CC BY
14
Серия «Биология. Экология»
Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia
2014. Т. 8. С. 25-30
Иркутского государственного университета
И З В Е С Т И Я
УДК 577.151.01
Изучение природного разнообразия микробных сообществ в гидротерме Алла (Бурятия) и оценка их пептидазной активности
Е. В. Лаврентьева, А. А. Раднагуруева, Д. Д. Бархутова, Б. Б. Намсараев
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ E-mail: [email protected]
Аннотация. С использованием метода пиросеквенирования дана полная характеристика состава бактериального сообщества микробного мата высокотемпературной зоны гидротермы Алла (Баргузинская долина, Бурятия). Изучена внеклеточная про-теолитическая активность в нативных образцах микробного мата и ила. Показано, что микробное сообщество гидротермы Алла обладает спектром внеклеточных про-теаз и характеризуется вариабельностью в распределении протеазной активности по субстратам.
Ключевые слова: гидротерма, микробное сообщество, пиросеквенирование, проте-азная активность.
В последние десятилетия изучение микробных сообществ термальных местообитаний на молекулярном уровне позволило выявить новые виды бактерий, их метаболические пути и механизмы биохимической адаптации, что значительно обогатило современную фундаментальную микробиологию [1; 2; 4; 5]. Термофильные бактерии представляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп микроорганизмов и являются источником ферментов и метаболитов для промышленности и медицины. В природных местообитаниях гидролитические бактерии являются важным компонентом микробных сообществ наземных гидротерм и занимают нишу первичных деструкторов благодаря способности гетеротрофно расти на биополимерах различной природы [3].
Целью работы является изучение разнообразия культивируемого и не-культивируемого микробного сообщества и выявление функциональной роли протеолитических бактерий в горячем источнике Алла в Баргузинской долине (Курумканский район Республики Бурятия).
Введение
Материалы и методы
Из пробы микробного мата высокотемпературной зоны (74-65 °С) гидротермы Алла (N 54°41'735'', E 110°44'710'', высота над у. м. 706 м) методом пиросеквенирования были определены 2406 валидные нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК домена Bacteria. Пиросеквенирование фрагментов гена 16S рРНК выполнено в компании Chunlab Inc. (Сеул, Южная Корея) на приборе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium с использованием бактериальных праймеров 27F (GAGTTTGATCMTGGCTCAG) и 518R (WTTACCGCGGCTGCTGG). Оценку таксономической сложности сообщества проводили с помощью пакета программ CLcommunity (v. 3.1).
Для исследования протеолитической активности в нативных образцах были использованы маты и ил. Определение внеклеточной протеазной активности на основе фосфатного буфера (рН 7) и в культуральной жидкости проводили по методу Эрлангера с соавторами [7], используя 5 мМ синтетические субстраты ^бензоил^-аргинил-п-нитроанилид (БАПА), пироглута-мил-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (ГААЛП), а также с помощью тринитрофенилирования, используя 1%-ный белковый субстрат - желатин (рН 8). Инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С с последующим спектрофотометрическим определением активности при X = 410 нм. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента в исследуемом образце, которое расщепляет 1 нмоль продукта в указанных условиях инкубации за 1 мин.
Результаты и обсуждение
В последние годы активное использование методов пиросеквенирования значительно расширило представление о разнообразии культивируемых и некультивируемых форм термофильных микроорганизмов в высокотемпературных экологических нишах. Метод пиросеквенирования позволяет охарактеризовать микробное сообщество, выявляя не только доминирующие микроорганизмы, но и минорные компоненты сообщества, которые играют важную экологическую роль в водных системах.
В составе бактериального сообщества микробного мата гидротермы Алла наибольшую долю составили бактерии фил Deinococcus-Thermus (45 % всех последовательностей 16S рРНК микроорганизмов), относящиеся к широко распространённым в гидротермальных экосистемах всего мира родам Thermus (55,8 %) и Meiothermus (43,5%) (рис.). Аэробные органотро-фы р. Thermus в изученном микробном сообществе представлены культивируемым видом Th. ignitirrae. Среди бактерий р. Meiothermus доминирует M. hypogaeus, процент их сходства с ближайшим культивируемым гомологом, выделенным из глубинного ила горячего источника в Японии, варьировал от 94,1 до 96,6 %. Другой представитель этого рода M. ruber впервые выделен и описан из горячих источников Алла и Гусиха в Бурятии [6]. Многие представители этой филы синтезируют внеклеточные ферменты, обеспечивающие гидролиз белков и полисахаридов, тем самым осуществляя аэробную деструкцию органического вещества в микробных матах.
100% -
90% -
80% -
70%
щ
о
о
а> ^
ю о о и
60%
50%
к
с
40%
30%
20% -
10% -
0% -
И2
:: :2,58:
;9,78;
;36,18!
:::::45,13;:;:;
■ Д^^Ьа^епа
■ ОР1
■ Р!апс1отусе1еэ
■ Ca!diserica
■ Ch!oroЬi
■ ДяшАсае
■ СуапоЬас1ег1а
■ Дrmatimoпadates
□ Firmicutes И Ch!oroflexi
□ Proteobacteria
□ ОР9
□ Nitrospirae
□ Deinococcus-Thermus
Рис. Состав бактериального сообщества микробного мата гидротермы Алла. Показаны филы с представленностью в сообществе более 1 %
Субдоминантом исследуемого бактериального сообщества является фила №1хо8р1гае (36 %), представленный в основном некультивируемыми организмами, относящимися к 16 некультивируемым представителям Thermodesulfovibrio (83-99 % гомологии). Единственным культивируемым представителем является Ш. yellowstonii (98-99 % гомологии), выделенный из термофильного мата горячего источника Йеллоустон (США). В структуре микробного мата Thermodesulfovibrio осуществляют диссимиляционное восстановление сульфатов, что показывает существенную роль этой группы прокариот в функционировании микробного сообщества.
Тип Proteobacteria (2,6 %) включает в себя большое количество не-культивируемых таксонов, которые распределены в четырёх классах: альфа, бета, гамма и дельта-протеобактерии, использующие в качестве доноров электронов органические вещества. Термофилы встречаются во всех четырёх классах. В основном это умеренно термофильные организмы.
В состав типа Firmicutes (1,8 %) входят аэробные и анаэробные бактерии, широко распространённые в гидротермальных выходах и получающие
энергию за счёт гидролиза широкого спектра углерод- и азотсодержащих субстратов.
Другие представители гетеротрофного блока микробного мата составили менее 1 % последовательностей.
Показано, что микробный мат высокотемпературной зоны источника Алла является автономным устойчивым сообществом, который подчиняется системной трофической организации.
Ведущую роль в функционировании микробного сообщества в экосистемах играют внеклеточные протеолитические ферменты, которые осуществляют гидролиз ряда пептидных связей в молекулах белков, обеспечивая высокие скорости деструкции органических веществ и их перераспределение между компонентами природных экосистем. Относительно постоянные физико-химические условия, качественный и количественный состав органических веществ в циано-бактериальных матах и илах способствует активному развитию в них различных бактерий - деструкторов.
В нативных образцах источника Алла было показано, что увеличение продукции трипсин-подобных протеаз наблюдается при повышении температуры. Максимальная внеклеточная протеолитическая активность была зафиксирована в микробном мате при температуре 65,2 оС. В циано-бактериальных матах источника Алла обнаружены и наибольшие показатели активности по субтилизинподобному субстрату ГААЛП (табл.).
Таблица
Протеолитическая активность микроорганизмов из нативных образцов гидротермы Алла, культивируемых на разных субстратах, ед.
Точки отбора проб Вид нативного образца и температура (°С) Вид субстрата
БАПА ГААЛП Желатин
1 Микробиальный мат, 65,2 1,44 2,18 5,96
2 Ил, 49,0 1,15 0,29 5,45
3 Ил, 24,0 0,94 0,67 4,8
Наиболее высокая общая внеклеточная протеолитическая активность, опредёленная методом тринитрофенелирования, выявлена в высокотемпературных зонах отбора 5,96 ед. в циано-бактериальном мате (Т = 65,2 оС) и 5,45 ед. в иле (Т = 49,0 оС). Высокая ферментативная активность, зафиксированная на этих станциях, вероятно, обусловлена скоплением гидролитических бактерий в благоприятных экологических условиях.
Определение протеолитической активности показало, что микроорганизмы из микробных матов и илов на одной станции обладают различной секрецией протеаз. Следует отметить, что высокие значения субтилизинпо-добной активности проявляются в основном в циано-бактериальных матах, в то время как максимальные величины трипсинподобной активности были определены как в циано-бактериальных матах, так и в илах.
Полученные результаты показывают, что микробное сообщество гидротермы Алла обладает спектром внеклеточных протеаз и характеризуется
вариабельностью в распределении протеазной активности по субстратам. Выявлено, что на протеазную активность оказывают существенное влияние тип субстрата и физико-химические условия источников.
Из ила гидротермы Алла выделен штамм бактерии Al-9-1. Исследование экофизиологии выделенной культуры показало, что он способен развиваться в широком диапазоне температур (35-67 °С) и рН (6,5-9,0) с оптимумом роста при 50 °С и рН 8,0, проявляя свойства алкало- и термотолерантности. Анализ гена 16S показал, что штамм Al-9-1 имеет 96%-ное сходство с Anoxybacilluspushchinoensis AT-2 (AB234214).
Показано, что изученный штамм не гидролизуют субстраты, специфичные для химотрипсинподобных и цистеиновых протеиназ, независимо от времени культивирования (до 60 ч) и источников органического азота (триптон, казеин и желатин). Отмечено, что штамм Al-9-1 обладает субтили-зин-подобной активностью. Характерно, что наибольшая активность обнаружена на среде с триптоном на 36-м часу культивирования. Добавление в среду казеина приводило к постоянной индукции субтилизин-подобных протеиназ в течение всего времени культивирования.
Заключение
Исследования, проведённые в горячем источнике Алла, показали присутствие активных и разнообразных термофильных микробных сообществ, способных гидролизовать биополимеры (белковые соединения). Обнаруженные свойства пептидаз микробного сообщества и представителя р. Anoxyba-cillus являются перспективными для использования их в биотехнологии.
Исследование поддержано грантом Минобрнауки РФ № 1990, ФЦП №8116, интеграционными проектами № 5, 94, 56.
Список литературы
1. Бонч-Осмоловская Е. А. Изучение термофильных микроорганизмов в Институте микробиологии РАН / Е. А. Бонч-Осмоловская // Микробиология. - 2004. -T. 73, № 5. - C. 644-658.
2. Бонч-Осмоловская Е. А. Термофильные микроорганизмы: общий взгляд / Е. А. Бонч-Осмоловская // Тр. Ин-та микробиологии. - 2011. - В. 16. - C. 5-14.
3. Кубланов И. В. Термофильные микроорганизмы, разлагающие биополимеры / И. В. Кубланов, О. А. Подосокорская // Тр. Ин-та микробиологии им. С. Н. Виноградского. - М. : Наука, 2011. - Вып. XVI. - С. 315-342.
4. Микробные сообщества щелочных гидротерм / З. Б. Намсараев [и др.] // Новосибирск : Изд-во СО РАН. - 2006. - 111 с.
5. Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов в источнике За-варзина, кальдера Узон, Камчатка / В. М. Гумеров // Микробиология. - 2011. -Т. 80, № 2. - C. 258-265.
6. Термофильные бактерии горячих источников Бурятии / Г. И. Храпцова [идр.] // Микробиология. - 1984. - Т. 53, вып. 1. - С. 137-141.
7. Erlanger B. F. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin / B. F. Erlanger, N. Kokowsky, W. Cohen // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. -Vol. 95. - P. 271-278.
Diversity and Peptidase Activity of Microbial Communities in the Hot Spring Alla (Buryatia)
E. V. Lavrentieva, A. A. Radnagurueva, D. D. Barhutova, B. B. Namsaraev
Institute of General and Experimental Biology SB RAS, Ulan- Ude
Abstract. Using the method of pyrosequencing a complete characterization of the bacterial community composition in the microbial mat of high-temperature zone of hot spring Alla (Buryatia) is given. Extracellular proteolytic activity in native samples (microbial mats and bottom sediments) was studied. It is shown that the microbial community has a spectrum of extracellular proteases and is characterized by variability in the distribution of protease activity on substrates.
Keywords: microbial mats, pyrosequencing, protease activity.
Лаврентьева Елена Владимировна кандидат биологических наук научный сотрудник
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН 670047, Улан-Удэ, Сахъяновой, 6 тел.: (3012) 43-49-02 e-mail: [email protected]
Раднагуруева Арюна Арсалановна кандидат биологических наук, младший научный сотрудник Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН 670047, Улан-Удэ, Сахъяновой, 6 тел.: (3012) 43-49-02 e-mail: [email protected]
Lavrentieva Yelena Vladimirovna Candidate of Sciences (Biology) Research Scientist
Institute of General and Experimental Biology SB RAS
6, Sakhyanova st., Ulan-Ude, 670047 tel.: (3012) 43-42-29 e-mail: [email protected]
Radnagurueva Aryuna Arsalanovna Candidate of Sciences (Biology) Junior Research Scientist Institute of General and Experimental Biology SB RAS
6, Sakhyanova st., Ulan-Ude, 670047 tel.: (3012) 43-42-29 e-mail: [email protected]
Бархутова Дарима Дондоковна кандидат биологических наук старший научный сотрудник Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН 670047, Улан-Удэ, Сахъяновой, 6 тел.: (3012) 43-49-02 e-mail: [email protected]
Намсараев Баир Бадмабазарович доктор биологических наук заведующий лабораторией Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН 670047, Улан-Удэ, Сахъяновой, 6 тел.: (3012)43-49-02 e-mail: [email protected]
Barkhutova Darima Dondokovna Candidate of Sciences (Biology) Senior Research Scientist Institute of General and Experimental Biology SB RAS
6, Sakhyanova st., Ulan-Ude, 670047 tel.: (3012)43-42-29 e-mail: [email protected]
Namsaraev Bair Badmabazarovich Doctor of Sciences (Biology) Head of Laboratory Institute of General and Experimental Biology SB RAS
6, Sakhyanova st., Ulan-Ude, 670047 tel.: (3012)43-42-29 e-mail: [email protected]
