Научная статья на тему 'РОЛЬ ИНСЕРЦИОННОГО α-СПИРАЛИЗОВАННОГО ДОМЕНА АТР-ЗАВИСИМОЙ LON-ПРОТЕАЗЫ ИЗ E. COLI В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ФЕРМЕНТА'

РОЛЬ ИНСЕРЦИОННОГО α-СПИРАЛИЗОВАННОГО ДОМЕНА АТР-ЗАВИСИМОЙ LON-ПРОТЕАЗЫ ИЗ E. COLI В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ФЕРМЕНТА Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

CC BY
140
20
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Acta Naturae (русскоязычная версия)
WOS
Scopus
ВАК
RSCI
PubMed
Область наук
Ключевые слова
ААА+-БЕЛКИ / АТР-ЗАВИСИМЫЙ ПРОТЕОЛИЗ / LONA-ПРОТЕАЗЫ / ИНСЕРЦИОННЫЙ α-СПИРАЛИЗОВАННЫЙ ДОМЕН / СВЯЗЫВАНИЕ ДНК

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Куджаев А. М., Андрианова А. Г., Дубовцева Е. С., Серова О. В., Ротанова Т. В.

Мультидоменная АТР-зависимая протеаза Lon из Escheriсhia coli (Ес-Lon) один из ключевых ферментов системы контроля качества клеточного протеома. C целью изучения роли инсерционного HI(CC)-домена Ес-Lon получен и охарактеризован рекомбинантный фермент с делецией HI(CC)-домена (Lon-dHI(CC)). Проведено сравнительное исследование АТР-азной, протеолитической и пептидазной активности интактной Lon-протеазы и Lon-dHI(CC), изучена возможность автолиза обеих форм фермента и их способность к связыванию ДНК. Показано, что HI(CC)-домен необходим для формирования функционально активной структуры Ec-Lon-протеазы и реализации белок-белковых взаимодействий.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Куджаев А. М., Андрианова А. Г., Дубовцева Е. С., Серова О. В., Ротанова Т. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «РОЛЬ ИНСЕРЦИОННОГО α-СПИРАЛИЗОВАННОГО ДОМЕНА АТР-ЗАВИСИМОЙ LON-ПРОТЕАЗЫ ИЗ E. COLI В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ФЕРМЕНТА»

УДК 577.152.342*1'134

Роль инсерционного а-спирализованного домена АТР-зависимой Lon-протеазы из E. coli в функционировании фермента

А. М. Куджаев, А. Г. Андрианова, Е. С. Дубовцева, О. В. Серова, Т. В. Ротанова*

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

*E-mail: [email protected]

Поступила в редакцию: 05.07.2016

Принята к печати 20.01.2017

РЕФЕРАТ Мультидоменная АТР-зависимая протеаза Lon из Escherichia coli (Ес-Lon) - один из ключевых ферментов системы контроля качества клеточного протеома. C целью изучения роли инсерционного Н1(СС)-домена Ес-Lon получен и охарактеризован рекомбинантный фермент с делецией Н1(СС)-домена (Lon-dHI(CC)). Проведено сравнительное исследование АТР-азной, протеолитической и пептидазной активности интактной Lon-протеазы и Lon-dHI(CC), изучена возможность автолиза обеих форм фермента и их способность к связыванию ДНК. Показано, что Н1(СС)-домен необходим для формирования функционально активной структуры Ec-Lon-протеазы и реализации белок-белковых взаимодействий. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ААА+-белки, АТР-зависимый протеолиз, LonA-протеазы, инсерционный а-спирализованный домен, связывание ДНК.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ AMPPNP - аденозин-5'-(Р,у-имидо)трифосфат; DTDP - 4,4'-дитиодипиридин; Glt -глутарил; Nu - нуклеотид; РерТВЕ - Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl; Suc - сукцинил.

ВВЕДЕНИЕ

АТР-зависимая Lon-протеаза Escherichia coli (Ес-Lon [КФ 3.4.21.53]; MEROPS: клан SJ, семейство S16, ID S16.001) - представитель семейства Lon-протеаз, которое играет ключевую роль в системе контроля качества клеточного протеома, функционирующей во всех доменах жизни [1-4]. Семейство Lon состоит из двух подсемейств - LonA, включающего бактериальные и эукариотические ферменты, и LonB, объединяющего ферменты архей. Протеазы подсемейств А и В различаются доменной организацией субъединиц, а также окружением каталитических остатков протеолитического центра [5]. Ес-Lon относится к подсемейству А, деградирует аномальные и дефектные полипептиды, а также ряд регулятор-ных клеточных белков по процессивному механизму в условиях сопряжения протеолиза с гидролизом АТР [4-7]. Отличительной характеристикой Ес-Lon, как и других LonА-протеаз, является их способность к связыванию ДНК [8-10].

Субъединица Ес-Lon (784 аминокислотных остатка) состоит из пяти доменов: N-HI(CC)-NB-H-P (рис. 1А), где нуклеотидсвязывающий (NB) и а-спирализованный (Н) домены формируют АТР-

азный модуль, относящийся к суперсемейству ААА+-белков (АТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями) [11, 12], С-концевой Р-домен представляет серин-лизиновую пептидги-дролазу, а ^концевой и следующий за ним «инсерционный» а-спирализованный домены образуют некаталитическую область ^-Ш(СС)), включающую фрагмент последовательности со специфической coiled-coil (СС) конформацией [13, 14]. Определены кристаллические структуры индивидуальных доменов (за исключением Ш(СС)-домена) Ес^оп и некоторых других LonА-протеаз. Пространственные структуры полноразмерных ферментов подсемейства LonА до сих пор не известны.

Двухдоменная организация ^концевой области является уникальной характеристикой Ес^оп и всего пула LonA-протеаз. От других ААА+-белков системы контроля качества, представленных совокупностью АТР-зависимых протеаз (С1рАР, С1рХР, FtsH, HslUV) и шаперонов-дезагрегаз (С1рВ, Шр104), LonA-протеазы отличает наличие вставочного Н1(СС)-домена. Ранее нами было показано, что Н1(СС)-домен Ес^оп проявляет выраженное сходство как с Н-доменом собственного

л

124

304

A В Ser679 Lys722

S1 R-f S2

/ V V V \

N HI CC HI NB 1 > H

HI(CC)

N-Концевая область

ААА+-модуль

cN:>

<NB Hll>

H

Рис. 1. Доменная организация LonA-протеазы Е. coli (А) и ее делеционной формы Lon-dHI(CC) (Б). Обозначения доменов: N - N-концевой, Н1(СС) - инсерционный а-спирализованный с сoiled-coil(СС)-областью, NB - нуклеотидсвязывающий, H - а-спирализованный, Р - протеолитический. Компоненты АТР-азного центра: А и B - мотивы Уолкера, S1 и S2 - сенсорные остатки; R-f - остаток «аргининовый палец»; компоненты протео-литического центра: Ser679 и Lys722 - каталитические остатки

ААА+-модуля, так и с а-спирализованным доменом (Н1(М)) первого из двух ААА+-модулей ClpB-шаперонов [13, 14]. При этом участие Ш(СС)-домена в функционировании Ес-Lon-протеазы, во взаимодействии с нуклеиновыми кислотами и/или в структурной организации фермента до настоящего времени не охарактеризовано.

С целью изучения роли инсерционного HI(CC)-домена в проявлении функциональных свойств Ес-Lon нами проведено сравнительное исследование энзиматических характеристик и способности к связыванию ДНК как интактного фермента (рис. 1А), так и его делеционной формы Lon-dHI(CC), утратившей Ш^^-домен (рис. 1Б).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

В работе использовали коммерческие реактивы фирм Sigma, Bio-Rad, Thermo Scientific (США), Fluka (Швейцария), Boehringer Mannheim (Германия), Pharmacia (Швеция), Difco (Англия), Panreac (Испания) и «Реахим» (Россия).

Получение Ec-Lon (Lon-H6) и ее делеционной формы Lon-dHI(CC)

Рекомбинантную форму Ec-Lon, содержащую гек-сагистидиновый фрагмент (в составе октапептида LEHHHHHH) на С-конце белка (Lon-H6), получали по ранее описанной методике [15].

Делеционную форму Lon-dHI(CC) получали на основе Lon-H-протеазы. Методом мегапрай-

мера сконструировали праймеры Lon_d_124-304, Lon_HindIII и Lon_BamHI_rev (соответственно: 5'-TTTTTTGACCTTGCTGCGCGCATCAATG-GTCGGCGACTCCAG-3', 5'-CGCAGAAAGA-AGCTTCAACGG-3' и 5'-GTTCTGCTCTGGA-TCCAGCAC-3'). Амплификацию фрагмента гена проводили в два этапа, используя в качестве матрицы плазмидную ДНК pET28-lon-H6. На первом этапе с помощью праймеров Lon_d_124-304 и Lon_ HindIII получили ПЦР-фрагмент, который использовали в качестве праймера на втором этапе вместе с праймером Lon_BamHI_rev. Полученный фрагмент ДНК длиной около 625 п.н. клонировали в вектор pET28_lon по уникальным сайтам рестрикции HindIII и BamHI.

Секвенирование клонированных ДНК и синтез праймеров осуществлены компанией «ЗАО ЕВРОГЕН» (www.evrogen.ru). Процедуры рестрикции и лигирования проводили согласно протоколам производителей соответствующих ферментов.

Выделение и очистку Lon-H6 и Lon-dHI(CC) проводили в две стадии методами №2+-хелатной аффинной хроматографии с использованием колонок HisTrap FF (тандем 2 х 5 мл, GE Healthcare, США) и анио-нообменной хроматографии на колонке HiTrap™ Q FF (5 мл, GE Healthcare) согласно ранее описанной методике [15].

Концентрации белков определяли по методу Брэдфорд [16].

Гомогенность белков в препаратах тестировали электрофоретически [17] с использованием коммер-

N

Б

ческого набора маркеров (М, кДа): Р-галактозидаза (116.0), бычий сывороточный альбумин (66.2), оваль-бумин (45.0), лактатдегидрогеназа (35.0), рестриктаза Bsp98I (25.0), Р-лактальбумин (18.4) и лизоцим (14.4).

Очистка ДНК

ДНК очищали согласно протоколу, представленному в руководстве [18].

Определение ферментативных свойств Lon-H6-протеазы и делеционной формы Lon-dHI(CC)

АТР-азную активность тестировали по накоплению во времени неорганического фосфата в реакции гидролиза АТР в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 8.1, содержащем 150 мМ NaCl, 5 мМ ATP, 20 мМ MgCl2 и 1 мкМ фермент, при 37оС [19]. В контрольном опыте фермент заменяли буфером. Начальные скорости реакций определяли по величине оптического поглощения смеси из 200 мкл реакционной среды и 600 мкл реагента (100 мМ Zn(AcO)2, 15 мМ (NH4)6Mo7O24, 1% SDS, pH 4.5-5.0) при длине волны 350 нм (е350 = 7 8 0 0 М-1 см-1).

Тиоэстеразная активность. За гидролизом тио-бензилового эфира N-замещенного трипептида Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (PepTBE) следили спек-трофотометрически при длине волны 324 нм по величине оптического поглощения 4-тиопиридона (е324 = 16 5 0 0 М-1 см-1), образующегося в результате взаимодействия продукта гидролиза (бензилтио-лата, BzlS-) c 4,4'-дитиодипиридином (DTDP) [20]. Гидролиз РерТВЕ проводили при 37оС в 50 мМ Трис-HCl-буфере, рН 8.1, содержащем 150 мМ NaCl, 10% DMSO, 0.2 мМ DTDP, 0.1 мМ PepTBE и 0.2 мкМ фермент. При изучении влияния эффекторов в смесь добавляли нуклеотид до 2.5 мМ и MgCl2 до 20 мМ.

Протеолитическую активность ферментов тестировали электрофоретически [17]. Реакцию проводили при температуре 37оС в 50 мМ Трис-HCl-буфере, pH 8.1, содержащем 150 мМ NaCl, 20 мкМ Р-казеин и 2-6 мкМ фермент, в отсутствие или в присутствии 5 мМ Nu и 20 мМ MgCl2. Аликвоту реакционной или контрольной смеси (20 мкл) смешивали с 7 мкл лизирующего буфера (0.2 М Трис-HCl, pH 8.9, 4% SDS, 20% глицерин, 0.5 мМ EDTA, 0.8% бромфеноловый синий, 3% Р-меркаптоэтанол), кипятили в течение 10 мин, наносили на 12% полиа-криламидный гель (ПААГ) для электрофореза.

Автолитическую активность ферментов тестировали электрофоретически [17] в условиях, аналогичных условиям определения протеолитической активности, но в отсутствие Р-казеина.

Тестирование комплексов Lon-Hg-протеазы и Lon-dHI(CC) с плазмидной ДНК

За образованием комплексов фермент-ДНК следили по торможению ДНК в агарозном геле (метод GMSA) [21]. 20-25 мкг Lon-H6 или Lon-dHI(CC) инкубировали в течение 30 мин при 25°С с 500 нг плазмидной ДНК (pET28a) в 25 мкл 20 мМ Трис-НС1-буфера, рН 7.5, содержащего 60 мМ NaCl. Комплексы белок-ДНК анализировали гель-электрофорезом в стандартном 1.0% агарозном геле. Полосы ДНК визуализировали окрашиванием бромистым этидием.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Использованная в работе рекомбинантная Ес-Lon-протеаза, содержащая дополнительный С-концевой октапептид, включающий гексагистидиновый фрагмент (Lon-H6), была получена и охарактеризована ранее [15]. На основе Lon-H6 получена рекомбинант-ная делеционная форма Lon-dHI(CC) без инсер-ционного Н1(СС)-домена (остатки Glu124-Asn304, рис. 1Б). В препаративных количествах Lon-H6 (М 88.5 кДа) и ее делеционную форму Lon-dHI(CC) (М 67.5 кДа) выделяли с использованием аффинной хроматографии на Ni-сефарозе и анионооб-менной хроматографии на Q-сефарозе. Проведено сравнительное изучение ферментативной активности интактной Lon-Н^протеазы и ее делецион-ной формы. При этом охарактеризовано три типа активности - АТР-азная, протеолитическая (субстрат - Р-казеин) и пептидазная (субстрат - Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl, РерТВЕ), а также изучена возможность автолиза препаратов ферментов. Кроме того, методом фенольной экстракции проверено присутствие нуклеиновой кислоты в различных препаратах белка.

АТР-азная активность делеционной формы Ес^оп-протеазы

Для тестирования как АТР-азной, так и других видов активности Lon-Н^протеазы и ее делеционной формы в качестве стандартных условий были выбраны 37°С и 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.1, содержащий 150 мМ NaCl.

Известно, что нативная wt-E^Lon проявляет максимальный уровень АТР-азной активности при равных концентрациях ATP и Mg2+, а избыток ионов магния оказывает ингибирующее влияние на гидролиз АТР, которое нивелируется связыванием белкового субстрата [22].

Эти же тенденции характерны для интактной Lon-Н6-протеазы (рис. 2А): эффективность гидролиза АТР ферментом в условиях, близких к физиологическим (соотношение концентраций Nu : Mg2+ = 1 : 4), существенно ниже, чем при эквимолярных концен-

Л

120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Lon-H

Б

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Lon-dHI(CC)

- казеин + казеин

Рис. 2. АТР-азная активность интактной Lon-Н6-протеазы (А) и ее делеционной формы Lon-dHI(CC) (Б) в отсутствие (черные столбцы) и в присутствии (красные столбцы) белкового субстрата - Р-казеина. Условия эксперимента: 50 мМ Трис-НС1-буфер, pH 8.1; 0.15 М NaCl; 37°С; концентрации: АТР - 5 мМ; MgCl2 - 20 (1, 2) или 5 мМ (3, 4); Р-казеин -0 (1, 3) или 0.5 мг/мл (2, 4); фермент -0.5-1 мкМ

2

3

4

2

3

4

трациях Nu и ионов Mg2+. Добавление белкового субстрата (ß-казеин) в обоих случаях приводит к значительному возрастанию АТР-азной активности.

С утратой Н1(СС)-домена Lon-протеаза почти полностью теряет способность к гидролизу АТР: АТР-азная активность Lon-dHI(CC) снижена по сравнению с активностью интактной Lon-Н^протеазы более чем в 10 раз и практически не зависит ни от соотношения концентраций нуклеотида и ионов Mg2+, ни от добавления белка-субстрата (рис. 2Б).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что инсерционный а-спирализованный Н1(СС)-домен необходим для формирования АТР-азного центра Ес-Lon-протеазы и его корректного функционирования.

Активность пептидазного центра делеционной формы Ес-Lon-протеазы

Аналогично Lon-Н^протеазе Lon-dHI(CC) способна к гидролизу модельного пептидного субстрата PepTBE, однако базовая пептидазная активность делеционной формы составляет около 30% от активности интактного фермента (таблица). Из приведенных в таблице данных следует, что только ионы Mg2+ активируют пептидазные центры и Lon-H6, и Lon-dHI(CC). Влияние нуклеотидных эффекторов на интактный и модифицированный ферменты кардинально различается. Свободные нуклеотиды (кроме ADP) и комплексы Nu-Mg в разной степени (2-11 раз) активируют Lon-Н^протеазу, а ADP ин-гибирует ее, тогда как ни один из нуклеотидов прак-

Влияние эффекторов на активность пептидгидролазных центров Lon-H6 и Lon-dHI(CC)

Эффектор Lon-H6 Lon-dHI(CC)

v n v n

Без эффектора 5.88 1 1.64 1

Mg 33.1 5.62 5.19 3.16

АТР 47.1 8.01 1.33 0.81

ADP 0.49 0.08 1.79 1.09

АМРР№* 14.2 2.41 1.82 1.11

ATP-Mg 63.5 10.8 4.62 2.82

ADP-Mg 10.1 1.73 4.89 2.98

АМРРОТ-Mg 58.0 9.86 5.6 3.41

Примечание. Приведены значения удельной скорости гидролиза субстрата PepTBE (v, ([S], мкМ)/([Е], мкМ)'мин) и n - отношение скоростей гидролиза субстрата в присутствии и в отсутствие эффектора (v3+/vQ), где n < 1 соответствует ингибированию (показано курсивом), а n > 1 - активации гидролиза (показано жирным шрифтом). Ошибка не превышала 10%. Условия эксперимента: 50 мМ Трис-НС1-буфер, pH 8.1; 0.15 М NaCl; 10% DMSO; 0.1 мМ PepTBE; 0.2 мМ DTDP; 2.5 мМ Nu; 20 мМ MgCl2; 0.2 мкМ фермент; 37°С.

*Негидролизуемый аналог АТР, аденозин-5'-(Р,у-имидо)трифосфат.

Фермент

Lon-H

Lon-dHI(CC)

Эффекторы

без Nu ATP ADP AMPPNP

- Mg - Mg - Mg - Mg

Маркеры

М

кДа

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

116

66

35

25

66 45

35 25

Рис. 3. Гидролиз Р-казеина Lon-H6-протеазой и ее де-леционной формой Lon-dHI(CC) в отсутствие и в присутствии эффекторов (электрофорез в 12% ПААГ). Условия эксперимента: 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.1; 0.15 М №С1; 37°С; время реакции 2 ч; концентрации: № -5 мМ; МдС12 - 20 мМ; Р-казеин - 0.5 мг/мл; Lon-H6 - 2.5 мкМ; Lon-dHI(CC) - 6 мкМ.

1 - фермент (контроль),

2 - Р-казеин (контроль), «—» - в отсутствие ионов Мд2+, Мд - в присутствии ионов Мд2+,

М - маркеры

/

2

тически не влияет на гидролиз пептида Lon-dHI(CC)-протеазой, а комплексы Nu-Mg оказывают близкое по величине, но относительно невысокое активирующее воздействие на пептидазный центр фермента, сопоставимое с влиянием ионов Mg2+. Из этих данных следует, что форма Lon-dHI(CC) не способна связывать свободные нуклеотиды и слабо взаимодействует с их комплексами с ионами магния. Наиболее действенным эффектором, влияющим на активность пептидазного центра, следует считать ионы магния.

Таким образом, удаление Н1(СС)-домена приводит к снижению активности пептидазного центра Ес-Lon-протеазы и к утрате регулирующего влияния АТР-азного центра на пептидазный, которое в ин-тактном ферменте обусловлено природой связанного нуклеотида.

Протеолитическая и автолитическая активности делеционной формы Ес^оп-протеазы

Протеолитическую активность Lon-H6 и ее делеционной формы Lon-dHI(CC) тестировали по гидролизу модельного белкового субстрата - Р-казеина -в отсутствие и при наличии ионов Mg2+, свободных нуклеотидов и их комплексов. Эффективность гидролиза белка-мишени и процесс накопления продуктов деградации детектировали с помощью гель-электрофореза.

Интактная Lon-Н^протеаза способна гидроли-зовать Р-казеин в двух случаях: по процессивному механизму (без образования крупных промежуточных фрагментов) в условиях сопряжения протеолиза с гидролизом АТР или по непроцессивному механизму в присутствии комплекса негидролизуемого аналога АТР с магнием (рис. 3).

Удаление Н1(СС)-домена приводит к полной утрате делеционной формой протеолитической активности по Р-казеину, что свидетельствует о важности этого домена для связывания и гидролиза белкового субстрата (рис. 3). При этом на электрофореграмме инкубированной реакционной смеси обнаруживаются полосы, соответствующие полипептидам с молекулярными массами от 40 до 60 кДа, что указывает на возможность самодеградации Lon-dHI(CC) в условиях, используемых при определении гидролиза белка-мишени.

Выявление у Lon-dHI(CC) автолитической активности, сопровождающей потенциальный гидролиз белкового субстрата, потребовало изучения самого процесса автолиза. Показано, что интактная Lon-Н6-протеаза устойчива к самодеградации в присутствии любых нуклеотидных эффекторов (рис. 4). При этом в процессе длительной инкубации (24 ч и более) обнаруживается слабый автолиз Lon-H6 в отсутствие эффекторов или при наличии ионов

Фермент

Lon-H

Эффекторы

без Nu ATP ADP AMPPNP

- Mg - Mg - Mg - Mg

Маркеры

М

Lon-dHI(CC)

fer-Ä

кДа

116

■66

66

45 ■35

■25

Рис. 4. Автолиз Lon-H6-протеазы и ее деле-ционной формы Lon-dHI(CC) в отсутствие и в присутствии эффекторов. Условия эксперимента и обозначения как на рис. 3 со следующими изменениями: Lon-H6 - 3.4 мкМ, время реакции 24 ч. К - исходный фермент (контроль, время реакции 0 ч)

K

магния (рис. 4), что согласуется с ранее полученными результатами [23].

В отличие от Lon-H6, делеционная форма Lon-dHI(CC) нестабильна, она подвергается автолизу как в отсутствие, так и в присутствии нуклеотидных эффекторов, причем, процесс автолиза Lon-dHI(CC) наиболее выражен при наличии ионов Mg (рис. 4).

Таким образом, утрата Н1(СС)-домена приводит к полной потере способности Lon-H6-протеазы к гидролизу белкового субстрата и к дестабилизации структуры фермента.

Связывание нуклеиновой кислоты Lon-H6-протеазой и делеционной формой Lon-dHI(CC)

Важная характеристика Ес^оп - способность к связыванию ДНК [8-10], однако сайт взаимодействия фермента с нуклеиновой кислотой до настоящего времени не локализован. Поскольку другие АТР-зависимые протеазы системы контроля качества клеточных белков не обладают ДНК-связывающими свойствами и не содержат характерного для LonA-протеаз инсерционного Н1(СС)-домена, можно ожидать, что именно Н1(СС)-домен вовлечен в связывание нуклеиновой кислоты. В связи с этим проверили содержание нуклеиновой кислоты в препаратах Lon-Н6-протеазы и ее делеционной формы, полученных в настоящей работе.

Содержание ДНК в препаратах обоих ферментов, определенное по соотношению оптического поглощения (А260/А280) в растворах Lon-H6 и Lon-dHI(CC) (1.09

и 1.06 соответственно), не превышало 5%. Связанную с ферментами нуклеиновую кислоту выделяли из препаратов методом фенол-хлороформной экстракции. Обработка экстрактов бензоназой (неспецифическая нуклеаза, Sigma) привела к исчерпывающему гидролизу мишеней, что подтверждает их принадлежность к нуклеиновым кислотам. В то же время оба экстракта оказались устойчивыми к обработке РНКазой А. Эти результаты свидетельствуют о том, что и полноразмерная, и делеционная формы Ес-Lon выделяются из клеток E. coli в виде комплексов с ДНК.

Фенол-хлороформные экстракты анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (рис. 5). Установлено, что препараты и интактной Lon-Hg-протеазы, и ее делеционной формы Lon-dHI(CC) содержат значительное количество связанной ДНК в виде фрагментов размером около 150 п.н.

Кроме того, оказалось, что обе формы Lon-протеазы способны к связыванию дополнительного количества нуклеиновой кислоты. Показано, что инкубация плазмидной ДНК с Lon-H6 или с Lon-dHI(CC) приводит к образованию комплексов ДНК-фермент и к изменению подвижности нуклеиновой кислоты при электрофорезе в агарозном геле (рис. 6).

Из представленных данных следует, что HI(CC)-домен Ec-Lon-протеазы либо не участвует во взаимодействии с нуклеиновой кислотой, либо не является определяющим в этом взаимодействии.

М

М

1500 800

400

200 50

Рис. 5. Фенольные экстракты образцов Lon-H6 (1) и Lon-dHI(CC) (2). М — маркеры, НК — нуклеиновая

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно полученным данным характеристический инсерционный Н1(СС)-домен Ес^оп-протеазы необходим для формирования и корректного функционирования АТР-азного центра фермента. В то же время Н1(СС)-домен не влияет на формирование пептидазного центра Ес^оп, однако имеет исключительное значение для взаимовлияния активных центров. Следует подчеркнуть, что, несмотря на сохранение активности пептидазного центра, делеция Н1(СС)-домена приводит к полной утрате ферментом протеолитической активности, что свидетельствует о важности этого домена для связывания и гидролиза белкового субстрата Ес^оп-протеазой.

Интересно, что делеционные формы Lon-протеазы из BreviЬacillus ЛеттотиЪет (В1^оп) [24], утратившие фрагменты (246-259) или (248-256) в coiled-соП(СС)-области, теряют все три вида активности. Противоречие в оценке возможности функционирования пептидазного центра в делеционных формах LonA-протеаз, выявленное при сопоставлении результатов настоящей работы и данных [24], может быть обусловлено использованием разных субстратов при тестировании пептидазного центра - тио-бензилового эфира ^защищенного трипептида (Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl) в нашей работе и 4-метокси-Р-нафтиламида менее специфичного трипептида (Glt-Ala-Ala-Phe-MNA) - в [24].

Обнаруженный нами интенсивный автолиз Lon-dHI(CC) вызван, как мы полагаем, утратой

100001 8000 6000 5000 4000 3500

3000 2500

2000 1500

Рис. 6. ДНК-связывающая способность Lon-H6 и Lon-dHI(CC). Условия эксперимента: 20 мМ Трис-НС1-буфер, рН 7.5; 60 мМ Naa; 25°С; ДНК (рЕТ28а) - 28 нМ (1—3); Lon-H6 - 33.9 мкМ (2), Lon-dHI(CC) - 22.2 мкМ (3); М — маркеры

способности к эффективному связыванию ну-клеотидов - свойства, которое является стабилизирующим фактором для полноразмерного фермента. Предположение о возможной роли Н1(СС)-домена как сайта связывания нуклеиновой кислоты Ес^оп-протеазой не получило экспериментального подтверждения.

Таким образом, можно считать, что инсерционный Н1(СС)-домен Ес^оп-протеазы необходим для формирования функционально активной структуры фермента и реализации белок-белковых взаимодействий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-50-00131).

2

2

3

кислота

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gottesman S., Wickner S., Maurizi M.R. // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 815-823.

2. Tyedmers J., Mogk A., Bukau B. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2010. V. 11. P. 777-788.

3. Mogk A., Haslberger T., Tessarz P., Bukau B. // Biochem. Soc. Trans. 2008. V. 36. P. 120-125.

4. Lee I., Suzuki C.K. // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1784. P. 727-735.

5. Rotanova T.V., Melnikov E.E., Khalatova A.G., Makhovskaya O.V., Botos I., Wlodawer A., Gustchina A. // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 4865-4871.

6. Goldberg A.L., Moerschell R.P., Chung C.H., Maurizi M.R. // Meth. Enzymol. 1994. V. 244. P. 350-375.

7. Charette M.F., Henderson G.W., Markovitz A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 4728-4732.

8. Fu G.K., Smith M.J., Markovitz D.M. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 534-538.

9. Lee A.Y.L., Hsu C.H., Wu S.H. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 34903-34912.

10. Liu T., Lu B., Lee I., Ondrovicova G., Kutejova E., Suzuki C.K. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 13902-13910.

11. Lupas A.N., Martin J. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2002. V. 12. P. 746-753.

12. Iyer L.M., Leipe D.D., Koonin E.V., Aravind L. // J. Struct.

Biol. 2004. V. 146. P. 11-31.

13. Ротанова Т.В., Мельников Э.Э. // Биомед. химия. 2010. Т. 56. С. 412-419.

14. Ротанова Т.В., Дергоусова Н.И., Морозкин А.Д. // Биоорган. химия. 2013. Т. 39. С. 309-319.

15. Андрианова А.Г., Куджаев А.М., Серова О.В., Дергоусова Н.И., Ротанова Т.В. // Биоорган. химия. 2014. T. 40. C. 673-681.

16. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

17. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. / Пер. с англ. М.: Мир, 1984.

19. Bencini D.A., Wild J.R., O'Donovan G.A. // Anal. Biochem. 1983. V. 132. P. 254-258.

20. Castillo M.J., Nakajima K., Zimmerman M., Powers J.C. // Anal. Biochem. 1979. V. 99. P. 53-64.

21. Lee A.Y.L., Tsay S.S., Chen M.Y., Wu S.H. // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 834-844.

22. Мельников Э.Э., Цирульников К.Б., Ротанова Т.В. // Биоорган. химия. 2000. T. 26. C. 530-538.

23. Куджаев А.М., Андрианова А.Г., Серова О.В., Архипова В.А., Дубовцева Е.С., Ротанова Т.В. // Биоорган. химия. 2015. T. 41. C. 579-586.

24. Chir J.L., Liao J.H., Lin Y.C., Wu S.H. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 382. P. 762-765.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.