Научная статья на тему 'Роль гликолиза при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников у коринеформных бактерий'

Роль гликолиза при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников у коринеформных бактерий Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
293
16
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГЛИКОЛИЗ / НУКЛЕОТИД ФОСФАТЫ / ФОСФОРИБОЗИЛПИРОФОСФАТ / РИБОЗА-5-ФОСФАТ / БИОСИНТЕЗ АТФ / АМФ / АДФ / МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ / GLYCOLIS / NUCLEOSIDE PHOSPHATES / PHOSPHORYLATION / PHOSPHORIBOSL PIROPHOSPHATE / RIBOSE-5-PHOSPHATE / BIOSYNTHESIS ATP AMP ADP / MICROBIOLOGICAL SYNTHESIS

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Цыренов Владимир Жигжитович, Пинуев Иван Очирович, Санданов Александр Андреевич

Исследован гликолиз в качестве источника энергии при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников (пуринов) у коринеформных бактерий. В опытах с бесклеточными экстрактами Corynebacterium flavum ВСТИ 301, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 с помощью метода меченых атомов показано, что основным источником энергии при образовании нуклеозиддии трифосфатов (ADP, ATP, GDP, GTP) из нуклеозидмонофосфатов (AMP, GMP) является гликолиз.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Цыренов Владимир Жигжитович, Пинуев Иван Очирович, Санданов Александр Андреевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The role of glycolis at the microbiological synthesis of nucleoside phosphates from predecessors at corinebacteria

The glycolis has been studied as an energy source for microbiological synthesis of nucleoside phosphates from predecessors at Corinebacteria. In experiences with uncellular extracts of Corynebacterium flavum ВСТИ 301 and Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 by means of a method labeled atoms has been shown that, что glycolis is main energy source for synthesis of nucleosidediand triphosphates (ADP, ATP, GDP, GTP) from nucleosidmonophosphates (AMP, GMP).

Текст научной работы на тему «Роль гликолиза при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников у коринеформных бактерий»

Серия «Биология. Экология» И З В Е С Т И Я

2008. Т. 1, № 2. С. 24-28 Иркутского

Онлайн-доступ к журналу: государственного

http://isu.ru/izvestia университета

УДК 602:577.113.3 (075.8)

Роль гликолиза при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников у коринеформных бактерий

В. Ж. Цыренов, И. О. Пинуев, А. А. Санданов

Восточно-Сибирский государственный технологический университет, Улан-Удэ E-mail: [email protected]

Аннотация. Исследован гликолиз в качестве источника энергии при микробиологическом синтезе нуклеозидфосфатов из предшественников (пуринов) у коринеформных бактерий. В опытах с бесклеточными экстрактами Corynebacterium flavum - ВСТИ 301, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 с помощью метода меченых атомов показано, что основным источником энергии при образовании нуклеозидди- и три-фосфатов (ADP, ATP, GDP, GTP) из нуклеозидмонофосфатов (AMP, GMP) является гликолиз.

Ключевые слова: гликолиз, нуклеотид фосфаты, фосфорибозилпирофосфат, рибоза-5-фосфат, биосинтез АТФ, АМФ, АДФ, микробиологический синтез.

Вещества нуклеотидной природы участвуют в наиболее важных процессах жизнедеятельности: функционировании наследственного аппарата и биосинтеза белков, регуляции биохимических процессов и энергетическом обмене. Все более расширяется область их практического использования в качестве лекарств, применения их в производстве реактивов, лекарств, вкусовых добавок и других ценных препаратов для нужд химической, фармацевтической и пищевой промышленности.

Из методов получения нуклеозидфосфатов наиболее перспективным является микробиологический метод, который на практике осуществляется двумя способами. Первый способ - прямая ферментация с применением ауксо-трофных мутантов. Второй способ микробиологического синтеза - сэлвидж (salvage)-синтез. Он основан на реакциях реутилизации низкомолекулярных продуктов катаболизма нуклеиновых кислот (пурины, пиримидины и их нуклеозиды). В техническом плане сэлвидж-синтез основан на применении специально подобранного микроорганизма, осуществляющего рибозилирование и фосфорилирование пуриновых и пиримидиновых оснований, их нук-леозидов или синтетических аналогов низкомолекулярных компонентов нуклеиновых кислот.

Автор с сотрудниками в течение длительного времени (с 1970 г.) разрабатывает теоретические и прикладные аспекты сэлвидж-синтеза нуклеозидфосфатов и нуклеотидных

коферментов. Ими открыта ранее не известная реакция синтеза ADP и впервые исследован кофермент пирофосфат: ADP-фосфотрансфе-раза, описан новый механизм регуляции. Впервые в России автором получены штаммы -продуценты нуклеотидов, разработана технология получения препаратов ATP, NAD, GTP и других нуклеотидов [2]. Технологии получения нуклеотидов внедрены на Олайнском заводе химреактивов (1973-1981 гг.).

Данная статья посвящена исследованию гликолиза в качестве возможного источника при сэлвидж синтезе нуклеозидфосфатов у штаммов продуцентов из крупы коринеформ-ных бактерий.

Материалы и методы

Исследовали микроорганизмы из группы коринеформных бактерий, осуществляющих сэлвидж-синтез нуклеотидов: Corynebacterium flavum ВСТИ 301 (Цыренов В. Ж., и др. Авторское свидетельство 726161, СССР, 1980) и музейный штамм Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 [1], который в настоящее время известен как Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872. Исследование механизма биосинтеза нуклеотидов у упомянутых выше микроорганизмов было проведено на примере образования ATP из аденина и GTP из гуанина с использованием бесклеточного экстракта.

Проведение ферментаций описано ранее [4]. Для получения бесклеточного экстракта использовали двухсуточную культуру. Для

изучения энзиматических реакций, участвующих в биосинтезе АТР, GTP из аденина и гуанина использовались 6 составов реакционной смеси. Смесь № 1: ФРПФ 0,5 мкМ, аденин

0,6 мкМ, С14-аденин (гуанин) 12^105 имп/мин, MgCl2 5 мкМ, трис-НС1-буфер (рН 8,0) 10 мкМ и экстракт энзимов 0,5 мг по белку в конечном объеме 1 мл. При испытании рибозо-5-фосфата (Р-5-Ф) в качестве рибозильного компонента ATP использовали: смесь № 2: Р-5-Ф I мкМ, аденин 0,6 мкМ, С14-аденин 12^ 105 имп/мин, ATP 0,5 мкМ, MgCl2 5 мкМ, трис-буфер (pH 8,0) 10 мкМ и экстракт 1,2 мг белку в конечном объеме 1 мл; смесь № 3 - смесь № 2 без Р-5-Ф; смесь № 4 - смесь № 2 без ATP и смесь № 5: смесь № 2 без аденина. Для исследования фос-форилирования AMP до ATP составляли смесь № 6: Р-5-Ф 0-15 мкМ, MgCl2 5 мкМ, трис-HCl -буфер (рН 8,0) 10 мкМ, AMA - 0,3 мкМ, C14-AMP 12,5 • 105 имп/мин и экстракт 1,2 мг по белку в конечном объеме 1 мл. Инкубацию проводили при 30 оС, без встряхивания. Реакция останавливалась добавлением 0,1 мл 60%-ной трихлоруксусной кислоты.

Образующиеся в реакционной смеси нуклеотиды определяли с помощью бумажной хроматографии. Радиоактивность измеряли жидкостным сцинтилляционным счетчиком SL-30 («Intertecnique»).

Удельную активность бесклеточного экстракта выражали как нМ нуклеотида (АМP, GMP, ADP, GDP, или ATP, GTP) в расчете на 1 мг белка. Количество нуклеотидов в нМ рассчитывали, исходя из распределения в них радиоактивности.

Результаты и обсуждение

Ранее было показано [3], что в клетке и в культуральной жидкости штаммов продуцентов накапливается большое количество до 4 мг/мл пентозофосфатов (Р-5-Ф, ФРПФ). Также было показано, что ФРПФ используется в аденинфосфорибозилтрансферазной реакции с образованием AMP. При этом была использована реакционная смесь № 1, состоящая из С14-аденина, ФРПФ, MgCl2 буфера и экстракта энзимов.

Было сделано наблюдение о том, что если в реакционной смеси № 1 заменить ФРПФ на Р-5-Ф и ATP (создавая, таким образом, реакционную смесь № 2), то в этих измененных условиях также интенсивно происходило образование AMP.

Исходя из этого наблюдения, мы попытались определить роль отдельных компонентов

реакционной смеси № 2, ставили опыт с бес-клеточным экстрактом, в вариантах которого последовательно исключали из состава реакционной смеси тот или иной компонент.

Как видно из данных таблицы 1 в реакционной смеси № 3 (которая в отличие от смеси № 2 не содержала Р-5-Ф) обнаруживаются следовые количества различных нуклеозидфосфа-тов. Это, по-видимому, объясняется дефицитом или отсутствием ФРПФ.

В реакционной смеси № 4 (которая в отличие от смеси № 2 не содержала ATP) наблюдался синтез нуклеозидфосфатов, в том числе значительных количеств ATP.

Это свидетельствует о том, что в смеси № 4, содержащей бесклеточный экстракт, происходят определенные процессы, которые обусловливают образование из Р-5-Ф ATP, необходимый для синтеза ФРПФ в ФРПФ-синтетазной реакции. Таким образом, ATP не является необходимым компонентом реакционной смеси, когда используется бесклеточный экстракт.

Аналогичный результат был получен при ферментации гуаниновых нуклеозидфосфатов с помощью Corynebacterium flavum.

Для среды № 4 были определены оптимальные концентрации субстратов: для Р-5-Ф-357 мкM и для аденина - 700 мкM. Оптимальное значение рН трис-HCl -буфера для образования ATP в этой смеси вставляла около 8,0.

Если в смеси № 1 (содержащей ФРПФ) происходит образование только ATP то в среде №4 (содержащей Р-5-Ф) - синтез нуклеозидфосфатов, включая ATP. Такой результат (который в определенной мере был неожиданным, поскольку Р-5-Ф является более простым соединением, чем ФРПФ) наводил на мысль, что Р-5-Ф является не только источником рибо-зильной части нуклеотидов, но и субстратом процессов, обеспечивающих фосфорилирова-ние нуклеозидмонофосфата до нуклеозидтри-фосфата (например, AMP до ATP).

Данное предположение было проверено с использованием реакционной смеси № 6, состоящей из Р-5-Ф, 04-AMP или d4-GMP, трис-HCl буфера, MgCl2 и бесклеточного экстракта. В первую очередь, было изучено влияние различных концентраций, Р-5-Ф на образование ATP у коринеформных бактерий (табл. 2.).

Обнаружилась четкая зависимость степени фосфорилирования от концентрации Р-5-Ф. Наблюдался синтез нуклеозидди- и трифосфа-тов в контрольных образцах, куда не добавляли Р-5-Ф. Это, очевидно, связано с наличием в

бесклеточном экстракте доноров макроэргиче-ских фосфатных групп, полифосфатов.

Зависимость фосфорилирования нуклео-зидмонофосфата от концентрации субстрата указывает на возможную роль гликолиза. Известно, что фосфоглюконатный путь, одним из промежуточных продуктов второго является Р-5-Ф, на одном из этапов может перейти в гли-колитический, т. е. Р-5-Ф может стать субстратом гликолиза, энергетический эффект которого в данном случае обеспечивает фосфорили-рование нуклеозидмонофосфата. Для проверки этого предположения был поставлен опыт с реакционной смесью № 4, в которой вместо Р-5-Ф была взята глюкоза (табл. 3).

Как видно из данных таблицы 3, наблюдалось заметное образование нуклеозидфосфатов в случае замены Р-5-Ф глюкозой. Наиболее высокий уровень синтеза ATP и GTP обнаруживается при концентрации глюкозы 6 мкМ.

Образование нуклеотидов при добавлении глюкозы, свидетельствует об участии гликолиза в фосфорилировании монофосфатов.

Проведенные нами опыты показали, что в реакционной смеси № 4 образование ATP происходит через AMP. Количество AMP также возрастало в присутствии NaF, являющегося ингибитором гликолиза. Ингибирующий эффект NaF на фосфорилирование AMP до ATP усиливался в присутствии фосфатов (табл. 4.)

Таблица 1

Испытание Р-5-Ф в качестве источника рибозильной части ATP

Реакционная смесь Основные компоненты реакционной смеси Удельная активность экстракта, нM/мг

С^-ATP ^-ADP с14-амр

№ 2 Р-5-Ф, ATP. 28,6 (±2,9) 67,4(±3,8) 108 (±9,9)

№ 3 Смесь № 2 без Р-5-Ф Следы Следы Следы

№ 4 Смесь № 2 без ATP 135 (±) 76,9 (±6,1) 24,3 (±1,8)

№ 5 Смесь № 2 без аденина Следы Следы Следы

Таблица 2

Влияние концентрации Р-5-Ф на образование пуриновых нуклеозидди- и три-фосфатов

у Corynebacterium flavum ВСТИ 301 и Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872*

№ варианта Р-5-Ф мкM Удельная активность экстракта, нШмг, 30 мин

С14-АЭР ^-GDP С^-ATP С^-GTP

і 0 25,2 20,8 40,7 21,6

2 5 75,2 36,9 62,0 30,9

3 10 97,8 45,6 74,0 40,6

4 15 72,6 32,4 61,2 31,7

*Использована реакционная смесь № б состава: Р-5-Ф, концентрация указана в таблице, MgCl2 5 мкM, трис-HCl -буфер (рН 8,0) 10 мй^ AMP - 0,3 мй^ С14-АМР 12,5-105 имп/мин и экстракт 1,2 мг по белку в конечном объеме і мл. Радиоактивность на единицу веса продукта (ADP, ATP) составляла 4,18-103 имп/мин на і нM. В случае синтеза GTP использовался GMP, С14^МР.

Таблица 3

Влияние концентрации глюкозы на образование нуклеозидфосфатов пуринового ряда бесклеточным экстрактом C. flavum ВСТИ 301

№ варианта Глюкоза, мкM Удельная активность экстракта, kM/мг, 30 мин

AMP GMP ADP GDP ATP GTP

і 0 1,2 1,3 3,1 2,8 14,6 12,1

2 2 3,2 1,7 5,2 4,1 26,0 14,2

3 4 7, і 3,7 10,1 6,4 44,0 26,4

4 6 8,2 4,5 11,0 5,9 50,2 28,7

5 8 7,4 3,4 9,8 4,3 42,1 22,6

6 10 2, і 1,5 4,8 4,2 26,5 14,8

Таблица 4

Влияние фторида натрия и фосфатов на образование нуклеозидфосфатов бесклеточным

экстрактом С. Аауыт ВСТИ 301

Буфер NaF, 100 мкМ Удельная активность экстракта, нМ/мг белка, 30 мин

c14-atp c14-adp c14-amp

Трис-HCl буфер, pH 8,0 - 96 102 29

Трис-HCl буфер, pH 8,0 + 21,0 36,1 42,8

Трис-HCl буфер, pH 9,0 + 30,2 61,2 71,5

Na-фосфатный буфер, 10 мкМ, pH 7,4 - 22,7 58,6 174,1

Na-фосфатный буфер, 10 мкМ, pH 7,4 + 9,1 25,7 98,7

Заключение

В работе показана взаимосвязь энергетического обеспечения сэлвидж-синтеза нуклеозидфосфатов у коринеформных бактерий с процессом гликолиза.

Литература

1. Лукин Н. С. Влияние компонентов среды на метаболизм культуры Вгеу&айегшт ammoniagenes -продуцента 5-инозиновой кислоты / Н. С. Лукин, Л. А. Казаринова Л. И. Ерохина // Прикладная био-хим. и микробиол. - 1978. - Т. 14. - С. 565-572.

2. Цыренов В. Ж. Микробиологический синтез нуклеозидфосфатов / В. Ж. Цыренов - М. : Наука, 1990. - 200 с.

3. Санданов Ч. М. Изучение метаболического

механизма синтеза адениновых нуклеотидов из экзогенного аденина у коринеморфных бактерий / Ч. М. Санданов, И. В. Ерошина, В. Ж. Цыренов // Микробиология. - 1981. - Т. 50, Вып.6. -

С. 1053-1056.

4. Tsirenov V. Zh. Concerning peculiarities of NAD byosinthesis regulation by producer strains of microorganisms / V. Zh. Tsirenov [et al.] // Biotechnology and industry Editor G. E. Saikov. - Nova Science Publishers Inc., 2004. - Р. 55-74.

The role of glycolis at the microbiological synthesis of nucleoside phosphates from predecessors at corinebacteria

V. Zh. Tsirenov, I. O. Pinuev, A. A. Sandanov East-Siberian State Technological University, Ulan-Ude

Abstract. The glycolis has been studied as an energy source for microbiological synthesis of nucleoside phosphates from predecessors at Corinebacteria. In experiences with uncellular extracts of Corynebacterium flavum - ВСТИ 301 and Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 by means of a method labeled atoms has been shown that, что glycolis is main energy source for synthesis of nucleosidedi- and triphosphates (ADP, ATP, GDP, GTP) from nucleosidmonophosphates (AMP, GMP).

Key words: Glycolis, nucleoside phosphates, phosphorylation, phosphoribosl pirophosphate, ribose-5-phosphate, biosynthesis ATP AMP ADP, microbiological synthesis.

Цыренов Владимир Жигжитович Восточно-Сибирский государственный технологический университет,

Институт пищевой инженерии и биотехнологии

670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40-а

доктор биологических наук, профессор

зав. кафедрой биотехнологии

тел. (301 2) 41-71-46, факс (301 2) 43-14-15

Е-таіІ: [email protected]

Tsirenov Vladimir Zhigzhitovitch East-Siberian State Technological University 670013, Ulan-Ude, 40-a, Klyuchevskaya St.

D. Sc. in Biology, prof, Head of Department of Biotechnology

phone: (301 2) 41-71-46, fax: (301 2) 43-14-15 Е-mail: [email protected]

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Пинуев Иван Очирович Восточно-Сибирский государственный технологический университет кандидат биологических наук, доцент кафедры биотехнологии 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40-а тел. (301 2) 41-71-46, факс (301 2) 43-14-15

Санданов Александр Андреевич Восточно-Сибирский государственный технологический университет аспирант

670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40-а тел. (301 2) 41-71-46, факс (301 2) 43-14-15

Pinuev Ivan Ochirovich

East-Siberian State Technological University

670013, Ulan-Ude, 40-a, Klyuchevskaya St.

Ph. D. in Biology, ass. prof

phone: (301 2) 41-71-46, fax: (301 2) 43-14-15

Sandanov Aleksandr Andreevich The East-Siberian State Technological University 670013, Ulan-Ude, 40-a, Klyuchevskaya St. doctoral student

phone: (301 2) 41-71-46, fax: (301 2) 43-14-15

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.