CC BY
12УДК 535.33/.34 535.3
Спектрально-флуоресцентные исследования биотканей с эрозивными поражениями
К.М. Гираев, Н.А. Ашурбеков, Р.Г. Турциев
Введение
Как известно [1 - 3], биологические ткани относятся к случайно-неоднородным поглощающим и рассеивающим конденсированным средам. Взаимодействие лазерного излучения с такими веществами сопровождается большим числом разнообразных явлений, к которым, в первую очередь, относятся эффекты поглощения и многократного рассеяние света, а также отражение и флуоресценция.
Важную информацию о функциях и механизмах взаимодействия биологических молекул, составляющих различные биосреды, предоставляют лазерные методы флуоресцентной спектроскопии. В последнее время стационарная флуоресцентная спектроскопия нашла широкое применение в медицинской диагностике патологических процессов (отклонений от нормы), включая процессы малигниза-ции в тканях кожи, в нервной системе, органах грудной клетки, брюшной полости (см., например, [2 - 4]). Анализ результатов таких исследований часто неоднозначен. Как правило, наблюдаемые спектры испытывают значительные искажения вследствие объемного рассеяния фотонов флуоресценции на оптических неодно-родностях биотканей (структурные элементы биоткани, клеточные элементы и надмолекулярные агрегаты) и их реабсорбции кровью, пигментами и эндогенными хромофорами. Кроме того, характерной спектральной особенностью биосред является многокомпонентная сильно перекрывающаяся структура, при которой достаточно велика вероятность наложения полос поглощения и флуоресценции эндогенных флуорохромофоров. Все это существенно затрудняет проведение количественного анализа спектров флуоресценции, поскольку спектральные полосы свечения приобретают «переходной характер» и по ним нельзя достоверно определить, являются ли максимумы флюоресценции истинным.
Настоящая работа посвящена изучению влияния эффектов реабсорбции и многократного рассеяния на излучательные свойства биологических тканей. С этой целью проводились исследования спектральной зависимости стационарной флуоресценции и диффузного отражения объектов in vivo по мере развития в них патологического процесса (отклонения от нормы). На основе полученных данных определены факторы, вносящие искажения в спектры свечения, а также спектры аутофлуоресценции, выполнено разложение полученных результатов методом Гауссовых - Лоренцевых кривых и определены значения квантового выхода флуоресценции соответствующих патологий биообъектов.
Материалы и методы
Изучение флуоресцентных свойств патологических состояний биотканей проводилось на 35 образцах слизистой 12-перстной кишки с каллезной формой язвенных дефектов во время плановых операций, непосредственно перед удалением органа или сразу же после удаления в течение первых 5 - 10 минут. При этом исследовались край язвенного дефекта и участок биоткани, удаленный на ~10 см от
видимой границы патологического очага. В результате гистохимического анализа биотканей было установлено, что в ~90 % случаев таких патологий для участков, удаленных на ~10 см от видимого края поражения, характерны функциональные расстройства или легкие поверхностные дефекты с незначительными морфологическими изменениями. Такие биоткани считались здоровыми и были выбраны в качестве контрольной группы.
Все удаленные объекты сразу же после их резекции помещались в контейнер с гомологической плазмой для предотвращения наступления тканевого окоченения и находились там до начала эксперимента при температуре ~0 °С. Данная методика активно используется в трансплантологии при пересадке органов и позволяет сохранять их как живые объекты [4].
Измерение спектров F(Лет ) и (Лет ) проводилось с разверткой по длинам
волн в диапазоне 300 - 800 нм с применением пары волоконных световодов (диаметр ~200 мкм, числовая апертура ~0.12), один из которых использовался как передающий, а другой - как принимающий. Во избежание бликов зеркального отражения передающий световод был ориентирован вертикально к поверхности объекта, а принимающий - под углом ~25° В качестве спектрального прибора использовался монохроматор МДПС-2 с дифракционной решеткой 600 штр./мм и линейной дисперсией ~2.8 нм/мм в первом порядке решетки. Возбуждение спектров флуоресценции осуществлялось при помощи излучения азотного лазера ЛГИ-505 на длине волны ~337.1 нм, а спектров диффузного отражения - ксеноно-вой лампой ДКсШ-150, совмещенной с электромеханическим модулятором. Сигнал детектировался при помощи ФЭУ. Он проходил каскад селективного усилителя и подавался на вход АЦП, согласованного с компьютером.
Для каждого исследуемого участка было проведено по 10 серий измерений. Разница в результатах каждой серии не превышала ~10 - 15 %. Окончательный результат по каждому исследуемому участку и случаю заболевания определялся путем усреднения серийных измерений.
Проведение спектральных измерений F(Лет) и (Лет) при одинаковой
геометрии возбуждения и регистрации фотосигналов позволило воспользоваться аналитической моделью, предложенной в [5] и развитой в [6], для определения факторов, вносящих искажения в спектры свечения, и получить спектров аутоф-луоресценции АГ(Лет ) биосред:
АГ (Лет ) = Г (Лет К (Лет У ^ ) , (1)
где к (Лет ) = 8 А (Лет V8 г (Лет ) - коэффициент пропорциональности; 8 р (Лет ) -
средняя глубина проникновения для фотонов флуоресценции; 8Г (Лет ) - средняя глубина проникновения для фотонов диффузного отражения; Лет - длина волны
испускания флуоресценции.
В то же время согласно [7 - 9] спектральную зависимость квантового выхода
флуоресценции р(Лет ) можно определить по известным данным показателей поглощения та, рассеяния и фактора анизотропии g [10] и измеренному спектру флуоресценции Г (Лет )
на длинах волн возбуждения Лех и эмиссии Лет
флуоресценции как:
Р (1ет ) = Р (Яет )
М(Я )А(Л ) АкВ(К)+Ро + 4рС(Лех) П'"1/2 Я " ' тХКх)+ тДЛт) теАХеХ) + ¡е^^т)_
(2)
где Р0 - интенсивность падающего света; ¡¡е^ = V(¡а + (1- 8) - коэффициент эффективного ослабления в приближении ДТ [9],
А = 3(1а + (1 - 8) 1 s ) В с
А — —}----—\—г-; В , С - постоянные интегрирования для уравне-
3(1а + (1 - 8) 1)+ 21/
ния диффузионного приближения [8, 9].
Разделение спектров АР(1ет ) на вклады флуорофоров осуществлялось итерационным методом моделирования Гауссовых - Лоренцевых кривых с поверкой качества фитинга по среднему отклонению моделируемой кривой от экспериментальной по отношению к величине сигнала:
РаЬ = Р + (1 - С)Р, (3)
где Раь - параметр Гаусса - Лоренца, характеризующий относительный вклад в форму Гауссовой линии; С - параметр моделирования, при С = 0 контур приобретает только Лоренцеву форму ( Рь ), а при С = 1 - форму Гауссовой составляющей (Ра). Качество сходимости кривых определялось методом наименьших квадратов и проверялось по величине фитинга при сходимости кривых с погрешностью не более ~2 - 5 %.
Результаты и обсуждение
Характерные спектры флуоресценции, усредненные по сериям измерений, спектры аутофлуоресценции АР(1ет) и результат спектрального разложения АР(1ет ) для нормальных биотканей (вариант (а)) и пораженных каллезной формой язвенных дефектов (вариант (Ь)) приведены соответственно на рис. 1 и 2. Как видно из рисунков, спектральный контур флуоресценции здоровых объектов имеет максимум при ~475±10 нм и четыре плеча вблизи длин волн ~405±10, 515±10, 550±10 и 610±10 нм. По мере развития каллезной формы дефектов происходит снижение интенсивности флуоресценции до ~2,5 - 3 раз с незначительным сдвигом максимума в коротковолновую область спектра примерно на ~15 нм и возгорание полос при длинах волн ~405±10 и 610±10 нм. Статистический разброс значений для спектров флуоресценции биотканей не превышал ~10 %, за исключением данных, соответствующих длинам волн ~405±10 и 610±10 нм, где разброс
Р(1ет ) достигал ~25 %.
Для спектров аутофлуоресценции АР(1ет ) и квантового выхода флуоресценции р (1ет) характерно наличие единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область на ~15 - 25 нм относительно главного максимума спектров Р(1ет ), отсутствие заметных впадин на длинах волн поглощения крови, за исключением незначительного плеча вблизи ~415 нм, и монотонное убывание зна-
чений как AF(lem ) , так и j(1em) по мере развития каллезных дефектов. Наличие данной компоненты, скорее всего, связано с остаточным перепоглощением фотонов флуоресценции эндогенными хромофорами биотканей - производными флавиновых и порфириновых групп [11, 12].
Вместе с этим результаты спектрального разложения AF (lem ) для исследуемых образцов показали, что, по крайней мере, вклады 7 групп флуорофоров (показаны цифрами) могут быть различимы. Потенциальным флуорофором, ответственным за первую группу, является производная пиридоксина (B6) - 5'-фосфоперидоксаль, для которого характерен максимум возбуждения/эмиссии в
области 1eJ 1em ~330/385 нм [10 - 12].
Вторую группу флуорофоров образуют белки - коллаген I и коллаген III. Эти вещества обнаруживают максимум 1exj 1em в области длин волн ~340/395 нм [10 - 12].
о
н о
S
Еы
"С
350
400
450
500
550
600
650
700
1, нм
Рис. 1. Спектры флуоресценции F(Лет ) и аутофлуоресценции AF(Лет ) , а также результат
спектрального разложения спектра аутофлуоресценции AF(Лет ) для здоровых участков биоткани. Цифрами показаны группы спектральных компонентов разложения
8
0
2,5
ч <и
Я н о
Па
to
^
Па to
0,0
1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-Г-
350 400 450 500 550 600 650 700
X, нм
Рис. 2. Спектры флуоресценции F(lem ) и аутофлуоресценции AF(lem ) , а также результат
спектрального разложения спектра аутофлуоресценции AF(lem ) для участков биоткани, пораженной каллезной формой язвенных дефектов. Цифрами показаны группы спектральных компонентов разложения
К третьей группе флуорофоров могут быть отнесены молекулы пиридоксино-вой кислоты с максимумом 1exj 1em ~315/430 нм [10 - 12].
Четвертую группу флуорофоров образуют молекулы восстановленной формы никотинамид аденин динуклеотида NAD(P) H с максимумом возбуждения/эмиссии при 1exj 1em ~345/465 нм [10 - 12].
Пятая группа может быть обусловлена эмиссией рибофлавина (B2) и его производных - коферментов дегидрогеназ FAD и FMN с максимумом вблизи
KJKm ~370-450/520-530 нм [10 - 12].
Положение следующих двух групп близко к областям флуоресценции промежуточных продуктов обмена: шестой группы - к липофусцину с максимумом при
lexl 1em ~380/565 нм, а седьмой - к эндогенным порфиринам и его производным с максимумом возбуждения/эмиссии вблизи длин волн 1exj 1em -400/610-675 нм [10 - 12].
Сигнал, соответствующий остатку разложения, показан кривой 8. Наибольшая погрешность разложения наблюдалась в области длин волн -415, 550 и 585 нм, она обусловлена незначительной реабсорбцией фотонов флуоресценции эндогенными флуорофорами и остатками крови вблизи полос Соре, в- и а-окси-гемоглобина [13].
Анализ результатов спектрального разложения показывает, что в процессе развития поражения органа происходят изменения в соотношениях и вкладах компонентов в суммарный спектр свечения. В сравнении с нормой для биотканей с тяжелой формой поражения наблюдается возгорание порфириновой группы примерно в 2 раза и снижение в -1.5 раза интенсивности флуоресценции 5'-фосфоперидоксаля, что хорошо согласуется с результатами работы [14]. Усиление свечения порфиринового компонента (1exj 1em -400/610-675 нм) по мере развития
патологии может быть связано с увеличением кислотности среды воспаленной ткани, при которой происходит отрыв иона железа от молекулы гема порфирина [14]. Наибольшее возгорание коллагеновой группы (-2 раза) наблюдается также в пораженных биотканях, поскольку при хронических формах воспаления и склерозах основным компонентом фиброзной ткани является коллаген III [15, 16].
Интерес вызывают 4 и 5 группы спектрального разложения. Как уже было сказано, молекулы NAD(P)H и производные флавинов (FAD и FMN) функционируют как коферменты дегидрогеназ в окислительно-восстановительных реакциях, выступая акцептором электронов субстрата. Восстанавливаясь, хромофор NAD(P) накапливает положительно заряженные ионы водорода H+ и приобретает яркую флуоресценцию с небольшим сдвигом в коротковолновую область спектра, одновременно катализируя восстановление флавинового кофермента своей восстановленной формой [17]. В силу этого любые изменения в клеточном метаболизме могут быть выявлены в динамике соотношений спектральных компонентов этих веществ. Основываясь на методе количественной оценки степени дыхательной активности митохондрий [18, 19], мы рассматривали отношение площадей под кривыми 5 - S5525 нм и 4 - S4460 нм группы для каждого патологического состояния как отношение интенсивности флуоресценции флавинов - F^aviins и NAD(P)H -
FNAD(P)H , тем самым оценивая степень энергетического обмена в тканях по мере развития патологии.
S5 F
525 нм flavins
К = = F --(4)
460 нм NAD (P)■ H
Численные значения показателя клеточного дыхания К и квантового выхода флуоресценции в области спектрального максимума j(lem) патологических состояний 12-перстной кишки приведены в таблице № 1.
Таблица № 1. Значения показателей клеточного дыхания К и квантового выхода флуоресценции р (1ет ) для исследуемых биотканей при различных стадиях поражения
Стадия поражения биоткани К Р (1ет )
Норма ~0.65 ± 0.04 ~0.003 ± 5е-4
Высокая степень поражения ~0.35 ± 0.03 ~0.0012 ± 2е-4
Как видно из таблицы, процессы поражения сопровождаются снижением вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада КЛО(Р)Н в суммарный спектр, т. е. происходит изменение соотношения окисленной формы флавинов и восстановленной формы КЛО(Р)Н в сторону преобладания второй над первой. Подобный эффект свидетельствует об угнетении клеточного дыхания и развитии процесса истощения терминального окисления, неизбежно сопровождающего воспалительный процесс [5, 18, 19].
Изменение в соотношениях коферментов 5 и 4 групп также сопровождается уменьшением квантового выхода флуоресценции более чем в 3 раза для биотканей с высокой стадией поражения. Поскольку квантовый выход является чувствительным индикатором химического окружения флуорофора, то уменьшение
Р (1ет) указывает на рост безызлучательной дезактивации вследствие процессов тушения и миграции энергии в биологических средах. Следовательно, язвенные дефекты, протекающие в тканях 12-перстной кишки, неизбежно приводят к уменьшению времени жизни флуорофоров и изменению кинетики затухания флуоресценции.
Заключение
Результаты исследований стационарной аутофлуоресценции биоткани слизистой оболочки 12-перстной кишки при поражении каллезной формой язвенных дефектов позволяют установить следующие закономерности:
• Развитие каллезной формы дефектов сопровождается снижением интенсивности флуоресценции до ~3 раз с незначительным сдвигом максимума в коротковолновую область спектра примерно на 15 нм по сравнению с нормой. Возгорание полос происходит при длинах волн ~405 ± 10 и 610 ± 10 нм.
• Спектры коэффициента аутофлуоресценции и квантового выхода характеризуются наличием единственного максимума, сдвинутого в коротковолновую область на ~20 нм относительно максимума спектров флуоресценции, и отсутствием спектральных компонентов на длинах волн поглощения крови.
• Суммарный спектр аутофлуоресценции определяется, как минимум, излучением 7 групп флуорофоров с изменяющимися вкладами и соотношениями в процессе развития поражения.
• В процессе развития дисплазии происходит снижение вклада флуоресценции флавинов и увеличение вклада КЛО(Р)Н в суммарный спектр, т. е. происходит изменение соотношения окисленной формы флавиновых и восстановленной формы КЛОН в сторону преобладания второй над первой. В то же время для опухолевых тканей изменение в соотношениях коферментов носит обратный характер: наблюдается снижение (~2 раза) интенсивности флуоресценции 5' - фос-
фоперидоксаля и возгорание групп, соответствующих коллагену и эндогенным порфиринам.
• Типичные значения квантового выхода флуоресценции для соответствующих патологических состояний биотканей лежат в пределах 1G-1G"4 степени и монотонно убывают в процессе развития малигнизации.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы «Развитие научного потенциала высшей школы», проект РНП № 2.1.1.3966, 2GG6 - 2GG7 гг. и гранта РФФИ, проект № 06-02-96609-р_юг_а, 2GG6 - 2GG8 гг.
Литература
1. Тучин В.В. // УФН. 1997. Т. 167. № 5. - С. 517.
2. Ангельский О.В., Ушенко А.Г., Архелюк А.Д. и др. // Оптика и спектроскопия. 2GGG. Т. 89. № 6. - С. 1G5G.
3. Straight R.C., Benner R.E., McClane R.W. et al. // Photochem. and Photobiol. 1991. Vol. 53. № 6. - P. 787.
4. Константинов Н.Ю., Терентьев М.М., Рыбаковский И.В. // Известия АН Сер. Физ. 1995. Т. 59. № 6. - С. 183.
5. Лисовский В.А., Щедрунов В.В., Барский И.Я. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии. - Л.: Наука, 1984. - 236 с.
6. Richards-Kortum R., Rava P.R., Petras R.E. et al. // Photochem. and Photobiol. 1991. Vol. 53. № 6. - P. 777.
7. Zeng H., MacAulay C., McLean D. et al. // Photochem. and Photobiol. 1995. Vol. 51. № 6. - P. 639.
8. Qu J., MacAulay C., Lam S. et al. // Optical Engineering. 1995. Vol. 34. - P. 3334.
9. Синичкин Ю.П., Утц С.Р., Меглинский И.В. и др. // Оптика и спектроскопия. 1996. Т. 8G. № 2. - С. 26G; № 3. - С. 431.
1G. GiraevK.M., MedjidovR.T., AshurbekovN.A. // International Endoscopy of Hepa-tology. The Luminescent Laparascopy in Hepatology. Falk Symposium. № 116. -Basel. 1999. - P. 29 - 3G.
11. Гираев К. М. // Тез. докл. ВНКСФ-7. Влияние воспалительного процесса на лазерно-индуцированную флуоресценцию ткани печени. - СПб., 2GG1. - С. 1G7 -1G9.
12. Агронская А.В., Гальперин М.Г., Жорина Л.В. и др. // Известия АН Сер. Физ. 1995. Т. 59. № 6. - С. 144.
13. Yasunori Saito, Mitsuyoshi Kanoh, Ken-Ichiro Hatake et al. // Appl. Optics. 1998. Vol. 37. № 3. - P. 431.
14. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине: Пер. с анг. -М.: Мир, 1965. - 468 с.
15. Bolin F.P., Preuss L.E., Taylor R.C. et al. // Appl. Optics. 1989. Vol. 28. № 12. -P. 2297.
16. Maitland D.J., Walsh J.T., Prystowsky J.B. // Appl. Optics. 1993. Vol. 32. -P. 586.
17. Woljbeiss O.S., Leiner M.J. // Anal. ^m. Acta. 1985. Vol. 167. - P. 2G3.
18. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии: Пер. с анг. - М.: Мир, 1986. - 496 с.
19. Карнаухов В.Н. // Цитология. 1976. T. 18. № 4. - С. 4G8.
