения образован свечением молекул кофер-мента NAD(P) H (восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида), для которого характерен максимум возбуждения/эмиссии (1ex / 1em ) вблизи длин волн ~340/465 нм [2,6 - 8];
• зеленый (green) компонент разложения соответствует свечению флавино-вых групп и их производных (окисленная форма флавопротеидов) со спектральным максимумом в области 1ex / 1em -370 - 450/530 нм [2,6 - 8];
• красный (red) компонент разложения может быть отнесен к свечению производных эндогенных порфиринов с максимумом возбуждения/эмиссии на длинах волн 1ex / Xem -400/610 нм [2,6 - 8].
Результаты и обсуждение
Влияние процессов поражения на структурные и спектральные свойства ткани печени демонстрируют рис. 1 - 3. На рис. 1 в свете собственной флуоресценции показан стык фиброзной капсулы эхинококковой кисты (верхний левый участок) и ткани печени (участок в центре) (увеличение ~10*). Под действием давления со стороны кисты эхинококка и как следствие развития дистрофии в ткани печени наблюдается хроническое воспаление (гепатит), выраженное атрофией стромы и разрастанием соединительной ткани. Ближе к капсуле количество соединительной ткани увеличивается, приобретая плотный грубоволокнистый характер в виде включений ярко-голубой флуоресценции. Отчетливо видны пятна красной флуо -ресценции, рис. 1 б соответствующие пигментным элементам крови. В целом, для ткани печени при средней стадии поражения характерны невысокие показатели интенсивности флуоресценции спектральных компонентов. При этом интенсивности «синей» и «зеленой» составляющих равны и примерно в 2 раза превышают свечения «красной» составляющей. Однако при переходе к фиброзной капсуле интенсивность компонентов увеличивается примерно до 2 раз, достигая максимума в области капсулы.
Более тяжелая форма хронического гепатита (высокая стадия поражения) показана на рис. 2 при ~25-кратном увеличении. На фоне флуоресценции печеночных клеток видна грубоволокнистая соединительная ткань вокруг желчных протоков (слева, в нижнем углу), флуоресцирующая голубым светом, а также в виде склеротических волокон, образующих ложные доли. Отчетливо видны базальные оболочки сосудов и янтарное свечение пигментных элементов желчи - билирубина. Интенсивности «синей» и «зеленой» составляющих примерно равны и в ~1.5 раза выше свечения «красного» компонента. Они достигают максимума в области желчных протоков и снижаются для стромы самой биоткани.
Дальнейшие изменения в структуре биоткани по мере развития поражения иллюстрирует рис. 3, где показан флуоресцентный микроснимок ткани печени при крайней стадии поражения (цирроз) при ~25-кратном увеличении. Здесь распространение фиброзной ткани носит диффузный характер, она более развита вокруг желчных протоков (на рис. 2 а, б) и выражена как участок ярко-голубой флуоресценции. На фоне зернистой основы паренхимы печени наблюдаются жировые кисты и обширные участки включений оранжевого света, характерные для желчного пигмента. Спектральный анализ данных показывает, что для крайней стадии поражения значения интенсивности свечения «синего» компонента несколько выше «зеленого» и до ~1.5 раз выше свечения «красной» составляющей микроснимка.
Рис. 1. Флуоресцентный микроснимок среза ткани печени и фиброзной капсулы эхинококка (на снимке слева) и его разложение на КОБ-составляющие: а - «синий» компонент, б - «зеленый» компонент, в - «красный» компонент, представленные в виде трехмерных кривых
Рис. 2. Флуоресцентный микроснимок ткани печени при хроническом гепатите и его разложение на ЯОБ-составляющие: а - «синий» компонент, б - «зеленый» компонент, в - «красный» компонент, представленные в виде трехмерных кривых
Рис. 3. Флуоресцентный микроснимок ткани печени при циррозе и его разложение на ЯвВ-составляющие: а - «синий» компонент, б - «зеленый» компонент, в - «красный» компонент, представленные в виде трехмерных кривых
С помощью цифрового ЯОБ-разложения данных микрофлуориметрии был определен ряд биохимических показателей, характеризующих физиологическое состояние биотканей. В качестве таких показателей были выбраны индексы оценки
степени энергетического обмена К1 и накопления порфиринов к2 в биотканях по мере развития патологических состояний. Согласно работам [2, 8 - 10] показатель к может быть определен как отношение интенсивности флуоресценции флави-новиновых производных - и КАВ(Р)И - Рто(Р)н , а следовательно, как
^ ^ су green ^ ci blue
отношение площадей «зеленой» Sij и «синеи» Sij ного разложения флуоресцентных микроснимков:
F,
ki =
flavins
гч green
_ Si,J
Fn,
S.
blue
составляющих спектраль-
(i)
NAD ( P )H ~i, j
где i, j - соответственно продольная и поперечная координата микроснимков.
По аналогии с методикой количественной оценки степени дыхательной активности [2, 8 - 10] показатель k2 может быть определен как отношение интенсивности флуоресценции производных порфириновых групп - Fporphirin и NAD(P)H -F :
1 NAD (P)H ■
F Sred
k _ porphirin _ i,j ...
2 т-г ci blue ' V /
FNAD (P )■ H Si, j
red
где St j - площадь «красного» компонента разложения.
Численные значения показателей k1 и k2 для исследуемых образцов биотканей печени приведены в таблице № 1. Как видно из таблицы, по мере развития процессов гепатосклероза наблюдается уменьшение значений k1, что означает снижение вклада флуоресценции флавиновых групп и увеличение вклада NAD(P)H, т. е. происходит изменение соотношения концентрации окисленной формы флавинов и восстановленной формы NAD(P)H в сторону преобладания вторых над первыми. Подобный эффект достоверно свидетельствует об угнетении клеточного дыхания и развитии процесса истощения терминального окисления, неизбежно сопровождающего воспалительные процессы [2, 6 - 8, 11]. В то же время развитие процессов поражения (от средней стадии до крайней) в тканях печени сопровождается возгоранием «красного» компонента, о чем свидетельствует
рост значений показателя k2. Это достоверно указывает на скопление промежуточных продуктов обмена и производных порфириновых групп.
Таблица № 1. Значения показателей клеточного дыхания k1 и накопления порфиринов k2 для биотканей печени при различных стадиях поражения
Стадии поражения биоткани ki k2
Средняя стадия ~0.9 ± 0.1 0.25 ± 0.1
Высокая стадия ~0.8 ± 0.15 ~0.4 ± 0.15
Крайняя стадия ~0.6 ± 0.2 ~0.5 ± 0.15
Полученные экспериментальные результаты полностью подтверждаются литературными данными. Как известно [6 - 8, 11 - 13], при всех формах гепатосклероза происходит нарушение обмена железа, развитие гемохроматоза, застой желчи вследствие закупорки желчных протоков и увеличения кислотности биотка-нии. Все это приводит к отрыву иона железа от молекулы гема порфирина, что для последнего сопровождается красноволновой флуоресценцией.
Заключение
Выполненные исследования тканей печени по флуоресцентной микроскопии позволили изучить динамику изменения формы микроструктур биоткани, а также исследовать их спектральные и физиологические свойства по мере развития процессов поражения. В частности, установлено:
• При длительных процессах гепатосклероза здоровая биоткань уплотняется и замещается фиброзной тканью с грубой густо-развитой волокнистой структурой в виде спирально скрученных пучков коллагеновых волокон, флуоресцирующих ярко-голубым светом. Активное разрастание фиброзной структуры приводит к деформации и сужению просвета сосудистого русла и желчных протоков, в ре-
зультате чего наблюдается ухудшение гемодинамики, застой желчи, развитие процессов гипоксии и дистрофии в биотканях.
• По мере развития процессов гепатосклероза происходит снижение интенсивности флуоресценции флавинов и усиление свечения NAD(P)H, т. е. происходит изменение соотношения концентрации окисленной формы флавиновых групп и восстановленной формы NAD(P)H в сторону преобладания вторых над первыми. Подобный эффект достоверно свидетельствует об угнетении клеточного дыхания и развитии процесса истощения терминального окисления.
• Развитие патологических процессов в биотканях. Наблюдается возгорание «красного» компонента и скопление эндогенных порфиринов, что указывает на дефицит железа, развитие гемохроматоза и увеличение кислотности биосреды.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы «Развитие научного потенциала высшей школы», проект РНП № 2.1.1.3966, 2006 - 2007 и гранта РФФИ, № 06-02-96609-р_юг_а.
Литература
1. Закржевский Е.Б. Люминесцентная микроскопия в клинико-гематологических исследованиях. - Л.: Наука, 1963. - 87 с.
2. Лисовский В.А., Щедрунов В.В., Барский И.Я. и др. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии. - Л.: Наука, 1984. - 236 с.
3. Qu J., MacAulay C., Lam S. et al. Laser-induced fluorescence spectroscopy at endoscopy: tissue optics, Monte-Carlo modeling and in vivo measurements // Optical Engineering. 1995. V. 34. - P. 3334 - 3345.
4. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. - М.: Наука, 1980. - 387 с.
5. Приезжев А.В., Тучин В.В., Шубочкин Л.П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. - М.: Наука, 1989. - 240 с.
6. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. - М.: Мир, 1965. - 468 с.
7. Ramanujam N. Fluorescence spectroscopy in vivo // Encyclopedia of Analytical Chemistry. - R.A. Meyers (Ed.) John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2000. - P. 20 - 56.
8. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Меджидов Р.Т. Стационарная спектроскопия биотканей in vivo: флуоресцентные исследования некоторых патологических состояний // Оптика и спектроскопия. 2003. Т. 95. № 5. - С. 874 - 879.
9. Карнаухов В.Н. Спектральный анализ в изучении внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергий // Цитология. 1976. T. 18. № 4. - С. 408 - 418.
10. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки. - М., 1978. -208 с.
11. Струков А.И. Общая патология человека. - М.: Медицина, 1982. - 655 с.
12. ЛенинджерА. Биохимия. - М.: Мир, 1976. - 958 с.
13. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма / Под ред. В. А. Яковлева. -М.: Мир, 1966. - 863 с.
