CC BY
8УДК 535.33/.34 535.3
К.М. Гираев, Н.А. Ашурбеков, А.А. Муртазаева, Г.М. Абдурахманов
Исследование динамики морфофункциональных ибиохимических параметров предопухолевых биотканей методами стационарной флуоресцентной и диффузно-отражательной спектроскопии
Дагестанский государственный университет, kamal_giraev@,mail.ru
В работе измерены спектры стационарной флуоресценции и диффузного отражения для тканей слизистой оболочки желудка invivo в норме и при полипозе. Определены следующие параметры биоткани: степень кровенаполнения и оксигенации, размеры и плотность рассеивателей, степень дыхательной активности, степень фиброзной активности, степень накопления порфиринов.
Ключевые слова:биоткани invivo; патология; спектры флуоресценции и диффузного отражения; показатели поглощения и рассеяния, спектры аутофлуоресценции; спектральное разложение; эндогенные флуорофоры; морфофункциональные и биохимические свойства.
Spectra of steady-state fluorescence and diffuse reflections for in vivo mucous stomach's tissues in norm and at poliposys have been measuredin this work. It have been determined: hemodynamic and oxygen saturation, size and density of scatterers, degree of respiratory activity; degree of fibrous activity; degree of porphirin accumulation.
Keywords:tissues in vivo; pathology; fluorescence and diffuse reflections spectra; absorption and scattering index; autofluorescence spectra; spectral expansion; endogenous fluorophores; morphofunctional and biochemistry properties.
Введение
В настоящее время лазерно-флуоресцентная спектроскопия нашла широкое применение в медицинской диагностике при обнаружении локализации различных патологических процессов (отклонений от нормы), включая процессы малигнизации в тканях кожи, нервной системы, органов грудной клетки и брюшной полости [1-3]. Однако анализ результатов этих исследований часто является неоднозначным, поскольку биологические ткани представляют собой поглощающие и рассеивающие среды с высокой степенью анизотропии физических свойств, обладают нерегулярной формой, негомогенны и часто многослойны [1,2]. Распространение света в биотканях носит сложный характер, что обусловлено их оптической неоднородностью (структурные тканевые и клеточные элементы, надмолекулярные комплексы и агрегаты), вызывающей сильное рассеяние излучения оптического диапазона. Кроме того, характерной особенностью спектральных свойств биотканей является их многокомпонентная структура, при которой высока вероятность реабсорбции фотонов флуоресценции вследствие наложения полос поглощения и свечения эндогенных хромофоров и флуорофоров. Указанные факторы приводят к значительному искажению интенсивности и к спектральному сдвигу полос свечения, что осложняет проведение количественного анализа измеренных спектров флуоресценции.
В таких случаях определить степень искажения и восстановить истинный спектр флуоресценции (аутофлуоресценции) можно посредством внесения поправок в измеренные спектры флуоресценции на физиологические и структурно-морфологические свойства исследуемых биотканей, которые, в свою очередь, могут быть выявлены, например, при анализе спектров коэффициента диффузного отражения [1,2]. Для проведения количественного анализа флуоресцирующих компонентов биоткани используют метод спектрального разложения аутофлуоресценции по Аленцеву-Фоку [4] или при помощи Гауссовых и Лоренцевых кривых [5].
Данная работа посвящена исследованию спектрально-флуоресцентных свойств биологических тканей с патологией с учетом эффектов реабсорбции и многократного рассеяния. С этой целью были измерены спектры лазерно-индуцированной флуоресценции и диффузного отражения для биотканей invivo в норме и в предраковом (дисплазия) состоянии. На основе полученных результатов определены спектры аутофлуоресценции, а также ключевые морфо-функциональные и биохимические параметры. Для проведения количественного анализа и вы-
явления зависимости вкладов эндогенных флуорофоров от степени патологии было выполнено разложение полученных спектров при помощью Гауссовых и Лоренцевых кривых.
Материалы и методы эксперимента
Изучение динамики стационарных характеристик спектрально-флуоресцентных свойств биотканей проводилось на тканях слизистой оболочки антрального отдела желудка1пу1уо (далее - биоткань) с предраковой патологией поражений (полипоз) во время плановых гастроскопических операций непосредственно перед их удалением. При этом исследованию подвергался как сам очаг патологического поражения, так и область, удаленная на расстояние 9-10 см от видимого края очага поражения. Гистохимический анализ образцов биотканей с этих участков показал, что в среднем в 80-90 % случаев полипоза для участков биоткани, максимально отстоящих от видимой границы патологического очага, наблюдались незначительные поверхностные дефекты и функциональные расстройства (норма). Таким образом, из общего числа проведенных исследований посредством гистохимических исследований был установлен 21 случай полипоза, тогда как контрольную группу составили 19 образцов с наименьшими морфологическими изменениями.
Измерение стационарных спектров флуоресценции F(X) и диффузного отражения Rd (l)
проводилось на лазерно-спектрометрическом комплексе стандартной схемы с использованием волоконно-оптической системы. Возбуждение спектров флуоресценции осуществлялось излучением азотного лазера на длине волны 337,1 нм, а спектров диффузного отражения - светом ксеноновой лампы. В качестве волоконно-оптической системы использовался Y-образный измерительный зонд, состоящий из двух «рукавов» (передающего и принимающего) и контактного катетера, в котором коаксиально размещались световодные каналы. Важной конструктивной особенностью измерительного зонда является одинаковая геометрия возбуждения и регистрации сигналов флуоресценции и диффузного отражения. Спектральный анализ фотосигналов осуществлялся при помощи автоматизированного спектрометра MS3504i на базе спектрографа (дифракционная решетка 200 штр./мм, обратная линейная дисперсия 14,5 нм/мм), сопряженного с ПЗС-матричной камерой HS-103H, сигнал с которой подавался на персональный компьютер через USB-порт. Для отсечения отраженного лазерного излучения при измерениях флуоресценции использовался запирающий светофильтр типа БС-8, а нормировка спектров диффузного отражения осуществлялась при помощи референсного отражателя на основе пластинки BaSÛ4.
Для каждого исследуемого участка биоткани определенного заболевания проводились по 35 серий измерений. Окончательный результат по каждому участку и по формам патологии определялся путем усреднения серийных измерений по среднеквадратичному отклонению. Таким образом, каждое из представленных в работе данных F (l ) и Rd (l ) есть усредненное значение
статистического материала, отобранного и систематизированного по стадиям патологического поражения.
В основу дальнейших исследований легло допущение, что оптические свойства биотканей invivo могут быть определены путем дополнения оптических свойств крови к оптическим свойствам биотканей invitro, а их суммарный вклад оценен по величине и спектральному составу коэффициента диффузного отражения Rd (l ) как [1,2]:
Rd (l) = k exp[- 4.5(1 + m:,lnvlVo (l) ¡ainvivo (1)У1/2 ], (1)
где ma invivo - показатель поглощения; ¡l's inViVO - транспортный показатель рассеяния; k - постоянная, зависящая от показателя преломления биоткани [1]; 1 - длина волны. При этом, согласно работам [1,13], оптические показатели поглощения и транспортного рассеяния могут быть аппроксимированы при помощи выражений (2)-(4):
ma,,nvvo (i)=(pmTd (1)+(100 - p)rna,mvitm (1 ))/100, (2)
mbOOd (i)=(amHbO2 (1 )+(100 - a)mHb fo/100), (3)
<mviVo(l) = a1-b, (4)
где ma mvitro - показатель поглощения биоткани invitro; ^^{А ) = 5 4 -10-4£Hb (А) и тО!Ь°2 (l) = 5 4-10-4 £HbO (А); £Hb (А) и £HbO2 (А) - спектры показателей молярной экстинкции, соответственно, гемоглобина и оксигемоглобина [14]; X - параметр, характеризующий степень кислородного насыщения крови на исследуемом участке биоткани; параметры a и b представляют собой безразмерные параметры, первый из которых является функцией концентрации рассеивающих центров и показателя преломления биоткани, и формирует общий уровень рассеяния, тогда как второй - волновой экспонент b - характеризует средний размер рас-сеивателей и определяет спектральное поведение показателя jl's (А).
Определение оптических показателей биотканей осуществлялось методом итераций и за" " ntheor /1 \
ключалась в моделировании теоретической кривой Rd [А) по отношению к экспериментальной Rd (А) путем подбора значений параметров p , X , a и b . В качестве начального приближения использовались оптические показатели, полученные в работе [15], а качество сходимости кривых определялось методом наименьших квадратов при допустимой погрешности не более 10-15%.
Далее, в целях восстановления истинных спектров флуоресценции Af (А) биотканей в работе использовалась модель, базирующаяся на предположении, что определение степени искажений h (А), вносимых эффектами светорассеяния и реабсорбции в спектры аутофлуоресценции Af (А), может быть выполнено при совместном анализе данных Rd (А) и F (А), измеренных в едином спектральном интервале возбуждения (Аех) и эмиссии (Ает) при одинаковой геометрии их возбуждения и регистрации как [6]:
Af (Ает )= F (Ает )/ Rd ^ J ^ ' , (5)
где h(Ает ) = f (Ает *)jlr (Ает ) - коэффициент, характеризующий степень искажения аутофлуоресценции, равный отношению средних длин пробега рассеянных фотонов lr (Ает) и фотонов флуоресценции f (Ает), формирующих, соответственно, спектры диффузного отражения и флуоресценции.
Процедура восстановления истинных спектров флуоресценции осуществлялась методом итераций и заключалась в моделировании формы спектрального контура Af (А) по отношению к спектру коэффициента собственной флуоресценции ß (А) путем варьирования параметра h (А) согласно выражению (5). При этом спектр ß (А) рассчитывался в рамках теории диффузионного приближения по известным значениям оптических показателей как [11,12]:
4лС2 (Аех ) + Fo (Аех ) , 4рСз (Аех )
ß (Аех , Ает ) = F ^т )i Q (Ает )
(6)
тг )+(Кт) т# (КХ)+(Кт)_
где ^(Ает) - спектр измеренной флуоресценции; F0 - интенсивность падающего света;
Цф =(3та) 12; = та + ; С2 и С3 - соответственно, общее и частное решения уравнения диффузионного приближения [7,11, 12].Качество сходимости спектральных кривых
А/(А) и Ь(А) определялось методом наименьших квадратов - 8 = (Ь(А)-Аф(А))1!ь(а), а
итерационная процедура завершалась при выполнении числа итераций, при котором погрешность этой сходимости не превышала 10-15%.
Экспериментальные результаты и их обсуждение
Спектры измеренной флуоресценции Г (Я) и коэффициента диффузного отражения (Я), усредненные по сериям измерений, а так же спектры аутофлуоресценции Л/ (Я), коэффициента собственной флуоресценции ¡5 (Я), показателей поглощения 1 а (Я) и приведенного рассеяния ¡1[(Я), характерные для нормальных и патологически измененных тканей слизистой оболочки антрального отдела желудка, показаны, соответственно, на рис. 1. Как видно из рисунка, нормальные биоткани при возбуждении излучением азотного лазера образуют спектральный контур флуоресценции с максимумом интенсивности вблизи длины волны 476±5 нм, тремя плечами в области 400±5, 550±5 и 605±10 нм (рис. 1(Ь)). В сравнении с этим, развитие процессов дисплазии (рис. 1(ё)) на фоне общего ослабления интенсивности флуоресценции до 4 раз сопровождается возгоранием отдельных спектральных полос на длинах волн 400±5 и 605±10 нм, а так же незначительным прогибом спектрального контура в области 415±5 и 580± 5 нм и сдвигом главного максимума в коротковолновую область примерно на 15±5 нм.
4-
0,4:
-F
........Af О f
(b)
г a
-1
mm
г a
-1
mm
0,1-:
0,0 0,83
300 400 500 600 700 800
l, nm
350 400 450 500 550 600 650 700
l, nm
Рис. 1. Усредненные спектры показателя поглощения ¡а (1), транспортного рассеяния ¡„ууо (2), диффузного отражения (Я) (3), флуоресценции Г (Я) (4), диффузного отражения, аутофлуоресценции Л/ (Я) (5) и коэффициента собственной флуоресценции ¡5 (Я) (6) для тканей слизистой оболочки антрального отдела желудка: (а), (Ь) - норма, (с), (ф - полипоз. (спектры Л/ (Я) и ¡5 (Я) нормированы к максимуму спектра флуоресценции Г (Я) )
Результаты исследования спектров диффузного отражения показали, что для всех исследуемых биообъектов отчетливо просматриваются спектральные полосы поглощения смеси окси- и дезоксигемоглобина на длинах волн 350, 420, 545 и 577 нм [14], вблизи которых спектр (Я) приобретает локальные экстремумы, а так же участок высокой интенсивности в области терапевтического окна. Типичные значения ^ (Я) для нормальных тканей желудка лежат в преде-
m
0,04
1
m
0,03
лах от 0,1±0,03 в УФ до 0,6±0,07 в красной области спектра (рис. 1(а)). При этом развитие патологии приводит к снижению коэффициента отражения до 2 раз с образованием более глубоких, чем в норме, минимумов на длинах волн поглощения крови (рис. 1(с)).
Использование методики (1)-(4) для анализа диффузно-оптических свойств биотканей позволило установить, что для спектров оптических показателей поглощения и транспортного рассеяния исследуемых биотканей характерны как общие закономерности, так и ярко-выраженные индивидуальные особенности. В частности, даже незначительное увеличение содержания крови в биотканях приводит к существенному росту показателя поглощения ¡1 а, преимущественно вблизи полос фундаментального поглощения окси- и дезоксигемоглобина [14]. В сравнении с этим спектральная зависимость показателя ¡¡[{1) представляет собой плавную кривую, снисходящую с ростом длины волны, и полностью определяется концентрацией и размерами оптических неоднородностей.
Характер зависимости оптических свойств биотканей при исследуемых формах патологии можно объяснить, исходя из данных структурно-морфологических и физиологических параметров, полученных при коррекции шуйго значений оптических показателей (таб. № 1) согласно методике (1)-(4). Так, в сравнении с нормой развитие полипоза приводит к повышению уровня кровенаполнения р до 15%, тогда как а снижается. Причины, приводящие к подобной зависимости параметров р и а для патологических биотканей, связаны, по-видимому, с особенностями их гистоморфологической организации. Рост злокачественной опухоли, как правило, сопровождается более активным и беспорядочным, чем для нормы, разрастанием микрокапилляров с неравномерной и некорригируемой взаимосвязью между приводящими и отводящими сосудистыми ветвями, что со временем приводит к нарушению циркуляции и к застою крови. В результате опухолевая биоткань становится одновременно более кровенапол-ненной, но с меньшей относительно нормы степенью оксигенации. Аппроксимация ¡¡[{1) функцией степенного вида (4) позволила установить, что для нормальных биотканей концентрация рассеивающих центров составляет а»3.3 х 105, а их усредненный размер Ь » 1,85, согласно фундаментальной зависимости [1,2], соответствует крупным рассеивателям, в качестве которых выступают, преимущественно, ядра и крупные клеточные органеллы с размерами, существенно превышающими длину волны рассеянного света. В то же время, по мере развития крайних форм патологии, наблюдается незначительное увеличение размеров рассеивающих центров и уменьшение их концентрации до 1,5 раз (таб. №1).
Таблица №1. Значения оптических показателей и параметров физиологических и структурно-морфологических свойств биотканей в норме и при различных патологических состояниях
1, нм т а, мм-1 , мм-1 £ ¡1'[, мм-1 Р , % а, % а Ь
Нормальная биоткань
300 1,78±0,3 31, 5±2 0,77 7,15±0,3 8,2±0,4 87, 5±2 3,29х105 1,85
400 2,1±0,3 29,5±2 0,79 5,82±0,3
500 0,34±0,1 27,1±2 0,87 3,27±0,3
600 0,14±0,02 24,9±2 0,9 2,5±0,3
700 0,05±7е-3 23,3±2 0,92 1,87±0,2
800 0,065±7е-3 22,1±2 0,92 1,77±0,2
Крайяняя стадия поражения (полипоз)
300 1,58±0,3 39,3±2 0,85 5,9±0,3 8,0±0,5 82±3 1,97х105 1,81
400 1,6±0,3 38,9±2 0,89 4,5±0,3
500 0,22±0,03 36,5±2 0,93 2,56±0,3
600 0,1±0,02 32,8±2 0,94 1,95±0,2
700 0,042±5е-3 29,3±2 0,95 1,45±0,1
800 0,045±5е-3 28,6±2 0,96 1,2±0,1
Определение истинных спектров переизлучения согласно методике (5)-(6) позволило установить, что влияние эффектов светорассеяния и поглощения приводит как к искажению формы спектрального контура, так и к перераспределению интенсивности аутофлуоресценции для биотканей при исследуемых формах патологии. Так, например, в отличие от измеренных спектров флуоресценции, спектры Л/(Я) характеризуются наличием единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область примерно на 15-20 нм относительно главного максимума спектров Г (Я), а также отсутствием спектральных компонентов вблизи полос поглощения элементов крови и на длинах волн 400±10 и 610±10 нм (рис. 1(Ь)-(ф).
Вместе с этим обнаружено, что развитие патологических процессов в тканях желудка приводит к расхождениям в интенсивностях Г (Я) и Л/ (Я) от 12,5±0,5 раз для нормы до 4,5±0,2 раз для полипоза. Кроме того, проведенные исследования показывают, что параметр искажения ау-тофлуоресценции Ц (Я) для исследуемых биотканей лежит в пределах 0,85±0,1 (для нормы -0,82±0,04, а для полипоза - 0,81±0,04), следовательно, средняя длина пробега фотонов флуоресценции может быть до 25% меньше длины пробега обратно рассеянных фотонов. В то же время, относительно нормальных биотканей развитие начальных стадий процессов малигнизации не приводит к существенным изменениям в глубине испускания флуоресценции / (Я).
Таблица №2. Данные усредненного параметра искажения аутофлуоресценции Ц , глубины испускания фотонов флуоресценции / (Яех) и коэффициента собственной флуоресценции ¡5 (Лпах) для тканей слизистой оболочки желудка при исследуемых формах патологии
Стадии поражения биоткани h lfl (lex ) , ММ ß (lmax ) , ММ_1
Норма 0,82±0,02 0,13± 0,02 1,52х10"3
Крайняя стадия 0,8±0,03 0,14 ± 0,02 5,44х10"4
Сопоставление полученных результатов с данными оптических исследований, проведенными в [10], позволяет связать подобную зависимость Af (Я) и h (Я) с влиянием физиологической и морфологической особенностей патологических биотканей. Очевидно, что высокий уровень поглощения и степени кровенаполнения, наблюдаемый для опухолевых тканей желудка, приводит к тому, что вероятность поглощения фотонов флуоресценции становится сравнима с их рассеянием. В результате показатель h (Я) и, как следствие, величина искажения спектра аутофлуоресценции этих биотканей принимают наименьшие значения из исследуемых форм патологии. Кроме того, следует заметить, что характер зависимости аутофлуоресценции от степени патологического процесса полностью подтверждается результатами определения коэффициента собственной флуоресценции. Как видно из данных таблицы №2 и рис. 1, типичное значение b (lmax) для исследуемых биотканей лежит в пределах 10-4, афор-
мы спектральных контуров Af (Я) и b (Я) совпадают с заданной погрешностью, за исключением длин волн 410±20 и 605±10 нм, где разброс значений Af (Я) и b (Я) составил в среднем 15-20%.
С целью получения количественной информации о динамике вкладов потенциальных флуорофоров в спектры свечения исследуемых биотканей в работе проводилось контурное разложение спектров F (Я) и Af (Я) с использованием Гауссовых и Лоренцевых кривых. Процедура спектрального разложения заключалась в моделировании теоретической кривой Fg¡ (Я) методом итераций по среднеквадратичному ее отклонению от спектров F (Я) и Af (Я) . При этом кривая моделирования определялась как
foL (Я) = ufo (Я)+ (1 - V)fL (Я), (7)
где /оь (Я) - параметр Гаусса и Лоренца, характеризующий относительный вклад в форму моделируемой кривой Гауссовой и Лоренцевой функции; V - параметр моделирования, равномерно распределенный на отрезке от 0 до 1. При V =0 модельный контур приобретает только Лоренцеву форму /, а при V=1 - форму Гауссовой составляющей . Качество сходимости кривых /оь (Я) и /(Я) ~ Р(Я), Л/(Я) определялось методом наименьших квадратов как
d (f (l)- fab(l))21 f (l) при Допустимой погрешности < 10%.
Результаты контурного разложения спектров свечения F (Я) и Af (Я) для тканей слизистой оболочки желудка при исследуемых формах патологии показаны, соответственно, на рис. 2. Как видно из рисунков, спектры F(Я) и Af (Я) сформированы как минимум 7 группами флуо-рофоров с изменяющимися вкладами для различных форм патологии (на рисунках показаны цифрами). В частности, потенциальными флуорофорами, ответственными за первую группу разложения, по-видимому, являются производные витамина B6 (пиридоксин), для которых характерен максимум возбуждения/эмиссии флуоресценции при длинах волн Лх/Яет ~325±10/390±5 нм. Вторая группа разложения, скорее всего, образована структурными
белками (коллаген и эластин) с XexjХет ~325/405±5 нм. К третьей группе могут быть отнесены молекулы пиридоксиновой кислоты, для которых максимум возбуждения/эмиссии лежит вблизи длин волн Яех/Яет ~315/430 нм [1-3,14,15]. Следующую спектральную группу, по всей видимости, образуют молекулы кофермента КАБ(РуН(восстановленная форма никатинамида аденин динуклеотида (фосфата)) с максимумом возбуждения/эмиссии в области длин волн KJKm ~(336, 351)/465±10 нм.
Пятая группа разложения, по-видимому, обусловлена эмиссией рибофлавина (B2) и его производных - коферментов дегидрогеназ FMN (флавин мононуклеотид) и FAD (флавин аденин динуклеотид), которые, в отличие от NAD(P)H, ярко флуоресцируют в окисленном состоянии с максимумом вблизи длин волн XexjХет ~(370, 450)/530±10 нм. Положение следующих двух групп близко к областям флуоресценции промежуточных продуктов обмена: шестой - к липофусцину с Хех1 Хет ~340 - 395/550±10 нм, а седьмой - к группе производных эндогенных пор-фиринов, с Хех1 Хет ~(400 - 450)/(630, 690) нм [1-3,14,16,17].
Анализ результатов спектрального разложения F (Я) и Af (Я) показывает, что по мере развития патологических процессов наиболее явные изменения наблюдаются в соотношениях и вкладах 2, 4, 5 и 7 компонентов разложения, из которых наибольшего внимания заслуживают 4 и 5 группы. Основываясь на методе количественной оценки степени дыхательной активности митохондрий [18-20], в работе рассматривалось отношение площадей под кривыми 5 (S^25) и
4 (S4460 ) групп для каждой из исследуемых форм патологии как отношение интенсивности флуоресценции флавинов - F.flcvins и NAD(P)H - FNAD(P)H , тем самым оценивалась степень их энергетического обмена - k1 = S5525/ S460 = FiavimjFNAD (P)H . По аналогии с kj в работе были
введены индексы k2 и k3, характеризующие, соответственно, степень фиброзной активности и накопления порфиринов, которые могут быть определены нормировкой интенсивности свечения коллагеновой Fcollagen и порфириновой Fporphirins групп к интенсивности свечения NAD(P)H
как отношение площадей под кривыми 2 (S400) и 7 (Sj^) к 4 (S460) группе -
k2 = S40q/S460 = Fcollagen IFNAD(P)■ H и k3 = S610 /S460 = Fporphirins / FNAD(P)H .
1, пш 1, пт
Рис. 2. Контурный анализ стационарных спектров флуоресценции Е(Я) и аутофлуоресценции Л/(Я) ткани слизистой оболочки антрального отдела желудка при помощи Гауссовых и Лоренцевых кривых: (а), (Ь) - норма, (с), (ф - полипоз (цифрами показаны группы спектральных компонентов разложения)
Динамика индексов Кх, К2 и к3, определенных из результатов разложения спектров Е (Я) и Л/ (Я) для тканей желудка при различных формах патологии, приведена в таблице №3. Как видно из таблицы, развитие средней и высокой стадий поражения сопровождается общим как для Е(Я), так и для Л/(Я), снижением индекса Щ, т.е. наблюдаются уменьшение вклада флуоресценции флавинов и увеличение КАБ(Р)Н, что свидетельствует об угнетении клеточного дыхания и развитии эффекта истощения терминального окисления [1721]. В то же время для крайней стадии поражения соотношение коферментов носит обратный характер, достигая значений, близких к предыдущим формам патологии. В сравнении с этим значения индексов к2 и к3 принимают наибольшие значения для предопухолевых дефектов, где могут до 3 раз превышать аналогичные данные для нормы. Факт повышения уровня к2 для злокачественных поражений достоверно указывает на увеличение концентрации коллагена в биотканях, обусловленное активным разрастанием соединительной ткани вследствие нарушения метаболизма коллагенпродуцирующих единиц и активации фибриногена [21], тогда как рост индекса к3 при крайних формах патологии свидетельствует
об увеличение концентрации промежуточных продуктов обмена и производных порфири-новых групп. Причем, согласно [1-3,16,17], интенсификация флуоресценции порфириновой компоненты может быть также связана с кислотным рй-сдвигом, характерным для малигни-зированных биотканей, при котором происходит отрыв иона железа от молекулы гемапор-фирина.
Таблица №3. Индексы энергетического обмена К и к[, фиброзной активности К2 и к'2 и накопления порфиринов К3 и К"3 для тканей слизистой оболочки антрального отдела желудка при исследуемых формах патологии. Индексы, помеченные значком * соответствуют результатам разложения спектров аутофлуоресценции Л/ (Я)
Стадии поражения биоткани К1 > К1 К2 К3, К3
Норма 0,6±0,1 0,38±0,06* 0,07±0,01 0,15±0,03* 0,13± 0,03 0,06± 0,01*
Крайняя стадия 0,51±0,08 0,34±0,06* 0,08±0,01 0,26±0,05* 0,2±0,05 0,12± 0,03*
Отдельный интерес представляет сравнительный анализ индексов К, К2 и К3, полученных при разложении спектров флуоресценции Р(Я) и аутофлуоресценции Л/ (Я) исследуемых биотканей. Как видно из рис. 2 и данных таблицы №3, искажение формы спектрального контура аутофлуоресценции, вносимое эффектами светорассеяния и оптического поглощения, как следствие, приводит к изменениям в соотношениях и вкладах эндогенных флуорофоров. В частности, наложение спектра аутофлуоресценции биоткани и спектральных полос поглощения окси- и дезоксигемоглобина, а так же производных флавиновых и порфириновых групп в области длин волн 410±10 нм (полоса Сорэ), приводит к значительному ослаблению интенсивности свечения коллагеновых групп, пиридоксиновой кислоты и КАБ(Р)Н. По-видимому, энергия возбужденного состояния этих флуорофоров (группы спектрального разложения 2, 3 и 4) перепоглощается элементами крови и мигрирует к эндогенным флуорохромам. В результате, например, расхождение в значениях индекса К2 и К2 по мере развития патологических процессов (от нормы до крайней стадии поражения) увеличивается и для полипоза желудка может достигать 3 раз (таб. №3). В то же время, различия в значениях индексов К1 и к{ , а так же К3 и
К"3 указывает на то, что уровень свечения флавиновых групп в спектрах Р (Я) завышен в среднем в 1.5 раза, а порфириновых групп - от 2.2 раз для нормы до 1.5 раза для малигнизирован-ных биотканей. Вероятной причиной такого искажения является эффект объемного светорассеяния, при котором фотоны флуоресценции производных флавинов и порфиринов по мере выхода на поверхность биоткани испытывают множественное взаимодействие с оптическими не-однородностями среды (рассеиваются на тканевых и клеточных элементах структуры) и элементами крови (эритроциты), что приводит к неадекватному росту и завышенной оценке интенсивности свечения этих флуорофоров в результирующем спектре Р (Я). Однако, несмотря на существенное различие во вкладах флуорофоров в результирующие спектры Р (Я) и Л/ (Я), следует заметить, что общая динамика индексов энергетического обмена К1 и , фиброзной активности К2 и К2 и накопления порфиринов К3 и К"3 в зависимости от формы патологического поражения слизистой оболочки желудка остается схожей.
Заключение
Таким образом, проведенные исследования и полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
1. Стационарная флуоресценция биотканей при возбуждении азотным лазером образует спектральный контур с максимумом вблизи 475±10 нм и тремя плечами в области длин волн 400±5, 550±5 и 605±10 нм. По мере развития процессов малигнизации наблюдается снижение интенсивности Р(Я) в 3-4 раза. При этом спектр коэффициента отражения характеризуется наличием локальных минимумов вблизи спектральных полос поглощения окси- и дезоксиге-моглобина, а развитие патологии приводит к снижению (Я) до 3 раз во всем исследуемом спектральном интервале.
2. Спектры оптических показателей биотканей при исследуемых формах патологии во многом определяются их физиологическим и структурно-морфологическим состоянием, что находит подтверждение в спектрах коэффициента отражения соответствующих биотканей. В частности:
- относительно нормы развитие крайних форм поражения приводит к повышению уровня кровенаполнения p до 15%, тогда как a незначительно снижается;
- для нормальных биотканей плотность рассеивающих центров составляет 3,3 ><105, а их усредненный размерблизок к рассеивателям Ми. При этом развитие крайних форм патологии приводит к незначительному увеличению размеров рассеивающих частиц и уменьшению их концентрации до 1,5 раз.
3. Влияние эффектов светорассеяния и оптического поглощения приводит как к искажению формы, так и к перераспределению интенсивности аутофлуоресценции. В частности:
- спектры Af (Я ) и Ь (l ) характеризуются наличием единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область на 20 нм относительно максимума спектров F (Я ), и отсутствием спектральных компонентов вблизи полос поглощения крови и на длинах волн 400±10 и 605±10 нм. При этом типичные значения b (lmax ) для исследуемых биотканей лежат вблизи 103 для нормы и снижаются до 10-4 для различных форм патологии;
- развитие процессов дисплазии приводит к снижению степени искажения аутофлуорес-ценции и глубины ее испускания до 1,5 раз. В результате интенсивность F (Я ) до 13 раз превышает Af (Я), а в предраковых стадиях - интенсивность Af (Я) в 1,7±0,3 раз ниже контрольных данных.
4. Спектры F (Я ) и Af (Я ) определяются излучением 7 групп флуорофоров, из которых основной вклад вносят группы NAD(P)H, структурных белков, а так же флавиновые и порфи-риновые производные. По мере развития патологии происходит снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада NAD(P)H, а также 3-кратное возгорание коллагеновых и порфириновых групп.
5. Вследствие наложения полос поглощения крови и эндогенных хромофоров, а так же высокого уровня объемного светорассеяния вклады спектральных компонентов, соответствующих флуоресценции коллагена и эластина, могут быть ослаблены до 3 раз, а роль флавино-вых и порфириновых групп завышена, соответственно, до 1,5 и 2 раз. В то же время общая динамика в соотношениях этих флуорофоров в зависимости от формы патологического поражения как для F (Я ), так и для Af (Я ), остается неизменной.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072013 годы», ГК№16.552.11.7051
Литература
1. Оптическая биомедицинская диагностика / Под ред. В.В. Тучина. -М.: Физматлит, 2007. 1, 560 с., 2, 368 с.
2. Ramanujam ^.Fluorescence Spectroscopy In Vivo /Encyclopedia of Analytical Chemistry. Chichester: R.A. Meyers (Ed.) John Wiley & Sons Ltd, 2000. - С. 20-56.
3. Konig K., Schneckenburger H. Laser-induced autofluorescence for medical diagnosis// J. Fluo-resc. 1994. V. 4. -P. 17-40.
4. Фок М.В. РазделениесложныхспектровнаиндивидуальныеполосыприпомощиметодаАленцева// Тр. ФИАНСССР. 1972.Т. 59. -С. 3-24.
5. Saito Y, Kanoh M., Hatake K.-I. et al// Appl. Opt. 1998. V. 37. - P.431-437.
6. D.C.G. de Veld, Skurichina M.et al. Autofluorescence and diffuse reflectance spectroscopy for oral oncology// Lasers Surg. Med. 2005. V. 36. - P. 356-364.
7.Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах. - М.: Мир, 1981. Т. 1. - 280 с.
8. Bevilacqua F., Piguet D., Marquet P^t al. In vivo local determination of tissue optical properties: applications to human brain// Appl. Opt. 1999. V. 38. - P. 4939-4950.
9. Van Staveren W.H.J., Moes C.J.M., Van Marle J.et al. Light scattering in intralipid-10% in the wavelength range of 400-1100 nm// Appl. Opt. 1991. V. 30. - P. 4507-4514.
10. SolonenkoКM., Cheung R., Busch T.M. et al.In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates// Phys. Med. Biol. 2002. V. 47. - P. 857-873.
11. Wu J., FeldM.S., Rava R.P. Analytical model for extracting intrinsic fluorescence from a turbid media// Appl. Opt. 1993. V. 32. - P. 3585-3595.
12.Chang S.K., Arifler D., Drezek R.et al. Analytical model to describe fluorescence spectra of normal and preneoplastic epithelial tissue: comparison with Monte Carlo simulations and clinical measurements// J. Biomed. Opt. 2004. V. 9. - P. 511-522.
13. Qu J., MacAulay C., Lam S.et al. Laser induced fluorescence spectroscopy at endoscopy: tissue optics, Monte Carlo modeling, and in vivo measurements// Opt. Eng. 1995. V. 34. - P. 3334-3343.
14. Prahl S.A. 2007:http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/index.html
15. Гираев К.М., Ашурбеков Н.А., Лахина М.А. Спектры поглощения и рассеяния света тканями желудка при патологии // ЖПС. 2011. Т. 78. - С. 109-118
15. Юденфренд С.Флуоресцентный анализ в биологии и медицине: Пер. с анг. - М.: Мир, 1965. - 468 с.
16. Ленинджер А. Биохимия. - М.: МИР,1976. - 958 с.
17. КарнауховВ.Н. Спектральные исследования энергетического аппарата живых нервных клеток// Биофизика. 1973. Т. 13. - С. 185-188.
18. Карнаухов В. Н. Спектральный анализ и изучение внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергий//Цитология. 1976. Т. 18. -С. 622-629.
19. Chance B., Schoener B., Oshino R. etal. Oxidation-ReductionRatioStudiesofMitochondriainFreeze-trappedSamples// J. Biol. Chem. 1979.V. 254. -P. 4764-4771.
20. Общаяпатологиячеловека /Подред.А.И. Струкова, В.В. Серова, Д.С. Саркисова. -М.: Медицина, 1982 656 с.
Поступила в редакцию 25 ноября 2011 г.
