CC BY
12УДК 597.612.015.3:577.3
Д.Н. Магомедгаджиева, И.К. Газимагомедова, У.Г. Магомедова, А.Б. Шахназарова, К.М. Гираев
Биохимические и спектральные особенности гонад гибрида русского
и ленского осетров
Дагестанский государственный университет, ichthyolog@,mail.ru
Приведены результаты биохимических и спектральных особенностей гаметогенеза годовиков гибрида русского и ленского осетров. Выявлена сезонная динамика в содержании общего белка, общих липидов, фосфолипидов, МДА, активности каталазы в гонадах гибрида осетровых.
Ключевые слова: ихтиология, осетры, белки, липиды, метаболизм, физиология.
The result of biochemical and spectral special feature gamete genesis russian and lens hybrids of sturgeon yearling have been studied. The seasons dynamic of total protein, total lipids, phospholipids, malonical dialdehyde, catalase activity in the gonads of sturgeon hybrids are shown.
Keywords: etiology, sturgeon, proteins, lipids, metabolism, physiology.
На современном этапе единственно разумным путем сохранения и восстановления рыбных биоресурсов признана аквакультура.
Особенно приоритетны искусственное разведение и гибридизация осетровых, стратегическая цель которых: получение новых высокопродуктивных и быстро созревающих гибридов с хорошим темпом роста, повышенной жизнеспособностью и другими улучшенными народнохозяйственными признаками. Важным этапом является производственная проверка полученных гибридов в различных климатических и технологических условиях, установление сроков созревания, выявление оптимальных схем скрещиваний с учётом местных особенностей.
Поэтому вполне закономерен интерес к изучению биохимических и физико-химических показателей гонад и гаметогенеза рыб, характеризующегося интенсивным клеточным делением и формированием регуляторных систем.
В связи с этим целью работы явилось исследование сезонной динамики общего содержания белка, липидов, суммарной фракции фосфолипидов, показателей про- и антиоксидантной систем, а также спектральный анализ состояния гонад годовиков гибридной формы русского осетра (Acipenser guldenstaedtii) и ленского осетра (Acipenser baierii Brandt).
Материал и методика
Исследования проводили на годовиках гибрида русского и ленского осетров, выращенных на холодных водах Чиркейского водохранилища (температура воды в летний период не поднималась выше 17-18 оС). Выбор исходных видов для проведения промышленного скрещивания был основан на возможности сочетания в гибриде повышенной жизнеспособности русского осетра с высоким темпом роста и хорошими товарными качествами ленского осетра.
Отбор экспериментального материала производился осенью (ноябрь) и весной (апрель). Начальная индивидуальная масса рыбы на момент зарыбления (мальки) составляла 12 г, первоначальная плотность посадки - 1,5 кг/м2, площадь бассейна - 168 м . Кормили рыб круглогодично сухими гранулированными комбикормами компании «Техкорм» (протеин - 45 %, жир - 12 %).
Экстракцию липидов осуществляли методом Фолча [13], содержание общих липидов определяли гравиметрически [8], фосфолипидов - по количеству неорганического фосфора в пробе [6]. Об интенсивности перекисного окисления липидов судили по накоплению малонового диальдегида, который определяли тиобар-битуровым методом [2]. Каталазную активность измеряли по скорости разложения Н2О2 [5]. Общий белок определяли по Лоури [15]. Измерение 3D спектров флуоресценции проводилось на спектрофлуориметре ФТ-02-Панорама (Люмекс, Санкт-Петербург) в спектральном диапазоне возбуждения 1ex 250-310 нм и регистрации 1ex 310-800 нм. В качестве системы доставки возбуждения излучения и сбора спектров флуоресценции использовался контактный волоконно-оптический зонд коаксиальной симметрии световодных каналов возбуждения и регистрации фотосигналов.
Результаты и обсуждение
Тип гаметогенеза осетровых, как и других рыб, характеризуется интенсивным накоплением питательных веществ незадолго до весенне-летнего размножения (самки зимуют с нерестовыми продуктами) или в течение короткого времени незадолго до осеннего размножения (самки зимуют с яичниками в нерестовой стадии зрелости). Выметывание икры у самцов происходит всегда порционно. Половой цикл у осетровых длится в течение нескольких лет.
Возрастная модификация сезонных физиологических ритмов отражает изменения в соотношении отдельных форм обмена: у молоди наиболее продолжителен период белкового роста, сезонные колебания содержания белков незначительны; у половозрелых рыб сроки белкового роста сокращены, продолжительны периоды резорбции и восстановления веществ, потраченных на созревание гонад [11].
Липиды у рыб служат основным источником энергии и уровень их запасов, как индикатор физиологического состоянии рыб, можно использовать при определении подготовленности к преднерестовой миграции [12]. Обнаружены различия в биохимическом составе мышц и гонад у неполовозрелых и половозрелых особей кеты и нерки, в частности относительно низкое содержание жира в тканях и невысокие значения калорийности у рыб, не участвующих в нересте [3].
Как показали наши исследования, гонады отличаются наибольшим содержанием общих липидов и невысокой концентрацией фосфолипидов относительно других тканей (табл. 1). В сезонной динамике обнаружено сравнительно высокое содержание общих липидов в апреле и снижение их концентрации к ноябрю, вероятно вследствие повышения энергозатрат при снижении температуры среды. Динамика суммарного содержания фосфолипидов имела иной характер: наименьшая концентрация отмечалась - в апреле, наибольшая - в ноябре. Повышение содержания фосфолипидов способствует «текучести» мембран в условиях снижения температуры, что влияет на активность мембранносвязанных ферментов. Известно, что для личинок и молоди проходных рыб наиболее важны фосфо-липиды, а среди них - фосфатидилхолин и фосфатидилинозитол. Наличие этих соединений в корме обеспечивает эффективный рост и хорошее физиологическое состояние рыб [4; 14; 16].
Таблица 1. Биохимические показатели в гонадах годовиков гибрида русский +
ленский осетр
Показатели Апрель Ноябрь
Общие липиды (%) 72,33±7,66 53,89±3,21
Суммарные фосфолипиды (мг%) 189,34±7,69 407,59±12,41
МДА (мкМоль/г влажной ткани) 0,35±0,005 0,31±0,002
Каталаза (мкМольН2О2/г влажной ткани/мин.) 0,15±0,0025 0,12±0,0015
Общий белок (М±т, мг белка/г влажной ткани) 43,50±2,1 46,24±3,7
Клеточные липиды наиболее часто подвергаются повреждению. Эти повреждения связаны с активацией процессов свободно-радикального окисления (СРО). Как повышение, так и понижение скорости перекисного окисления липидов (ПОЛ), свидетельствует о физиологических нарушениях и негативно сказывается на морфофизиологическом состоянии организма. Исследование показателей про-и антиоксидантной систем в гонадах изучаемого гибрида выявило незначительное снижение параметров в ноябре по сравнению с апрелем (МДА - на 12 %, каталаз-ной активности - на 20 %), что коррелирует с низким уровнем содержания общих липидов.
Белки - это важнейшие компоненты клетки, выполняющие многообразные функции. Содержание белков в рыбе весьма сильно изменяется в зависимости от семейства, рода и вида, возраста, пола, времени улова, а также кормовой базы водоема и условий окружающей среды. Все же содержание протеинов и минеральных веществ, в тканях рыб сравнительно более устойчиво, чем содержание влаги и жира.
Как видно из таблицы 1, в содержании общего белка в гонадах годовиков исследуемого гибрида в апреле и ноябре достоверных изменений не отмечалось. Известно, что у рыб, в отличие от наземных животных, ассимиляционные процессы преобладают над диссимиляционными в течение всего онтогенеза [10]. В период полового созревания рыб метаболизм перестраивается на обеспечение созревания гамет и эффективность нерестового процесса. Меняется обмен тканевых белков: увеличивается содержание белка в гонадах и печени и уменьшается в мышцах и сыворотке. На генеративный обмен идут не только запасные, но и частично структурные белки [9]. На основании этого можно сделать вывод, что половозре-лость у годовиков гибрида русский х ленский осетр не наступила, а оогенез находится на стадии превителлогенеза - периода протоплазматического роста ооци-тов. Только при накоплении питательных веществ в половых клетках и наступает время первого нереста самок.
Наиболее простым и информативным приемом флуоресцентной микроскопии является непосредственное наблюдение собственной флуоресценции (аутофлуо-ресценция) веществ, содержащихся в тканях (эндогенные флуорохромы), когда видны флуоресцирующие структуры, интенсивность и цвет свечения которых определяются составом и количеством находящихся в них флуорохромов. В ряде случаев аутофлуоресценция дает возможность не только отчетливо видеть форму соответствующих микроструктур, но и судить по спектральному составу и интенсивности свечения о содержании биологически активных веществ в материале, а также изучить связь между излучательными параметрами и функциональным состоянием живых клеток и клеточных структур.
В данной работе получены и проанализированы спектры возбуждения флуоресценции гонад (рис. 1). Спектры наблюдались в диапазоне от 320-600 нм при длинах волн возбуждения 250-310 нм, в диапазоне 370-700 нм при длинах волн возбуждения 315-360 нм, в диапазоне 460-800 нм при длинах волн возбуждения 365-450 нм.
возбуждение, нм.
370 380 390 400 410 420 430 440 450
возбуждение, нм.
Рис. 1. Спектры флуоресценции гонад в диапазоне длин волн возбуждения 250-310 нм, 315-360 нм, 365-450 нм
В спектре флуоресценции гонад прослеживались полосы потенциальных флуороформ, таких, как производная пиридоксина - 5/ - фосфоперидоксаль, для которой характерен максимум возбуждения/эмиссии в области l = 330-385 нм, пиридоксиновые кислоты с максимумом в области l = 315-430 нм, восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида (NAD(P)-H) с максимумом возбуждения/эмиссии при l = 345-465 нм; рибофлавин и его производные - кофермент дегидрогеназ FAD выявлены с максимумом вблизи l = 370-450 нм и 520-530 нм. Не обнаружены спектры флуоресценции порфиринов, что связано с пониженным содержанием каталазы в гонадах.
Многие молекулы биологических веществ являются природными или естественными флуорофорами, т. е. веществами, способными флуоресцировать в определенном диапазоне длин волн при соответствующих условиях возбуждения.
Анализ спектров флуоресценции гонад показал присутствие в тканях гонад производных пиридоксина, NAD(P)-H, кофермента FAD.
Таким образом, наши результаты показывают, что содержание общих липидов и фосфолипидов в гонадах в 1,6; 1,3 и 4,2; 9,0 раз соответственно в апреле и ноябре превышает содержание общего белка. Это является подтверждением незрелости гонад у годовиков гибридной формы осетров, стадии трофоплазматического роста и созревания в гаметогенезе на данный момент не наступили. В результате депонирования большого количества жировой ткани в половых клетках осетров наблюдаются задержки в развитии генеративной части [1].
Проведенные исследования позволили выявить не только динамику обменных процессов в гонадах годовиков гибрида русский х ленский осетр, но и адаптивные возможности их организма в условиях искусственного выращивания.
Работа проведена при поддержке:
1) гранта РФФИ проект № 09-04-96566-р_юг_а 2009-2011;
2) ФЦП «Научные и научно-методические кадры инновационной России» на период 2009-2013 гг., проект NK-38P-17.
Литература
1. Акимова Н.В. Созревание и половые циклы у осетровых // Исследование размножения рыб. - М.: Наука, 1981. - С. 48-57.
2. Андреева Л.И., Кожемякин А.А., Кушкин А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с трибарбитуровой кислотой // Лаб. дело. 1988. № 11. - С. 41-43.
3. Горбатенко К. М., Кадникова И.А., Лаженцев А.Е., Павловский А.М., Юрьева М.И. Калорийность тихоокеанских лососей (Oncorhynchus spp.) Охотского моря и прилегающих вод СЗТО на разных этапах онтогенеза (ТИНРО-Центр, г. Владивосток) http://www.tinro-center.ru/publishment
4. Калкун К.Н., Комаров И.П. // Сб. науч. тр. Гос. ин-та озёрн. и речн. рыбн. хоз-ва. Вып. 20. - Л., 1987. - С. 114.
5. Королюк М.А., Иванова Л.Н., Майорова И.Г., Токарева В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 1. - С. 16-19.
6. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. - М.: Медицина, 1983. - 272 с.
7. ЛакинГ.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980. - 293 с.
8. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен): Учебное пособие / Под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. - 272 с.
9. Найденова И.Н. Изменение содержания белка в органах ставриды и скор-пены в процессе развития половых продуктов // Обмен веществ и биохимия рыб. - М.: Наука, 1967. - С. 314-316.
10. Строганов Н.С. Экологическая физиология рыб. Т. 1. - М.: Изд-во МГУ, 1962. - 443 с.
11. Шатуновский М.И. Экологические закономерности возрастной и сезонной динамики обмена веществ у рыб // Биологические основы рыбоводства. Актуальные проблемы экологической физиологии и биохимии рыб. - М.: Наука, 1984. -С. 28-44.
12. Шульман Г.Е. Физиолого-биохимические особенности годовых циклов рыб. - М.: Пищевая промышленность, 1972. - 366 с.
13. Folch J., Lees M, Sloane-Stanley G.H. // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226. -P. 497-509.
14. Hung S.S., Moore B.J., Bordner C.E., Conte F.S. // J. Nutr. 1987. V. 117, № 2. - P. 328.
15. Lowry D.H., Resebrough H.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folinphenol reagent // J. Biol. Chem. Vol. 193. - P. 265-275.
16. Kanazawa A. Nutrition and feeding in fish. - L.: Acad. press, 1985. - P. 280.
