CC BY
10УДК 535.33/.34 535.3 К.М. Гираев, Н.М. Абдуллаева, К. С. Бекшоков, Н.А. Ашурбеков, Н.И. Рабазанов
Исследование токсического влияния хлорорганических пестицидов на свойства синаптосом карповых рыб методом флуоресцентной спектроскопии
Дагестанский государственный университет; kamal_giraev@mail.ru
В работе приводятся результаты исследования спектров стационарной флуоресценции синаптосом карпов при разных сроках воздействия пестицида «Актара» (тиаметоксам) в дозе, составляющей 50 ПДК. По результатам спектральных исследований выполнен биохимический анализ и выявлен примерный механизм токсического воздействия хлорорганического пестицида на функционирование живых систем.
Ключевые слова: рыбы, синаптосомы, хлорорганические пестициды, хроническая интоксикация, спектры флуоресценции, механизмы воздействия.
Введение
Основными факторами, определяющими темпы и объемы токсикологических исследований в мире, являются огромное количество химических веществ, поступающих в обращение и связанный с этим риск. По данным Ассоциации всемирной охраны здоровья (ВОЗ), в жизнедеятельности человека используется свыше 100 различных токсичных препаратов, в числе которых наряду с тяжелыми металлами присутствуют фосфорорганические и хлорорганические пестициды. Характерная особенность циркуляции этих элементов в окружающей среде объясняется их устойчивостью, биологической доступностью, а также способностью к аккумуляции и высокой токсичностью, приводящей не только к острым токсиколого-экологическим ситуациям, но и к хроническим интоксикациям и ухудшению основных медико-демографических показателей состояния здоровья населения (см. например, [1, 2]).
В этой связи несомненный интерес представляют исследования современного экологического состояния на примере Каспийского моря и Прикаспийской низменности, являющихся зоной воздействия множества антропогенных факторов. Основные источники поступления загрязняющих веществ: их вынос с речными стоками, сброс неочищенных промышленных и сельскохозяйственных стоков, коммунально-бытовых сточных вод городов и поселков, расположенных на побережье моря, судоходство, эксплуатация нефтяных и газовых скважин и пр. Все это привело к тому, что за последние десятилетия загрязнение почв, вод, грунтов и гидробионтов Каспийского бассейна хлор-содержащими пестицидами и их соединениями существенно возросло (см. например, [3]). Накапливаясь в среде, хлорорганические пестициды откладываются в висцеральном жире и пилорических придатках рыб, они могут проникнуть во внутренние органы рыб и стать причиной серьезного отравления. Хронические воздействия малых концентраций пестицидов приводят к глубоким нарушениям функций и гистологических структур печени, задержкам и деформациям эмбрионального и постэмбрионального развития, появлению уродств в потомстве, торможению и диспропорции роста, пато-морфологическим и патофизиологическим нарушениям в крови [4, 5].
В сложившейся ситуации особую актуальность приобретают развитие и совершенствование экспериментальных и теоретических основ качественного и количественного анализа биологических систем в условиях воздействия веществ
повышенной токсичности. Использование в этих целях методов лазерно-индуцированной флуоресцентной спектроскопии, способных стимулировать большое многообразие физико-химических процессов на молекулярном уровне и до уровня клетки, ткани и органа, позволило бы решить проблемы, связанные с повышением уровня диагностического процесса, его точности, чувствительности и временного разрешения, и, в конечном итоге, организовать систему мониторинга окружающей среды и выработать критерий оценки биологического существования жизни в данной среде [6, 7].
Данная работа посвящена исследованию влияния пестицида группы неоникоти-ноидов на свойства синаптосом карпа обыкновенного. С этой целью были измерены спектры стационарной флуоресценции синаптосом карпов при разных сроках воздействия пестицида «Актара» (тиаметоксам) в дозе, составляющей 50 ПДК. По результатам спектральных исследований выполнен биохимический анализ и выявлен примерный механизм токсического воздействия хлорорганического пестицида на функционирование живых систем.
Материалы и методы
Объектом исследований процессов интоксикации хлорорганическим пестицидом послужили экземпляры карпа обыкновенного (Cyprinuscaprio L.), разных возрастных групп общим количеством 15 особей, выращенных в прудах Широкольского рыбокомбината Тарумовского района Республики Дагестан. Моделирование эффекта хронической интоксикации проводилось в аквариумах объемом 200 л при постоянной аэрации и температуре в пределах 21.0±2.0 0С. При этом в качестве хлорорганического токсиканта использовался пестицид «Актара» (ПДК = 0.01 мг/л) в концентрации 50 ПДК, что составило примерно 0.5 мг/л.
На 15 и 30-е сутки эксперимента проводилось выделение синаптосом мозга карпа методом дифференциального центрифугирования в условиях градиента плотности сахарозы при помощи ультрацентрифуги 0PTIMAL-90KCE (BeсkmanCoulter, США) согласно методике, описанной в [5]. Таким образом, образцы синаптосом были получены из трех групп объектов:
- контрольные образцы синаптосом, для получения которых рыбы содержались в воде без добавления пестицида;
- образцы синаптосом при среднем уровне интоксикации, для получения которых использовалась группа рыб, содержащаяся в течение 15 суток в аквариумах с добавлением пестицида «Актара» в концентрации 0.5 мг/л;
- образцы синаптосом при высоком уровне интоксикации, для получения которых использовалась группа рыб, содержащаяся в течение 15 суток в аквариумах с добавлением пестицида «Актара» в концентрации 0.5 мг/л.
Измерение стационарных спектров флуоресценции проводилось на лазерно-спектрометрическом комплексе стандартной схемы с разверткой по длинам волн в интервале 200-1100 нм с использованием волоконно-оптической системы. Возбуждение спектров флуоресценции осуществлялось излучением ксеноновой лампы ДКсШ-150, совмещенной с монохроматором МДР-206 (решетка 1200 штр./мм, линейная дисперсия 4.3 нм/мм; ООО «ЛОМО-ФОТОНИКА», г. Санкт-Петербург). В качестве волоконно-оптической системы использовался Y-образный измерительный зонд, состоящий из
двух «рукавов» (передающего и принимающего) и контактного катетера, в котором ко-аксиально размещались световодные каналы. Волоконные световоды, формирующие центральный канал зонда, предназначались для подведения возбуждающего излучения к исследуемому образцу, а световоды, расположенные по периферии, образовывали канал регистрации и служили для сбора ответных фотосигналов и передачи их к спектрографу. Спектральный анализ фотосигналов осуществлялся при помощи автоматизированного спектрометра MS3504i (SOL-Instruments, Белоруссия) на базе спектрографа (дифракционная решетка 200 штр./мм, обратная линейная дисперсия 14,5 нм/мм) и ПЗС-матричной камеры Ж-103Н (16 бит, 2048*64 пикс., спектральная чувствительность 200-1100 нм; Hamamatsu, Япония), сигнал с которой подавался на персональный компьютер через ^В-порт. Таким образом, возбуждение спектров флуоресценции осуществлялось на длинах волн 290±5, 340±5, 420±5 нм, а их регистрация - в спектральном интервале 300-800 нм.
Для каждого образца синаптосом было проведено по 3 серии измерений. Окончательный результат по образцам и соответствующей им стадии интоксикации определялся путем усреднения серийных измерений по среднеквадратичному отклонению
8 =
п (р _ р )2
V . Ч , где п - число серий измерений, р - спектры флуоресценции для ь ,=1 п(п _ 1)
той серии, р - среднее значение интенсивности флуоресценции в каждой спектральной
точке, найденное как V р / п
1=1
Экспериментальные результаты
Типичные спектры стационарной флуоресценции синаптосом, усредненные по сериям измерений и стадиям интоксикации пестицидом, показаны на рис. 1. При этом каждая из представленных флуоресцентных групп состоит из трех серий спектральных кривых (на рисунке показаны цифрами): серия 1 (^(X)) - соответствует спектрам флуоресценции, полученным при длинах волн возбуждения/эмиссии -К1кт ~290±5/320-600 нм, серия 2 (I2(а)) - при А^/А^ ~340±5/370-700 нм и серия 3
(^(а)) -при А^/А^ ~420±10/470-800 нм. Для проведения сравнительного анализа
спектры свечения второй и третьей серий нормированы к максимуму интенсивности спектра первой серии.
Как видно из рисунков, спектрам стационарной флуоресценции синаптосом всех групп рыб присущи ярко выраженные индивидуальные особенности. Так, например, для образцов синаптосом контрольной группы спектр флуоресценции первой серии 11 (а) (кривая 1, рис. 1 а) характеризуется наличием главного максимума на длине волны 355±3 нм и широкой длинноволновой полосы, где могут быть едва различимы два спектральных плеча в области длин волн 485±10 и 520±10 нм. В сравнении с этим для спектра флуоресценции этих же образцов второй группы I2f (X) (кривая 2, рис. 1 а) характерны три пика вблизи длин волн 425±5, 450±5 и 485±5 нм и плечо при 520±10 нм, а для синаптосом третьей группы ^ (X) (кривая 3, рис. 1 а) - два пика на длинах волн
505±5 и 520±5 нм и незначительное плечо при 570±10 нм. При этом соотношение ин-тенсивностей флуоресценции спектральных серий контрольных образцов составило примерно - I)(ятах)/ 12(ятах)/ I}(ятах) = 1.0/ 15.6/ 26.5 (см. рис. 1 а).
Развитие процессов интоксикации приводит к достоверному изменению как интенсивности, так и формы спектральных контуров флуоресценции синаптосом. В частности, при среднем уровне интоксикации в спектрах флуоресценции первой серии (кривые 1, рис. 1 Ь, 1 с) наблюдается снижение интенсивности свечения главного максимума (Хет = 355±3 нм), вследствие чего хорошо проявляются спектральные полосы при
длинах волн 415±5, 485±5 и 520±5 нм. Для второй серии флуоресценции (кривые 2, рис. 1 Ь, 1 с) развитие интоксикации приводит к уменьшению интенсивности спектральной полосы на длине волны 450±5 нм и появлению незначительного пика вблизи 675±5 нм. Для третьей серии (кривые 3, рис. 1 Ь, 1 с) спектральные изменения касаются, прежде всего, исчезновения пика на длине волны 505±5 нм и возгорания полосы свечения вблизи длины волны 675±5 нм, а также более выраженного проявления компоненты в области длин волн 565±10 нм. При этом изменения в соотношениях интен-сивностей спектральных серий флуоресценции для среднего уровня интоксикации составили - I}(ятах)/ 12(ятах)/ I}(ятах) = 1.0/ 11.2/ 18.9, а для высокого уровня -
1\ (лтах ) / I} (лтах ) / I} (лтах ) = 1.0/ 6.5/ 9.8 (рис. 1 Ь, 1 с).
Обсуждение спектральных характеристик флуоресценции синаптосом мозга карпа по мере развития интоксикации тиаметоксамом «Актара» позволяет выдвинуть свобод-норадикальную модель токсического действия этого пестицида. Участие свободных радикалов кислорода в детоксикации ксенобиотика - тиаметоксама через систему ци-тохрома Р-450, очевидно, вызывает окислительный стресс на уровне молекул белков, липидов и нуклеиновых кислот.
В частности, анализ флуоресцентных групп, полученных при исследовании синап-тосом мозга карпа, основан на том, что, согласно известным литературным и справочным данным [7-10], первая спектральная серия флуоресценции ^ (ятах) обусловлена свечением ароматических гетероциклических аминокислот, прежде всего триптофана (Кх1 Кт ~295/350 нм) и тирозина (Хех/Хет ~280/300 нм), а снижение интенсивности их свечения по мере развития интоксикации указывает на факт снижения их содержания в тканях. Сконцентрированные преимущественно в ядрах и цитоплазме клеток, эти флуорофоры участвуют в синтезе коферментов тканевого дыхания (никотинамидаде-ниндинуклеотид (фосфат) - NAD(P) Н) и антиоксидантной защите. Вследствие этого воздействие токсиканта приводит к угнетению тканевого дыхания, в т. ч. и за счет окислительной деструкции NAD(P)•H, что позволяет рассматривать снижение содержания аминокислот как компенсаторную реакцию на снижение NAD(P)•H.
100
300
If(*15.76) 3 - If (* 26.5)
100
400
500 600 X, нм
700
800
300
400
500
600
700
800
X, нм
0
0
Рис. 1. Спектры стационарной флуоресценции образцов синаптосом: a - контроль; b -синаптосомы со средним уровнем интоксикации (2 группа); c - синаптосомы с высоким уровнем интоксикации. Кривая 1 - первая серия, кривая 2 - вторая серия и кривая 3 - третья серия. Спектры флуоресценции второй и третьей серий нормированы к максимуму спектра
флуоресценции первой серии
Дополнительно к этому проявление спектральной компоненты синаптосом вблизи длины волны 415±5 нм при высоком уровне интоксикации, по-видимому, связано с переносом части энергии от тирозина белков к битирозину, спектральные характеристики которого лежит вблизи длин волн Хех1Xem ~315±10/420±5 нм. Данный факт достоверно указывает на усиление свободнорадикальных процессов по мере развития интоксикации, поскольку битирозин является маркером окислительной модификации белков, связанной с реакциями активных форм кислорода [7, 10-13].
Изменение спектральных характеристик второй серии флуоресценции также имеет общий характер для разных исследованных групп рыб. Точное определение природы флуоресценции биологических объектов в этом интервале длин волн представляется несколько затруднительным вследствие вариаций оптических свойств флуорофоров и высокой вероятности перекрытия полос возбуждения и флуоресценции. Наиболее явным претендентом на флуоресценцию биосред во второй серии спектров может быть восстановленная форма кофермента NAD(P)H с максимумом поглощения/эмиссии вблизи длин волн Kex/Xem ~(336, 351)/460±10 нм [7-10]. Кроме того, в этой области представлены спектральные свойства таких флуорофоров, как витамин A ( Хех/Xem ~325/510 нм) и K (Aex/Xem ~335/480 нм), витамин B6 и его производные с Хех1Xem ~(315-340)/(385-425) нм [7-9].
Анализ спектров флуоресценции второй серии If (Xmax) показывает, что по мере
развития интоксикации происходит значительное снижение содержания восстановленной формы NAD(P) и переход этого кофермента в окисленную форму, которая флуо-риметрически не активна. Причинами снижения восстановленных форм NAD(P)H является разобщение митохондриального дыхания вследствие эффекта перекисного окисления липидов на мембраны митохондрий, а также их участие в реакциях перекисного окисления липидов [10-13]. В свою очередь, разобщение клеточного дыхания становится еще одним возможным пусковым механизмом дальнейшей генерации активных форм кислорода. Кроме того, известно (см., например, [10]), что NAD(P)H тратится в реакциях перекисного окисления липидов внутриклеточных органелл. В результате этого происходит продуцирование липофусцина (Хех1Xem ~340-395/550±10 нм), являющегося маркером повреждения внутриклеточных структур посредством активных форм кислорода, что, возможно, объясняет проявление компоненты вблизи длин волн 575±10 нм в спектрах флуоресценции синаптосом по мере развития интоксикации [8, 10].
Дальнейшее рассмотрение экспериментальных результатов показывает, что потенциальными флуорофорами, ответственными за свечение образцов синаптосом в третьей спектральной серии I3f (х), по-видимому, являются флавины и их производные группы (окисленная форма коферментов - флавинмононуклеотид (FMN) и флавинадениндинук-леотид (FAD) с максимумом вблизи Кех1 Xem ~(370, 450)/530±10 нм, эндогенные порфи-
рины и их производные с Кех1 Kem ~400-450/610-690 нм и молекулы витамина D с Кх/Кт ~390/480 нм [7-10]. При этом амплитудный анализ показывает, что по мере ин-
токсикации вклад свечения флавиновых групп практически не снижается, причем в спектрах флуоресценции как второй, так и третьей серии. Причиной этому может быть то, что, в отличие от NAD(P)H, флавиновые коферменты флуоресцируют преимущественно в окисленной форме, что приводит к преобладанию вторых флуорофоров над первыми. Обнаруженное изменение баланса и форм важнейших коферментов дыхательной цепи свидетельствует о нарушении дыхания, связанного с активацией свобод-норадикальных процессов [10-13].
Особый интерес вызывают флуорофоры, свечение которых идентифицируется как флуоресценция производных порфириновых групп. В биообъектах эта группа флуоро-форов существует преимущественно в виде металлопорфиринов, и в обычном состоянии их флуоресценция незначительна, что в сочетании с малой их концентрацией в нормальных клетках приводит к слабовыраженному красноволновому свечению (см., например, [7-10]). Однако при отрыве иона металла от гемапорфирина в случае, например, свободнорадикального окисления порфиринового кольца, появления многочисленных окисленных групп метаболитов или кислотного pH-сдвига самой среды происходит значительная интенсификация свечения порфириновых комплексов, что отчетливо прослеживается в спектрах флуоресценции третьих серий I3f (я) для синаптосом по мере развития интоксикации пестицидом [10-13].
Заключение
Результаты исследования токсического влияния хлорсодержащих пестицидов на биохимические свойства синаптосом карповых рыб методом флуоресцентной спектроскопии позволяют сделать следующие выводы:
1. Спектры флуоресценции образцов синаптосом при различных длинах волн возбуждения образованы, как минимум, излучением 7 групп флуорофоров, из которых основной вклад вносят гетероциклические ароматические аминокислоты - тирозин и триптофан, коферменты дегидрогеназ - NAD(P)H и флавопротеиды, липофусцин и группы эндогенных порфиринов.
2. По мере воздействия токсиканта наблюдается:
- снижение интенсивности флуоресценции тирозина и триптофана с переносом части их энергии к битирозину и увеличение интенсивности его свечения до 4-х раз;
- угнетение клеточного дыхания и развитие процесса истощения терминального окисления, что определяется в виде преобладания до 1,5 раза окисленных форм флавопротеидов над формой NAD(P)H; интенсификация флуоресценции порфириновых групп до 3 раз;
- снижение интенсивности первой спектральной серии, а также возрастание роли второй и третьей спектральных серий флуоресценции синаптосом соответственно до 2 и 3-х раз.
3. На основе результатов анализа спектрально-флуоресцентных исследований сформирована свободнорадикальная модель патологического действия тиаметоксама «Актара», лежащая в основе окислительного стресса, что объясняет зависимость спектральных свойств синаптосом при развитии интоксикации во времени.
Работа выполнена с использованием приборной и материально-технической базы Центра коллективного пользования «Aнaлитическaя спектроскопия» Дагестанского государственного университета.
Литература
1. Линник n.H., Искра И.В. Кадмий в поверхностных водах: содержание, формы нахождения, токсическое действие // Гидробиологический журнал. - 1997. - Т. 33, № 6. - С. 72-87.
2. Орлов Д.С., Садовникова Л.К, Лозановская И.H. Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении. - M.: Высш. шк., 2002. - 334 с.
3. Гусев A.T. Охрана рыбохозяйственных водоемов от загрязнения. - M.: Пищевая промышленность, 1975. - 367 с.
4. ^стюк K.B., Грубинко В.В. Роль мембранных АТФ-аз в адаптации гидробио-нтов к факторам водной среды // Гидробиологический журнал. - 2010. - Т. 46, № 4. -С. 49-62.
5. Hajos F. An improved method for the preperetion of sinaptosomal fractions in high purity // Brain Res. - 1975. - V. 93, № 3. - P. 285-289.
6. Гираев K.M., Aшyрбеков H.A. и др. Влияние повышенного содержания меди на спектрально-флуоресцентные свойства биотканей // Вестник Дагестанского государственного университета. - 2011. - Вып. 1. - С. 14-20.
7. Ramanujam N. Fluorescence Spectroscopy in vivo // Encyclopedia of Analytical Chemistry. R.A. Meyers (Ed.) John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2000. - P. 20-56.
8. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине: пер. с анг. -M.: Ыир, 1965. - 468 с.
9. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии: пер. с анг. - M.: M^, 1986. - 496 с.
10. ЛенинджерA. Биохимия. - M.: Ыир, 1976. - 958 с.
11. Дубинина Е.Е., Тавровская С.В., Kзьмич Е.В., Монова H.B., МорозоваМ.Г., ^вругина С.В., Смирнова T.A. Окислительная модификация белков: окисление триптофана и образование битирозина в очищенных белках с использованием системы Фен-тона // Биохимия. - 2002. - Т. 67. - С. 413-421.
12. Шаронов Б.П., Говорова HM., Лызлова C.H. Антиокислительные свойства и деградация белков сыворотки крови активными формами кислорода (О2, ОО-), генерируемыми стимулированными нейтрофилами // Биохимия. - 1988. - Т. 53. - С. 816824.
13. Dean R.T., Fu S., Stocker R., Davies M.J. Biochemistry and pathology of radical-mediated proteinoxidation // The Biochemical Journal. - 1997. - V. 324. - P. 1-18.
Поступила в редакцию 21октября 2013 г.
Toxic effects of organochlorine pesticides on the properties of cyprinid synaptosomes
by fluorescence spectroscopy method
K.M. Giraev, N.M. Abdulaeva, K.S. Bekshokov,N.A. Ashurbekov, N.I. Rabazanov Dagestan State University; kamal_giraev@mail.ru
The paper presents the survey results on fluorescence steady-state spectra of cyprinid sinaptasomes at different stages of "Akhtar" (thiamethoxam) pesticide exposure at a dose of 50 MPC. According to the results of the spectral studies a biochemical analysis has been performed and an approximate mechanism of organochlorine pesticide's toxic effects on the living systems' functioning has been revealed.
Keywords: fish, sinaptasomes, organochlorine pesticides, chronic intoxication, fluorescence spectra, mechanisms of effects.
Received October 21, 2013
