Роль гликолиза при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников у коринеформных бактерий Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Серия «Биология. Экология» И З В Е С Т И Я

2008. Т. 1, № 2. С. 24-28 Иркутского

Онлайн-доступ к журналу: государственного

http://isu.ru/izvestia университета

УДК 602:577.113.3 (075.8)

Роль гликолиза при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников у коринеформных бактерий

В. Ж. Цыренов, И. О. Пинуев, А. А. Санданов

Восточно-Сибирский государственный технологический университет, Улан-Удэ E-mail: office@esstu.ru

Аннотация. Исследован гликолиз в качестве источника энергии при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников (пуринов) у коринеформных бактерий. В опытах с бесклеточными экстрактами Corynebacterium flavum - ВСТИ 301, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 с помощью метода меченых атомов показано, что основным источником энергии при образовании нуклеозидди- и три-фосфатов (ADP, ATP, GDP, GTP) из нуклеозидмонофосфатов (AMP, GMP) является гликолиз.

Ключевые слова: гликолиз, нуклеотид фосфаты, фосфорибозилпирофосфат, рибоза-5-фосфат, биосинтез АТФ, АМФ, АДФ, микробиологический синтез.

Вещества нуклеотидной природы участвуют в наиболее важных процессах жизнедеятельности: функционировании наследственного аппарата и биосинтеза белков, регуляции биохимических процессов и энергетическом обмене. Все более расширяется область их практического использования в качестве лекарств, применения их в производстве реактивов, лекарств, вкусовых добавок и других ценных препаратов для нужд химической, фармацевтической и пищевой промышленности.

Из методов получения нуклеозидфосфатов наиболее перспективным является микробиологический метод, который на практике осуществляется двумя способами. Первый способ - прямая ферментация с применением ауксо-трофных мутантов. Второй способ микробиологического синтеза - сэлвидж (salvage)-синтез. Он основан на реакциях реутилизации низкомолекулярных продуктов катаболизма нуклеиновых кислот (пурины, пиримидины и их нуклеозиды). В техническом плане сэлвидж-синтез основан на применении специально подобранного микроорганизма, осуществляющего рибозилирование и фосфорилирование пуриновых и пиримидиновых оснований, их нук-леозидов или синтетических аналогов низкомолекулярных компонентов нуклеиновых кислот.

Автор с сотрудниками в течение длительного времени (с 1970 г.) разрабатывает теоретические и прикладные аспекты сэлвидж-синтеза нуклеозидфосфатов и нуклеотидных

коферментов. Ими открыта ранее не известная реакция синтеза ADP и впервые исследован кофермент пирофосфат: ADP-фосфотрансфе-раза, описан новый механизм регуляции. Впервые в России автором получены штаммы -продуценты нуклеотидов, разработана технология получения препаратов ATP, NAD, GTP и других нуклеотидов [2]. Технологии получения нуклеотидов внедрены на Олайнском заводе химреактивов (1973-1981 гг.).

Данная статья посвящена исследованию гликолиза в качестве возможного источника при сэлвидж синтезе нуклеозидфосфатов у штаммов продуцентов из крупы коринеформ-ных бактерий.

Материалы и методы

Исследовали микроорганизмы из группы коринеформных бактерий, осуществляющих сэлвидж-синтез нуклеотидов: Corynebacterium flavum ВСТИ 301 (Цыренов В. Ж., и др. Авторское свидетельство 726161, СССР, 1980) и музейный штамм Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 [1], который в настоящее время известен как Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872. Исследование механизма биосинтеза нуклеотидов у упомянутых выше микроорганизмов было проведено на примере образования ATP из аденина и GTP из гуанина с использованием бесклеточного экстракта.

Проведение ферментаций описано ранее [4]. Для получения бесклеточного экстракта использовали двухсуточную культуру. Для

изучения энзиматических реакций, участвующих в биосинтезе АТР, GTP из аденина и гуанина использовались 6 составов реакционной смеси. Смесь № 1: ФРПФ 0,5 мкМ, аденин

0,6 мкМ, С14-аденин (гуанин) 12^105 имп/мин, MgCl2 5 мкМ, трис-НС1-буфер (рН 8,0) 10 мкМ и экстракт энзимов 0,5 мг по белку в конечном объеме 1 мл. При испытании рибозо-5-фосфата (Р-5-Ф) в качестве рибозильного компонента ATP использовали: смесь № 2: Р-5-Ф I мкМ, аденин 0,6 мкМ, С14-аденин 12^ 105 имп/мин, ATP 0,5 мкМ, MgCl2 5 мкМ, трис-буфер (pH 8,0) 10 мкМ и экстракт 1,2 мг белку в конечном объеме 1 мл; смесь № 3 - смесь № 2 без Р-5-Ф; смесь № 4 - смесь № 2 без ATP и смесь № 5: смесь № 2 без аденина. Для исследования фос-форилирования AMP до ATP составляли смесь № 6: Р-5-Ф 0-15 мкМ, MgCl2 5 мкМ, трис-HCl -буфер (рН 8,0) 10 мкМ, AMA - 0,3 мкМ, C14-AMP 12,5 • 105 имп/мин и экстракт 1,2 мг по белку в конечном объеме 1 мл. Инкубацию проводили при 30 оС, без встряхивания. Реакция останавливалась добавлением 0,1 мл 60%-ной трихлоруксусной кислоты.

Образующиеся в реакционной смеси нуклеотиды определяли с помощью бумажной хроматографии. Радиоактивность измеряли жидкостным сцинтилляционным счетчиком SL-30 («Intertecnique»).

Удельную активность бесклеточного экстракта выражали как нМ нуклеотида (АМP, GMP, ADP, GDP, или ATP, GTP) в расчете на 1 мг белка. Количество нуклеотидов в нМ рассчитывали, исходя из распределения в них радиоактивности.

Результаты и обсуждение

Ранее было показано [3], что в клетке и в культуральной жидкости штаммов продуцентов накапливается большое количество до 4 мг/мл пентозофосфатов (Р-5-Ф, ФРПФ). Также было показано, что ФРПФ используется в аденинфосфорибозилтрансферазной реакции с образованием AMP. При этом была использована реакционная смесь № 1, состоящая из С14-аденина, ФРПФ, MgCl2 буфера и экстракта энзимов.

Было сделано наблюдение о том, что если в реакционной смеси № 1 заменить ФРПФ на Р-5-Ф и ATP (создавая, таким образом, реакционную смесь № 2), то в этих измененных условиях также интенсивно происходило образование AMP.

Исходя из этого наблюдения, мы попытались определить роль отдельных компонентов

реакционной смеси № 2, ставили опыт с бес-клеточным экстрактом, в вариантах которого последовательно исключали из состава реакционной смеси тот или иной компонент.

Как видно из данных таблицы 1 в реакционной смеси № 3 (которая в отличие от смеси № 2 не содержала Р-5-Ф) обнаруживаются следовые количества различных нуклеозидфосфа-тов. Это, по-видимому, объясняется дефицитом или отсутствием ФРПФ.

В реакционной смеси № 4 (которая в отличие от смеси № 2 не содержала ATP) наблюдался синтез нуклеозидфосфатов, в том числе значительных количеств ATP.

Это свидетельствует о том, что в смеси № 4, содержащей бесклеточный экстракт, происходят определенные процессы, которые обусловливают образование из Р-5-Ф ATP, необходимый для синтеза ФРПФ в ФРПФ-синтетазной реакции. Таким образом, ATP не является необходимым компонентом реакционной смеси, когда используется бесклеточный экстракт.

Аналогичный результат был получен при ферментации гуаниновых нуклеозидфосфатов с помощью Corynebacterium flavum.

Для среды № 4 были определены оптимальные концентрации субстратов: для Р-5-Ф-357 мкM и для аденина - 700 мкM. Оптимальное значение рН трис-HCl -буфера для образования ATP в этой смеси вставляла около 8,0.

Если в смеси № 1 (содержащей ФРПФ) происходит образование только ATP то в среде №4 (содержащей Р-5-Ф) - синтез нуклеозидфосфатов, включая ATP. Такой результат (который в определенной мере был неожиданным, поскольку Р-5-Ф является более простым соединением, чем ФРПФ) наводил на мысль, что Р-5-Ф является не только источником рибо-зильной части нуклеотидов, но и субстратом процессов, обеспечивающих фосфорилирова-ние нуклеозидмонофосфата до нуклеозидтри-фосфата (например, AMP до ATP).

Данное предположение было проверено с использованием реакционной смеси № 6, состоящей из Р-5-Ф, 04-AMP или d4-GMP, трис-HCl буфера, MgCl2 и бесклеточного экстракта. В первую очередь, было изучено влияние различных концентраций, Р-5-Ф на образование ATP у коринеформных бактерий (табл. 2.).

Обнаружилась четкая зависимость степени фосфорилирования от концентрации Р-5-Ф. Наблюдался синтез нуклеозидди- и трифосфа-тов в контрольных образцах, куда не добавляли Р-5-Ф. Это, очевидно, связано с наличием в

бесклеточном экстракте доноров макроэргиче-ских фосфатных групп, полифосфатов.

Зависимость фосфорилирования нуклео-зидмонофосфата от концентрации субстрата указывает на возможную роль гликолиза. Известно, что фосфоглюконатный путь, одним из промежуточных продуктов второго является Р-5-Ф, на одном из этапов может перейти в гли-колитический, т. е. Р-5-Ф может стать субстратом гликолиза, энергетический эффект которого в данном случае обеспечивает фосфорили-рование нуклеозидмонофосфата. Для проверки этого предположения был поставлен опыт с реакционной смесью № 4, в которой вместо Р-5-Ф была взята глюкоза (табл. 3).

Как видно из данных таблицы 3, наблюдалось заметное образование нуклеозидфосфатов в случае замены Р-5-Ф глюкозой. Наиболее высокий уровень синтеза ATP и GTP обнаруживается при концентрации глюкозы 6 мкМ.

Образование нуклеотидов при добавлении глюкозы, свидетельствует об участии гликолиза в фосфорилировании монофосфатов.

Проведенные нами опыты показали, что в реакционной смеси № 4 образование ATP происходит через AMP. Количество AMP также возрастало в присутствии NaF, являющегося ингибитором гликолиза. Ингибирующий эффект NaF на фосфорилирование AMP до ATP усиливался в присутствии фосфатов (табл. 4.)

Таблица 1

Испытание Р-5-Ф в качестве источника рибозильной части ATP

Реакционная смесь Основные компоненты реакционной смеси Удельная активность экстракта, нM/мг

С^-ATP ^-ADP с14-амр

№ 2 Р-5-Ф, ATP. 28,6 (±2,9) 67,4(±3,8) 108 (±9,9)

№ 3 Смесь № 2 без Р-5-Ф Следы Следы Следы

№ 4 Смесь № 2 без ATP 135 (±) 76,9 (±6,1) 24,3 (±1,8)

№ 5 Смесь № 2 без аденина Следы Следы Следы

Таблица 2

Влияние концентрации Р-5-Ф на образование пуриновых нуклеозидди- и три-фосфатов

у Corynebacterium flavum ВСТИ 301 и Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872*

№ варианта Р-5-Ф мкM Удельная активность экстракта, нШмг, 30 мин

С14-АЭР ^-GDP С^-ATP С^-GTP

і 0 25,2 20,8 40,7 21,6

2 5 75,2 36,9 62,0 30,9

3 10 97,8 45,6 74,0 40,6

4 15 72,6 32,4 61,2 31,7

*Использована реакционная смесь № б состава: Р-5-Ф, концентрация указана в таблице, MgCl2 5 мкM, трис-HCl -буфер (рН 8,0) 10 мй^ AMP - 0,3 мй^ С14-АМР 12,5-105 имп/мин и экстракт 1,2 мг по белку в конечном объеме і мл. Радиоактивность на единицу веса продукта (ADP, ATP) составляла 4,18-103 имп/мин на і нM. В случае синтеза GTP использовался GMP, С14^МР.

Таблица 3

Влияние концентрации глюкозы на образование нуклеозидфосфатов пуринового ряда бесклеточным экстрактом C. flavum ВСТИ 301

№ варианта Глюкоза, мкM Удельная активность экстракта, kM/мг, 30 мин

AMP GMP ADP GDP ATP GTP

і 0 1,2 1,3 3,1 2,8 14,6 12,1

2 2 3,2 1,7 5,2 4,1 26,0 14,2

3 4 7, і 3,7 10,1 6,4 44,0 26,4

4 6 8,2 4,5 11,0 5,9 50,2 28,7

5 8 7,4 3,4 9,8 4,3 42,1 22,6

6 10 2, і 1,5 4,8 4,2 26,5 14,8

Таблица 4

Влияние фторида натрия и фосфатов на образование нуклеозидфосфатов бесклеточным

экстрактом С. Аауыт ВСТИ 301

Буфер NaF, 100 мкМ Удельная активность экстракта, нМ/мг белка, 30 мин

c14-atp c14-adp c14-amp

Трис-HCl буфер, pH 8,0 - 96 102 29

Трис-HCl буфер, pH 8,0 + 21,0 36,1 42,8

Трис-HCl буфер, pH 9,0 + 30,2 61,2 71,5

Na-фосфатный буфер, 10 мкМ, pH 7,4 - 22,7 58,6 174,1

Na-фосфатный буфер, 10 мкМ, pH 7,4 + 9,1 25,7 98,7

Заключение

В работе показана взаимосвязь энергетического обеспечения сэлвидж-синтеза нуклеозидфосфатов у коринеформных бактерий с процессом гликолиза.

Литература

1. Лукин Н. С. Влияние компонентов среды на метаболизм культуры Вгеу&айегшт ammoniagenes -продуцента 5-инозиновой кислоты / Н. С. Лукин, Л. А. Казаринова Л. И. Ерохина // Прикладная био-хим. и микробиол. - 1978. - Т. 14. - С. 565-572.

2. Цыренов В. Ж. Микробиологический синтез нуклеозидфосфатов / В. Ж. Цыренов - М. : Наука, 1990. - 200 с.

3. Санданов Ч. М. Изучение метаболического

механизма синтеза адениновых нуклеотидов из экзогенного аденина у коринеморфных бактерий / Ч. М. Санданов, И. В. Ерошина, В. Ж. Цыренов // Микробиология. - 1981. - Т. 50, Вып.6. -

С. 1053-1056.

4. Tsirenov V. Zh. Concerning peculiarities of NAD byosinthesis regulation by producer strains of microorganisms / V. Zh. Tsirenov [et al.] // Biotechnology and industry Editor G. E. Saikov. - Nova Science Publishers Inc., 2004. - Р. 55-74.

The role of glycolis at the microbiological synthesis of nucleoside phosphates from predecessors at corinebacteria

V. Zh. Tsirenov, I. O. Pinuev, A. A. Sandanov East-Siberian State Technological University, Ulan-Ude

Abstract. The glycolis has been studied as an energy source for microbiological synthesis of nucleoside phosphates from predecessors at Corinebacteria. In experiences with uncellular extracts of Corynebacterium flavum - ВСТИ 301 and Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 by means of a method labeled atoms has been shown that, что glycolis is main energy source for synthesis of nucleosidedi- and triphosphates (ADP, ATP, GDP, GTP) from nucleosidmonophosphates (AMP, GMP).

Key words: Glycolis, nucleoside phosphates, phosphorylation, phosphoribosl pirophosphate, ribose-5-phosphate, biosynthesis ATP AMP ADP, microbiological synthesis.

Цыренов Владимир Жигжитович Восточно-Сибирский государственный технологический университет,

Институт пищевой инженерии и биотехнологии

670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40-а

доктор биологических наук, профессор

зав. кафедрой биотехнологии

тел. (301 2) 41-71-46, факс (301 2) 43-14-15

Е-таіІ: office@esstu.ru

Tsirenov Vladimir Zhigzhitovitch East-Siberian State Technological University 670013, Ulan-Ude, 40-a, Klyuchevskaya St.

D. Sc. in Biology, prof, Head of Department of Biotechnology

phone: (301 2) 41-71-46, fax: (301 2) 43-14-15 Е-mail: office@esstu.ru

Пинуев Иван Очирович Восточно-Сибирский государственный технологический университет кандидат биологических наук, доцент кафедры биотехнологии 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40-а тел. (301 2) 41-71-46, факс (301 2) 43-14-15

Санданов Александр Андреевич Восточно-Сибирский государственный технологический университет аспирант

670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40-а тел. (301 2) 41-71-46, факс (301 2) 43-14-15

Pinuev Ivan Ochirovich

East-Siberian State Technological University

670013, Ulan-Ude, 40-a, Klyuchevskaya St.

Ph. D. in Biology, ass. prof

phone: (301 2) 41-71-46, fax: (301 2) 43-14-15

Sandanov Aleksandr Andreevich The East-Siberian State Technological University 670013, Ulan-Ude, 40-a, Klyuchevskaya St. doctoral student

phone: (301 2) 41-71-46, fax: (301 2) 43-14-15