CC BY
8УДК 535.33/.34 535.3
К.М. Гираев, Н.А. Ашурбеков, Г.М. Абдурахманов, А.А. Муртазаева, К.С. Бекшоков, Т.А. Ибрагимов
Влияние повышенного содержания меди на спектрально-флуоресцентные
свойства биотканей
Дагестанский государственный университет, kamal_giraev@mail.ru
Методом 3-D флуоресцентной спектрометрии исследовано токсическое влияние сернокислой меди дозой LD50 длительностью 3 и 12 часов на спектральные свойства тканей желудка in vivo. Установлено, что развитие соответствующих форм интоксикации приводит к изменению как интенсивности, так и формы спектральных контуров флуоресценции.
Ключевые слова: биоткани, тяжелые металлы, медь, интоксикация, спектроскопия, флуоресценция.
Toxic influence of sulfur-acid copper in doze LD50 during 3 and 12 hours on spectral properties of stomach tissues in vivo have been investigated by 3-D method of fluorescent spectrometry. It is obtained, that development of corresponding forms of intoxication leads to change, both intensity, and forms of spectral contours of fluorescence.
Keywords: tissues, heavy metals, copper, intoxication, spectroscopy, fluorescence.
Введение
В настоящее время общеизвестно (см., например, [1, 2]), что медь в небольших концентрациях для живого организма является биотиком, т. е. веществом, необходимым для нормального существования организма. В частности, медьсодержащие ферменты и белки, многие из которых обладают ферментативной функцией, играют исключительную роль в механизмах окислительно-восстановительных процессов кроветворения и усвоения железа в организме. Однако в результате развития техногенного производства, при котором медь поступает в окружающую среду в форме газов (возгоны металлов), в твердотельной форме (пылевидные частицы руды), в жидком виде (технологические сточные воды), а также широкого применения в сельском хозяйстве медьсодержащих препаратов (удобрения, пестициды), за последние десятилетия загрязнение почв, вод земной коры и вод Мирового океана медью занимает третье место после железа и марганца [1-4].
В больших концентрациях медь иммунотоксична, имеет канцерогенное и мутагенное действие, а также вызывает нарушение репродуктивной функции. Известно [1, 2], что в дозах, превышающих 0,6 г, медный купорос вызывает у человека рвоту, а при дозе 1-2 г -симптом тяжелого отравления с возможным смертельным исходом, отравление сопровождается гемолизом и большими деструктивными изменения в органах пищеварительной системы, головном мозге и почках.
В такой ситуации особую актуальность приобретают развитие и совершенствование методов качественного/количественного анализа, своевременной диагностики и мониторинга биосред in situ в условиях воздействия веществ повышенной токсичности. В то же время известно (см., например, [5-7]), что существенный интерес, проявляемый к диффузно-оптическим и лазерно-индуцированным спектрально-флуоресцентным исследованиям патологических состояний живых биообъектов в значительной мере вызван высокой информативностью и специфичностью этих методов. Данный подход позволяет выявить динамику физико- и биохимических процессов - от внутримолекулярного до уровня клетки, ткани, органа и даже всего организма - посредством их не-
инвазивного зондирования, проводимого совместно с лапороскопическими операциями и диагоностическими процедурами (см., например, [5-8]).
Целью данной работы является исследование токсического воздействия повышенного содержания медьсодержащего пестицида на лазерно-спектроскопические свойства биотканей. Для этого были измерены 3-D спектры флуоресценции ткани слизистой оболочки желудка in vivo при острой форме интоксикации сернокислой медью в дозе LD50 и различной длительности ее воздействия.
Материалы и методы
Спектрально-флуоресцентные исследования токсического воздействия медного купороса на живые биообъекты проводились на половозрелых самцах белых крыс породы Vista общим количеством 20 штук приблизительно одного веса и возраста. Эффект острой формы интоксикации моделировался на 12 крысах путем перорального введения раствора медного купороса (CuSO4x5H2O) в дозе LD50 (3 00 мг CuSO4 на 1 кг веса крысы [3]) длительностью 3 и 12 часов. Подобный способ введения пестицида, согласно работам [4], позволяет существенно упростить и сократить время затравки, а также прогнозировать токсичность изучаемых веществ. Контрольные измерения обеспечивала группа интактных крыс в количестве 8 шт. Кроме того, при выборе сроков затравки учитывалось, что один день жизни крысы приравнивается в среднем к 1 месяцу жизни человека, следовательно, 3 и 12 часов затравки крысы приравниваются соответственно приблизительно к 4 и 15 дням - для человека [1, 2, 4].
Общая схема проведения экспериментальных исследований заключалась в следующем. За сутки до затравки животных выдерживали без питания. Затем крыс взвешивали. В соответствии с их весом перорально вводили раствор CuSO4. По истечении 3-х часов затравки крысам, находящимся под общей анестезией, проводили вскрытие брюшной полости и выполняли измерения спектров стационарной флуоресценции тканей желудка in vivo.
Измерение стационарных 3-D спектров флуоресценции F(X) проводилось на лазер-но-спектрометрическом комплексе стандартной схемы с разверткой по длинам волн в интервале 200-1100 нм с использованием волоконно-оптической системы. Возбуждение спектров флуоресценции осуществлялось излучением ксеноновой лампы ДКсШ-150, совмещенной с монохроматором МДР-206 (решетка 1200 штр./мм, линейная дисперсия 4,3 нм/мм; ООО «ЛОМО-ФОТОНИКА», г. Санкт-Петербург). В качестве волоконно-оптической системы использовался Y-образный измерительный зонд, состоящий из двух «рукавов» (передающего и принимающего) и контактного катетера, в котором коаксиально размещались световодные каналы. Волоконные световоды, формирующие центральный канал зонда, предназначались для подведения возбуждающего излучения к биоткани, а световоды, расположенные по периферии, образовывали канал регистрации и служили для сбора ответных фотосигналов и передачи их к спектрографу. Спектральный анализ фотосигналов осуществлялся при помощи автоматизированного спектрометра MS3504i («СП СОЛАР ТИИ», Беларусь) на базе спектрографа (дифракционная решетка 200 штр./мм, обратная линейная дисперсия 14,5 нм/мм) и ПЗС-матричной камеры HS-103H (16-бит, 2048*64 пикс., спектральная чувствительность 200-1100 нм; «Hamamatsu», Япония), сигнал с которой подавался на персональный компьютер через USB-порт. Таким образом, спектральный диапазон возбуждения 3-D спектров флуоресценции составил X ~ 250-460 нм, а регистрации - X ~ 320-800 нм.
Для тканей желудка каждого исследуемого животного было проведено по 3 серии измерений. Окончательный результат по каждому животному определялся путем усреднения серийных измерений по среднеквадратичному отклонению
8F =
^ (£,F -^F)Vn(n -1) , где n - число серий измерений, ^ - спектры флуорес-
i=i /
F
ценции для /-той серии, £ - среднее значение интенсивности флуоресценции в каж-
n
дой спектральной точке, найденное как .
i=1
Результаты и обсуждение
Типичные 3-D спектры флуоресценции F(Xex, Xem), усредненные по сериям измерений, образцам тканей желудка in vivo и длительности интоксикации сернокислой медью дозой LD5o, показаны на рис. 1. Из них интактным биотканям соответствуют спектры, приведенные на рис. 1.1, биотканям при интоксикации длительностью 3 часа - на рис. 1.2 и биотканям при интоксикации длительностью 12 часов - на рис. 1.3. При этом каждый из представленных 3 -D спектров состоит, в свою очередь, из трех серий спектральной информации. Серия (a) - соответствует возбуждению/эмиссии флуоресценции в интервале длин волн Xex/Xem ~ 250-310/320-600 нм, серия (b) - Xex/Xem ~ 315— 360/370-700 нм и серия (c) - Xex/Xem ~ 370-460/470-800 нм.
Как показывает амплитудный анализ флуоресцентных данных, 3-D спектры F(Xex, Xem), для всех исследуемых биотканей характеризуются наличием общих свойств и закономерностей. В частности, как для тканей желудка в норме, так и в зависимости от степени интоксикации наиболее высокие показатели интенсивности флуоресценции приходятся на первую спектральную область, обусловленную свечением ароматических гетероциклических аминокислот, прежде всего триптофанам (Xex/Xem ~ 295 ± 5/350 ± 5 нм) и тирозинам
(Xex/Xem ~ 280 ± 5/300 ± 5 нм) [8, 9]. Поскольку эти аминокислоты являются основными структурными элементами белков и сконцентрированы преимущественно в ядрах и цитоплазме клеток (митохондрии, сократительный аппарат и др.), то содержание их в эпителиальных тканях значительно выше, чем в других биотканях (соединительная, мышечная и нервная ткани) [8, 9]. В дополнение к этому незначительная глубина проникновения возбуждающего излучения УФ-диапазона (порядка нескольких клеточных слоев) и отсутствие кровеносной системы в слое эпителия приводят к тому, что вклад этой биоткани в формирование УФ флуоресценции во много раз превосходит вклады более глубоких анатомических слоев (слизистая и подслизистая основы).
Меньшими значениями интенсивности флуоресценции характеризуется вторая спектральная группа (¿-область). Точное определение природы флуоресценции биотканей в этих диапазонах представляется несколько затруднительным вследствие спектральных вариаций оптических свойств флуорофоров и высокой вероятности перекрытия полос возбуждения и флуоресценции. Наиболее явными претендентами на флуоресценцию биотканей в первой спектральной области могут быть структурные белки - коллаген и эластин с Xex/Xem ~ 325/400 нм и восстановленная форма коферментов - никатинамид аденин динук-леотид (фосфат) (NAD(P)H) с максимумами возбуждения/эмиссии Xex/Xem ~ (336, 351)/460 ± 10 нм [8, 9]. Кроме того, в этой области представлены спектральные свойства таких флуорофоров как витамины A (Xex/Xem ~ 325 ± 5/510 ± 10 нм) и K (Xex/Xem ~ 335 ± 5/480 ± 10 нм), витамин Бв и его производные с Xex/Xem ~ (315 - 340)/(3 85 - 425) нм, а также группа липидов - липофусцин и сероид с Xex/Xem ~ 340 - 395/540 ± 10 нм [8, 9].
Наиболее низким уровнем флуоресценции характеризуется третья спектральная группа (с-область). Потенциальными флуорофорами, ответственными за свечение биотканей в третьей спектральной области, по-видимому, являются флавины и их производная группа - окисленная форма коферментов - флавин мононуклеотид (FMN) и
n
флавин аденин динуклеотид (FAD) с Xex/Xem ~ (370, 450)/530 ± 10 нм [8, 9]. В этом же диапазоне флуоресцируют эндогенные порфирины и их производные с Xex/Xem ~ (400 -450)/(630, 690) нм [8, 9], молекулы витамина D с Xex/Xem ~ 390 ± 5/480 ± 10 нм и фосфо-липиды с Xex/Xem ~ 436 ± 5/(540, 560) нм [8, 9]. В ряде случаев хорошо выражены спектральные компоненты с максимумом при Xex/\em ~ 440 ± 5/540 ± 10 нм, соответствующие свечению фосфолипидов.
Статистический разброс значений интенсивности флуоресценции для исследуемых биообъектов составляет в среднем 15 %, за исключением данных, соответствующих токсически пораженным биотканям на длинах волн 405 ± 10, 630 ± 10 и 695 ± 10 нм. В этих спектральных интервалах разброс значений F(Xex, Xem) заметно выше и для некоторых образцов достигал 25-30 %.
1.2
250 260 270 280 290 300 310 Возбуждение, нм
a
250 260 2 70 280 290 300 310 Возбуждение, нм
a
700
670
640
610
I 580
а 550 S
8 520 а
| 490
е
460 430 400 370
b
330 345
Возбуждение, нм
0
4
8
12
16 "18
b
330 345
Возбуждение, нм
740 710 680 г 650
Е
§ 620
Е
a
£ 590
а
о
t 560 530 500 470
370 385 400 415 430 445 460 Возбуждение, нм
740710 680'
S 650 Е
§ 620'
Е
3
% 590 а
0
>у
1 560' 530'
500
470|..........
370 385 400 415 430 445 460
Возбуждение, нм
315
360
С
600
560
520
480
440
400
360
320
370
315
360
С
1.3
260 270 280 290 300 Возбуждение, нм
a
700 670 640 610
г
Ш 580
в
Я 550
ä 520 а.
£ 490
е
460
b
330 345
Возбуждение, нм
740
710
680
S 650 В
S
ä 620 в
8 590 в.
S
ь
5 «п
... ...........
370 385 400 415 430 445 460
c
Возбуждение, нм
Рис. 1. 3-Б спектры флуоресценции ткани желудка: 1.1 интактная биоткань; 1.2 - интоксикация медным купоросом в дозе ЬБ50 длительностью 3 часа; 1.3 - интоксикация медным купоросом в дозе ЬБ50 длительностью 12 часов
Далее: при сравнении с их нормальным состоянием развитие эффекта интоксикации острой формы в тканях желудка приводит как к достоверному снижению интенсивности флуоресценции преимущественно во второй и третьей спектральных группах, так и к изменению форм их спектральных контуров (см. рис. 1.1-1.3). В частности, по мере длительности воздействия токсиканта Си8О45Н2О на фоне общего снижения интенсивности свечения в спектральных группах (до 2 раз - для а-группы, до 4 раз - для Ь- и с-группы) происходит интенсификация спектральных полос флуоресценции в области длин волн возбуждения/эмиссии - Хех/Хет ~ (315 - 345)/520 ± 10 нм, Хех/Хет ~ (320 - 360)/610 ± 10 нм и ХеХХет ~ (380 ± 10, 440 ± 10)/620 ± 10 нм. Кроме того, при максимальной длительности интоксикации (12 часов) наблюдается возгорание интенсивности флуоресценции в первой спектральной группе вблизи длин волн Хех/Хет ~ 300 ± 10/(440 - 460) нм.
В целях количественной оценки влияния интоксикации сернокислой меди на спектрально-флуоресцентные свойства тканей желудка в работе вводились коэффициенты, характеризующие отношение интенсивности спектральных полос возбуждения/эмиссии флуоресценции, для которых указанные выше изменения наиболее различимы. В частности:
къ =■
if А* / А,) If (320 - -345 нм /525 ± 10 нм )
If (А* / Ает ) " If (320 - 360 нм/460 ± 10 нм)
If А* / А. ) If (320 - -345 нм /625 ± 10 нм)
1 f (А* / Ает ) " If (320 - -360 нм /460 ± 10 нм )
If Aex / Ает ) If (370 - -440 нм/635 ± 10 нм)
If Aex / Ает ) " If (370 - -440 нм /525 ± 10 нм)
Динамика коэффициентов К], К2 и кз для тканей желудка в норме и в зависимости от длительности (3 и 12 часов) интоксикации СиБО4-5НгО в дозе ЬБ50 показана на рис. 2.
00
560
520
480
440
400
360
530
430
500
320
400
250
310
370
315
360
К2 =
i
1,5
1,0
0,5
0,0
I-1 к
I-1 i
=1 К
0,45
0,2-г-0,22
■i
1,2
0,8
0,75
1,3
1,1
1,0
норма
3 часа
12 часов
Длительность интоксикации
2
К
3
Рис. 2. Динамика спектральных коэффициентов k¡, к2 и к3 для тканей желудка в норме и в зависимости от длительности (3 и 12 часов) интоксикации сернокислой медью в дозе LD50
Как видно из рис. 2, при сравнении с интактной группой развитие процессов интоксикации в биотканях сопровождается увеличением индекса к до 3 раз, что свидетельствует об увеличении вклада флуоресценции флавинов и уменьшении вклада NAD(P)H в суммарный спектр свечения. Следовательно, происходит изменение соотношения окисленной формы флавинов и восстановленной формы NAD(P)H в сторону преобладания первых над вторыми. Подобный факт свидетельствует об угнетении клеточного дыхания и развитии процесса истощения терминального окисления, неизбежно сопровождающих патологические процессы [10-12]. В то же время для индексов к2 и к3 соответствующие значения были до 7 и 5 раз. Факт повышения уровня к2 и к3 при тяжелых формах хронической интоксикации свидетельствует об увеличении концентрации промежуточных продуктов обмена и производных порфириновых групп в биотканях. Причем, согласно работам [8-12], интенсификация порфириновой компоненты может быть также связана с кислотным ph-сдвигом аномальных биотканей, при котором происходит отрыв иона железа от молекулы гема порфирина, что и приводит к резкому увеличению интенсивности красноволнового свечения этого флуорофора. Рост кислотности среды малигнизированных тканей, скорее всего, также является основной причиной коротковолнового сдвига максимумов спектральных компонентов вблизи Xex/Xem ~ 290 ± 10/350 ± 10 нм и появления флуоресценции при Xex/Xem ~ (280 - 310)/(440 - 460) нм. Как известно [9, 10], в кислой среде происходит диссоциация протона карбоксильной и аминогруппы индольного кольца триптофана, в результате чего максимум флуоресценции последнего претерпевает коротковолновой сдвиг, сопровождающийся резким снижением квантового выхода его флуоресценции.
Заключение
Обобщение результатов, полученных в ходе исследований in vivo тканей желудка в норме и по мере развития токсического воздействия сернокислой меди в дозе LD50 с использованием стационарной 3-D флуоресцентной спектрометрии, позволило выделить ряд закономерностей:
1. Наиболее высокие показатели интенсивности флуоресценции исследуемых биотканей приходятся на спектральную область с максимумом возбуждения/эмиссии на
длине волны Xex/Xem ~ 290 ± 10/350 ± 10 нм, обусловленным свечением молекул триптофана. Несколько меньшие значения интенсивности флуоресценции соответствуют второй спектральной группе, представленной свечением NAD(P)H, коллагена и эластина, а также различных витаминов. Наиболее низким уровнем флуоресценции характеризуется спектральная группа, представленная флуоресценций флавинов, эндогенных пор-фиринов, а также липидных групп.
2. По мере развития интоксикации сернокислой медью происходит снижение интенсивности флуоресценции до 2 раз для первой группы и до 4 раз для второй и третьей спектральных групп.
3. По сравнению с нормой воздействие токсиканта CuSO4-5H2O в дозе LD50 и длительностью 3 и 12 часов на живые биоткани приводит к интенсификации спектральных полос флуоресценции на длинах волн возбуждения/эмиссии Xex/Xem ~ (315 - 345)/520 ± 10 нм до 3 раз, Xex/Xem ~ (320 - 360)/610 ± 10 нм до 7 раз и Xex/Xem ~ (380 ± 10, 440 ± 10)/620 ± 10 нм до 5 раз.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., проект NK-38P-I7.
Литература
1. Шафеев М.Ш. Влияние экологических факторов на иммунный статус // Казанский медицинский журнал. 2000. № 5. - С. 436-440.
2. МоскалевЮ.И. Минеральный обмен. - М.: Медицина, 1985. - 288 с.
3. Бочкарев М.В., Ботнарь В.П., Василаки А.Ф., Чепой Ф.М. Клиника, дифференциальная диагностика и лечение хронических интоксикаций пестицидами. - Кишинев: Штиинца, 1979. - С. 28.
4. Agraval R.C., Kumar S. Hepatotoxic action diuron and hexachlorocyclohexane on white rats // Indian J. Exp. Biol. 1999. V. 37. - P. 502-504.
5. Оптическая биомедицинская диагностика // Пер. с анг. под ред. В.В. Тучина. -М.: Физматлит, 2007. Т. 1. - 560 с., Т. 2. - 368 с.
6. Richards-Kortum R., Sevick-Muraca E. Quantitative Optical Spectroscopy for Tissue Diagnosis // Annu. Rev. Phys. Chem. 1996. V. 47. - P. 555-606.
7. Ramanujam N. Fluorescence Spectroscopy In Vivo// Encyclopedia of Analytical Chemistry. - Chichester: R.A. Meyers (Ed.) John Wiley & Sons Ltd, 2000. - P. 20-56.
8. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине: Пер. с анг. - М.: Мир, 1965. - 468 с.
9. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии: Пер. с анг. - М.: Мир, 1986. - 496 с.
10. Ленинджер А. Биохимия. - М.: Мир, 1976. - 958 с.
11. Карнаухов В.Н. Спектральные исследования энергетического аппарата живых нервных клеток // Биофизика. 1973. Т. 13. - С. 185-188.
12. Карнаухов В.Н. Спектральный анализ и изучение внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергий // Цитология. 1976. Т. 18. - С. 622-629.
Поступила в редакцию 17 ноября 2010 г.
