CC BY
13
УДК 535.33/.34 535.3
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕРМОИНДУЦИРОВАННОИ КОАГУЛЯЦИИ НА СТРУКТУРНЫЕ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ БИОТКАНЕЙ МЕТОДОМ СВЕТООПТИЧЕСКОЙ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ
© 2011 г. К.М. Гираев1, Н.А. Ашурбеков1, М.Т. Расулов2, М.А. Шахназаров2, Б.Г. Магомедгаджиев2, Т.А. Ибрагимов1
'Дагестанский государственный университет, ул. Гаджиева, 43а, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000, dgu@dgu.ru
2Дагестанская государственная медицинская академия, пл. Ленина, 1, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367001, dgma@list.ru
1Dagestan State University, Gadjiev St., 43a, Makhachkala, Republic Dagestan, 367000, dgu@dgu.ru
2Dagestan State Medical Academy, Lenin Sq., 1, Makhachkala, Republic Dagestan, 367001, dgma@list.ru
Выполнены гистоморфологические и микрофлуоресцентные исследования тканей серого вещества головного мозга по мере их малигнизации и термической коагуляции. Показана структура соответствующих биотканей в инаткной группе и при различной степени термального воздействия. Проведен морфометрический анализ результатов и установлено, что по мере развития эффектов термокоагуляции происходят изменения как тканевой и клеточной структуры, так и спектрального состава флуоресценции обоих видов биотканей.
Ключевые слова: гистоморфология, флуоресцентная микроскопия, серое вещество головного мозга, менингио-ма, гипертермия, термокоагуляция.
The histomorphological and microfluorestsent researches of gray matter brain tissues during their malignant transformation and thermal coagulation have been made in this work. The structure of tissues in intact group and at different degrees of thermal effects is shown. Done morphometric analysis of results and found that during thermocoagulation effects as tissue's and cell's structure as spectral composition of fluorescence of both type tissues have been changed.
Keywords: histomorphology, fluorescence microscopy, gray matter of brain, meningioma, hyperthermia, thermocoagulation.
Главными факторами, определяющими успех ла-зерно-индуцированной термотерапии злокачественных новообразований, является точная дозиметрия и планирование процедур воздействия лазерного излучения на биологические ткани, подразумевающие правильное понимание физико-химических и морфо-функциональных процессов, вызванных эффектами гипертермии (например, [1-3]). Результат такого воздействия во многом зависит как от конкретного типа биоткани, так и от характера изменения температуры в процессе лазерного нагрева и включает в себя множество различных механизмов (от денатурации белковых соединений и дегидратации биоткани до разрушения мембран клеток), затрагивающих степень функционирования биообъекта и требующих углубленного изучения его структуры и строения [4, 5].
В зависимости от задач микроскопических исследований и свойств изучаемого биообъекта, как правило, используют один из методов светооптической микроскопии (метод светлого и темного поля, поляризационная и фазово-контрастная микроскопия и пр.), позволяющий анализировать параметры структуры и строения фиксированных тканей, клеток и клеточных ультраструктур [6, 7]. В то же время суще-
ственно повысить информативность гистоморфологи-ческих исследований можно путем комбинирования методов светооптической и флуоресцентной микроскопии, что позволит не только наблюдать динамику микроструктуры, но и определить содержание и пространственное распределение флуорофоров и биологически активных веществ в биотканях по мере воздействия патологических процессов и эффектов термокоагуляции.
Данная работа посвящена исследованию структурных и спектральных параметров биотканей в процессе развития новообразований и термоиндуци-рованной коагуляции. Цель работы заключалась в исследовании гистоморфологических и микрофлуоресцентных свойств нормальных и опухолевых тканей серого вещества головного мозга в интактном и коагулированном состоянии, используя анализ темнополь-ного и аутофлуоресцентного изображения микроструктур с последующим их RGB-разложением (Red, Green, Blue).
Материалы и методы
Для изучения влияния процессов термокоагуляции на структурно-морфологические и излучательные
свойства были отобраны 18 нормальных и 25 опухолевых (менингиома) образцов тканей серого вещества головного мозга. Интактные образцы биотканей были получены в ходе плановых операций по поводу удаления новообразований и представляли собой фрагменты биотканей размером около 1*1x1 см, взятые непосредственно из участков опухолевого очага, а также из прилежащей к нему области. Причем последние образцы биотканей имели незначительные морфологические изменения и диагностировались как близкие к норме.
Моделирование процедуры лазерно-индуциро-ванной термокоагуляции осуществлялось по стандартной методике [1, 3], заключающейся в медленном нагревании образцов каждого вида биоткани (норма и менигиома) в изотоническом физиологическом растворе в термостате (BD-53, Binder Labortechnik, Германия) при температуре 75-80 °С в течение 1 (средняя степень коагуляции) и 2 ч (высокая степень коагуляции). Полученные образцы последовательно резались при помощи криостатного микротома (CM-1510 S, Leica Microsystem, Германия) на нативные гистологические срезы. При этом толщина срезов выбиралась в зависимости от вида дальнейших исследований. Так, например, исследования по флуоресцентной микроскопии проводились на неокрашенных гистологических срезах толщиной 120±20 мкм, которые хранились при температуре около 0 °C до начала проведения эксперимента. В сравнении с этим для гистомор-фологического анализа использовались срезы толщиной примерно 10,0±5,0 мкм, окрашенные по методу Ван-Гизона с использованием гематоксилина Вейгер-та и пикрофуксина [8, 9]. Следует заметить, что в отличие от окраски гематоксилин-эозином метод Ван-Гизона является более предпочтительным, поскольку ядра клеток окрашиваются в темно-бурые тона, цитоплазма - желтовато-серые, а соединительная ткань - в ярко-красный цвет. По завершении окрашивания срезы покрывались покровным стеклом с добавлением капли бальзама.
Для изучения гистоморфологических свойств биотканей использовался комплекс аппаратно-программного определения фото- и морфометрических параметров биоматериалов «Мекос-Ц2» (ЗАО «Медицинские компьютерные системы», г. Москва), включающий в себя световой микроскоп (DME, Leica Microsystem, Германия), сопряженный с цифровой видеокамерой (HV-F31CL, Hitachi, Япония). Анализ микропрепаратов проводился в проходящем свете при освещении образцов снизу через конденсор микроскопа при общем увеличении в 400 раз. Программная база комплекса позволяла выполнять морфометрические и денситофотометрические измерения, работать с базой данных и проводить статистическую обработку результатов. В частности, при структурном анализе биотканей рассматривались следующие морфологические параметры: Snilc - площадь клеточных ядер; Scyt - площадь цитоплазмы клеток; кг = ScyJSnuc -
ядерно-цитоплазматический индекс.
Исследования по флуоресцентной микроскопии проводились на базе люминесцентного микроскопа (ЛЮМАМ-И1, ЛОМО, г. Санкт-Петербург) при возбу-
ждении свечения на длине волны 365±10 нм и регистрации 400-700 нм с увеличением до 250* раз. Фотографирование флуоресценции микропрепаратов осуществлялось при помощи зеркальной CCD-камеры (EOS 450D, Canon, Япония). Градуировка чувствительности фотокамеры проводилась путем подбора экспозиции, при которой плотность цветовой гаммы фотоснимков более полно соответствовала изображению объекта в свете флуоресценции. Далее на базе программного пакета Mathcad (MathSoft Inc., США) выполнялось RGB-разложение флуоресцентных микроснимков в предположении, что каждая из групп спектрального разложения соответствует свечению эндогенных флуорофоров. В частности, B-компонента соответствует свечению NAD(P)^H (восстановленная форма никотинамид аденин динуклеотида), G-компо-нента - свечению FAD и FMN (производных флавино-вых групп, окисленная форма флавопротеидов), R-ком-понента - свечению эндогенных порфиринов [10, 11]. Кроме того, возможность цифрового RGB-разложения данных микрофлуориметрии позволила определить ряд биохимических показателей, таких как к2 - степень энергетического обмена и къ - степень накопления порфиринов. При этом, согласно [12, 13], индекс к2 может быть определен путем отношения интенсивности флуоресценции флавинов - Fßavins и NAD(P)-H -
F , а, следовательно, как отношение площадей G- и B-составляющих (SgJen, Sb'"") спектрального раз-
ложения: К2 = F'flavins/F1
= Sfj^/Sj, где i, j -
тврун ~ Б1,]
соответственно продольная и поперечная координата микроснимков. По аналогии с этим индекс къ может быть определен отношением интенсивности свечения
как
порфиринов - F
porphirins
и NAD(PyH - F
NAD P)H
= Рро^/Ршарун = Б^/Б^ , где Б^ - площадь Я-компоненты спектрального разложения.
Результаты и обсуждение
Влияние процессов малигнизации и гипертермии на гистоморфологические и микрофлуоресцентные свойства тканей серого вещества головного мозга показано, соответственно, на рис. 1 - 3. Суммированные данные соответствующих исследований (индексы кх, кг и къ), а также их динамика показаны на рис. 4 и в таблице.
Анализ и обобщение результатов микроскопических исследований позволили отметить, что по мере развития процессов малигнизации и термокоагуляции в биотканях наблюдаются однотипные дегенеративные изменения, хотя существуют определенные морфологические и излучательные особенности, которые, по-видимому, связаны со своеобразием биохимических свойств и структурной организации объектов. Так, например, в интактном состоянии серое вещество головного мозга (рис. 1а) имеет нормальное гистологическое строение, в котором определяются строма головного мозга (нейропиль), а также многочисленные клетки нейроглии с характерной ультраструктурой.
Рис. 1. Гистоморфологическая картина нормальной и опухолевой ткани серого вещества головного мозга по мере воздействия термокоагуляции: a - нормальная ткань интактной группы; б - нормальная ткань при средней степени коагуляции; в - нормальная ткань мозга высокой степени коагуляции; г - опухоль мозга интактной группы; д - опухоль мозга при средней степени коагуляции; е - опухоль мозга при высокой степени коагуляции. Окраска микропрепарата пикрофуксином по методу Ван-Гизона. Увеличение 400*
В сравнении с этим для опухолевой ткани (рис. 1г) характерно наличие атипичных клеток полигональной формы, формирующих россыпи плотноупакованных концентрических структур, вокруг и внутри которых наблюдается реактивное разрастание соединительной ткани. Морфологические признаки клеток менингио-мы определяются в виде полиморфизма и некоторого укрупнения размеров ядер, а также в виде пикно-фильной и зернистой цитоплазмы с фигурами патологических митозов с уменьшением ядерно-цитоплаз-матического индекса кх до 2 раз (рис. 4, таблица).
При этом строма опухоли хорошо развита и представлена густоразвитыми пучками коллагеновых волокон и сосудами мелкого калибра.
При воздействии средней степени термокоагуляции (рис. 1 б-д) относительно интактных групп наблюдается уменьшение площади клеток, прежде всего, за счет сокращения размеров цитоплазмы 5 ,,
тогда как размеры ядер менялись незначительно. Как следствие, это приводит к увеличению плотности клеток на единицу площади и к снижению индекса кх до 1,6 раз для нормы и в 1,2 раза для опухолевых тканей. Дополнительно в тканях головного мозга определяются признаки плазмокоагуляции и убыль нейро-пиля, приобретающая вид разрежённой сетчатой структуры вследствие эффектов дегидратации и «выпаривания» интерстициальной жидкости. В то же время в тканях менингиомы наблюдается набухание и фибриллярное разволокнение соединительной ткани с очагами гомогенизации.
Дальнейшее влияние гипертермии (рис. 1 в-е) обнаруживает прогрессирование дегенеративных изменений в микроструктуре обоих видов биотканей, выраженное в виде значительного истончения стромы и уменьшении размеров клеток (до 5 раз для нормы и 3 раз для менингиомы), а также увеличения плотности их упаковки. При этом наблюдается еще большая деструкция цитоплазмы клеток, представленная эози-нофильными глыбчатыми массами, что, по-видимому, обусловлено разрушением связи между дезоксинук-леопротеидами и превращением их в «склеенные» между собой гомогенные образования [14]. Кроме того, воздействие высокой степени термокоагуляции сопровождается уменьшением размеров ядер в среднем до 3 раз относительно интактных групп, а их оболочка и нуклеоплазма не определяются и сливаются с другими ультраструктурными компонентами ядра по причине экструзии ядерной жидкости [14, 15].
При исследовании соответствующих биотканей методом флуоресцентной микроскопии обнаружено, что для нормальной ткани серого вещества головного мозга интактной группы характерен относительно низкий уровень флуоресценции (рис. 2.1 a) с преобладанием B-компонентов спектра, что по-видимому, вызвано свечением гистоструктуры среды. Наличие включений желто-оранжевой флуоресценции мелкой и крупной дисперсности (рис. 2.1 б,в), может быть отнесено к свечению фосфолипидных элементов клеток, для которых характерен максимум возбуждения/эмиссии ~(340-395)/(540, 560) нм [4, 10, 11, 15].
Значения количественных индексов для нормальных и опухолевых тканей серого вещества головного мозга интактной группы и при различной степени термокоагуляции
Состояние биоткани S , мкм2 nuc ' Scyt > мкм2 к\ к2 къ
Нормальная ткань головного мозга
Интактное состояние 68,2±8,0 273,5±13,0 4,2±0,6 0,65±0,1 0,17±0,04
Средняя степень коагуляции 52,5±7,0 142,2±9,0 2,7±0,4 0,9±0,15 0,29±0,07
Высокая степень коагуляции 30,6±5,0 67,0±8,0 2,1±0,3 0,97±0,15 0,4±0,1
Ткань опухоли головного мозга
Интактное состояние 88,9±10,0 208±11,0 2,4±0,4 0,41±0,07 0,32±0,08
Средняя степень коагуляции 76,4±8,0 149,8±11,0 2,0±0,3 0,79±0,1 0,5±0,1
Высокая степень коагуляции 37,9±6,0 69,4±7,0 1,8±0,2 0,95±0,15 0,64±0,15
Рис. 2. Флуоресцентное изображение микроструктуры нормальной ткани головного мозга. 2.1 - интактная группа; 2.2 - средняя степень коагуляции; 2.3 - высокая степень коагуляции. Нативный микропрепарат. Увеличение 250*. Разложение на ЯОБ-составляющие: а - В-компонента; б - О-компонента; в - Я-компонента
Рис. 3. Флуоресцентное изображение микроструктуры опухолевой ткани головного мозга. 3.1 - интактная группа; 3.2 - средняя степень коагуляции; 3.3 - высокая степень коагуляции. Нативный микропрепарат. Увеличение 250*. Разложение на ЯОВ-составляющие: а - В-компонента; б - О-компонента; в - Я-компонента
В сравнении с нормой микрофлуоресцентная картина интактных тканей менингиомы представлена сплошными протяженными участками ярко-голубой флуоресценции (рис. 3.1 а, б), которые по структуре и спектральному составу соответствуют фиброзным тканям, образованным спирально скрученными плот-ноупакованными пучками коллагеновых волокон. Кроме того, в поле зрения картины отчетливо просматриваются базальные оболочки кровяных сосудов различного калибра.
Анализ RGB-разложения флуоресцентных микроснимков нормальных и опухолевых биотканей ин-тактной группы показывает (рис. 4, таблица), что по мере развития процессов поражения наблюдается уменьшение значений индекса к2, что свидетельствует об изменении соотношений концентрации окисленной формы флавинов и восстановленной формы NAD(PyH в сторону преобладания вторых над первыми. Подобный эффект указывает на угнетение клеточного дыхания и развитие истощения терминального окисления, неизбежно сопровождающие процессы малигнизации [12-15]. В то же время развитие опухоли в тканях головного мозга сопровождается возгоранием R-компоненты (увеличение индекса къ ), что свидетельствует о скоплении в атипичных клетках промежуточных продуктов обмена - липофусцина и эндогенных порфиринов [4, 11, 15].
4-
к.
к
к
к.
к
к
3-
2-
1-
2-
1-
интактная гр.
Интактная гр.
ср. степень вс. степень
Средняя Высокая
Степень коагуляции
Рис. 4. Зависимость индексов количественной оценки для тканей серого вещества головного мозга (а) и менингиомы (б) интактной группы и при различной степени термокоагуляции
В свете собственной флуоресценции влияние гипертермии средней степени проявляется преимущественно в виде дезорганизации коллагеновых волокон как стромы ткани серого вещества головного мозга, так и фиброзных элементов ткани менингиомы. Вследствие эффектов дегидратации и денатурации структура и пространственное распределение флуо-рофоров тканей мозга уплотняется и приобретает гранулированный вид (рис. 2.2), в то время как гистост-руктура менингиомы более однородна и представлена единым пластом с кавернами незначительных размеров (рис. 3.2). В поле зрения микрофлуоресцентных картин и компонентов спектрального разложения (рис. 2.2 а-в, рис. 3.2 а-в) исследуемых биотканей отчетливо просматриваются группы гранул, флуоресценция которых представлена преимущественно B- и G-компонентами, хотя вклад R-компоненты также может быть различимым. В целом относительно ин-тактной группы для биотканей при средней степени термокоагуляции наблюдаются более высокие значения интенсивности свечения (рис. 4, таблица).
Дальнейшее развитие процессов термоиндуци-рованной коагуляции в нормальных и аномальных биотканях приводит к прогрессированию деструктивных изменений, затрагивающих не только строение биотканей, но и спектральный состав их свечения. Так, например, вследствие длительного термовоздействия в тканях головного мозга на фоне более выраженного уплотнения и грануляции гистоструктуры наблюдается участки истончения биоткани с образованием обширных многочисленных каверн (рис. 2.3). Подобный характер деструкции также справедлив и для тканей менингиомы, где в результате денатурации протеинов гистоструктура опухоли дополнительно приобретает несколько «рваный» характер (рис. 3.3). Спектрально биоткани данной стадии термообработки характеризуются еще большим уровнем свечения с преобладанием G- и R-компонентов (рис. 2.3 а-в, рис. 3.3 а-в), вследствие чего значения индексов к2 и к3 для коагулированных биотканей превышают до 2 раз аналогичные значения интаткной группы (рис. 4, таблица). Данный факт, по-видимому, вызван ростом концентрации эндогенных флуорофоров вследствие уплотнения и сжатия биотканей, а также коагуляци-онным некрозом, сопровождающимся накоплением промежуточных продуктов обмена [11-15].
В то же время следует отметить, что обнаруженные дегенеративные изменения, вызванные эффектами дегидратации и денатурации, менее всего выражены в тканях опухоли, что, по-видимому, обусловлено повышенной их резистентностью к внешним физическим воздействиям, и в частности к действию гипертермии [14, 15].
Выводы
Систематизация и обобщение результатов проведенных исследования позволили заключить, что для тканей серого вещества головного мозга по мере их малигнизации и термической коагуляции наблюдаются однотипные дегенеративные изменения, хотя существуют определенные гистоморфологические и микрофлуоресцентные особенности, которые можно
0
связать со своеобразием структурной организации биотканей:
- относительно нормы для ткани менингиомы характерно образование очагов плотноупакованных атипичных клеток многоядерной структуры с выраженным полиморфизмом ядер, в результате чего наблюдается уменьшение ядерно-цитоплазматического индекса до 2 раз;
- по мере развития процессов малигнизации строма здоровой биоткани замещается на плотную фиброзную ткань, представленную спирально скрученными пучками коллагеновых волокон, разделяющих опухолевые очаги, что подтверждается результатами микрофлуоресцентных исследований в виде протяженных участков ярко-голубого свечения;
- относительно интактных групп при средней степени коагуляции биотканей обоих видов наблюдается рост плотности упаковки клеток и снижение индекса кх до 1,5 раз, тогда как для высокой степени кх уменьшается до 2 раз для нормы и до 1,5 раза для ме-нингиомы;
- вследствие дегидратации клеток и денатурация протеинов обоих видов биоткани ее гистоструктура уплотняется и приобретает гранулированный вид, что приводит к увеличению концентрации флуорофоров и росту интенсивности, как Б- и в-, так Я-компонентов флуоресценции.
- относительно интактных групп развитие эффектов термокоагуляции приводит к 2-кратному росту спектральных индексов к2 и к3, что может быть обусловлено как процессом коагуляционного некроза, наиболее вероятным для крайней степени коагуляции, так и развитием гемохроматоза и увеличением кислотности среды, характерными преимущественно для опухолевых биотканей.
Поступила в редакцию_
Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 гг.», проект NK-38P-17.
Литература
1. Лазерная инженерия хрящей / под ред. В.Н. Багра-ташвили, Э.Н. Соболя, А.Б. Шехтера. М., 2006. 488 с.
2. Неворотин А.И. Введение в лазерную хирургию. СПб., 2000. 175 с.
3. Muller G., Rogan R. Laser-induced interstitial thermo-therapy. Bellingham, 1995.
4. Оптическая биомедицинская диагностика : в 2 т. / пер. с англ. под ред. В.В. Тучина. М., 2007. 560 с.
5. Приезжев А.В., Тучин В.В., Шубочкин Л.П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М., 1989. 240 с.
6. Rost F.W.D. Fluorescence microscopy. Cambridge, 1995. Vol. 1. 249 p.; Vol. 2. 451 p.
7. Закржевский Е.Б. Люминесцентная микроскопия в клинико-гематологических исследованиях. Л., 1963. 87 с.
8. Меркулов Г.А. Курс патологической техники. Л., 1969. 424 с.
9. Основы гистологии и гистологической техники / под ред. В.Г. Елисеева [и др.] М., 1974. 488 с.
10. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине : пер. с англ. М., 1965. 468 с.
11. Официальный сайт Орегонского центра лазерной медицины. 2007. URL: http://omlc.ogi.edu/spectra/Photochem CAD/html/index.html (дата обращения: 20.03.2011).
12. Карнаухов В.Н. Спектральные исследования энергетического аппарата живых нервных клеток // Биофизика. 1973. Т. 13. С. 185-188.
13. Карнаухов В.Н. Спектральный анализ и изучение внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергий // Цитология. 1976. Т. 18. С. 622 - 629.
14. Струков А.И. Общая патология человека. М., 1982. 655 с.
15. Ленинджер А. Биохимия. М., 1976. 958 с.
11 мая 2011 г.
