CC BY
64
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 57.036:577.1 13.3
Каскад термофильных ферментов как инструмент создания модифицированных нуклеотидов
Р. С. Есипов*, Ю. А. Абрамчик, И. В. Фатеев, И. Д. Константинова, М. А. Костромина, Т. И. Муравьева, К. Г. Артемова, А. И. Мирошников
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 09.11.2015
Принята к печати 06.06.2016
РЕФЕРАТ Предложена новая стратегия биосинтеза биологически важных нуклеотидов, заключающаяся в мультиферментативном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеотиды c использованием ферментов нуклеинового обмена термофильных микроорганизмов (рибокиназы, фосфорибозилпиро-фосфатсинтетазы и аденин-фосфорибозилтрансферазы). Клонирован ген рибокиназы термофильного микроорганизма Thermus sp. 2.9, два разных гена фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-синтетазы) и ген аденин-фосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) из Thermus thermophilus HB27. Получены высокопродуктивные штаммы-продуценты Escherichia coli, разработаны методы выделения упомянутых ферментов, изучена их субстратная специфичность. Показана возможность использования этих ферментов для превращения D-пентоз в 5-фосфаты, а затем под действием рибокиназы и PRPP-синтетаз — в 5-фосфо-а^-пентофуранозо-1-пирофосфаты, конденсация которых с аденином и рядом его структурных аналогов, катализируемая APR-трансферазой, приводила к получению искомых нуклеотидов. На примере 2-хлор(фтор)-аденозинмонофосфата (2C1-AMP и 2F-AMP) показана возможность использования системы термофильных ферментов в одном реакционном объеме для получения биологически активных нуклеотидов из D-рибозы и соответствующих гетерооснований в присутствии ATP, рибокиназы, PRPP-синтетазы и APR-трансферазы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аденин-фосфорибозилтрансфераза термофильных микроорганизмов, рибокиназа, субстратные свойства, ферментативный синтез нуклеотидов, фосфорибозилпирофосфатсинтетаза. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БСА - бычий сывороточный альбумин; ИПТГ - изопропил-ß-D-1-тиогалактопиранозид; ПААГ - полиакриламидный гель; ПМСФ - фенилметансульфонилфторид; ПЦР - полимеразная цепная реакция; APR-трансфераза (TthAPRT) - аденин-фосфорибозилтрансфераза из Thermus thermophilus; LB - среда Луриа-Бертани (Luria-Bertani); PRPP-синтетаза (TthPRPPS) - фос-форибозилпирофосфатсинтетаза из T. thermophilus; RK (TspRK) - рибокиназа из Thermus sp.; 2C1-AMP -2-хлораденозин-5'-монофосфат; 2F-AMP - 2-фтораденозин-5'-монофосфат; Pi - неорганический фосфат; PRPP - 5-фосфорибозил-а-1-пирофосфат.
ВВЕДЕНИЕ
5'-Фосфорилированные нуклеозиды являются важными метаболитами биосинтеза ДНК и РНК, а также косубстратами и кофакторами огромного числа биохимических превращений [1 — 3]. Важная роль этих соединений в живой клетке определяет интерес к синтезу не только природных представителей этого класса, но и их разнообразных аналогов с целью направленного влияния на метаболизм в норме и при патологии [4-8]. Большое число ну-клеозидов, модифицированных по гетерооснованию и углеводному фрагменту, используются в качестве важных средств против вирусных инфекций и зло-
качественных новообразований [9-13]. Действие модифицированных нуклеозидов опосредовано через внутриклеточное превращение в первую очередь в 5'-монофосфаты и далее, как правило, в 5'-ди- и трифосфаты, которые и выступают в качестве антиметаболитов. Известно, что первая стадия метаболической активации модифицированных нукле-озидов - превращение в 5'-монофосфаты - определяет их биологические свойства. Следует также отметить, что нуклеозид-5'-монофосфаты, модифицированные по гетерооснованию и/или по углеводному фрагменту, представляют значительный интерес в качестве исходных соединений для хи-
Рис. 1. Схема полиферментативного каскадного ^нтеза модифицированных аденозин-5-монофосфатов
мического синтеза производных по фосфату (пролекарств) и ферментативного превращения в 5'-трифосфаты для последующего включения в олигонуклеотиды [14-16]. Разработка эффективных биосинтетических подходов к получению 5'-монофосфатов модифицированных нуклеозидов привлекает большое внимание исследователей, работающих в области повышения эффективности хи-миотерапевтических средств.
Моно- и полиферментативному синтезу нуклеозид-5'-моно- и 5'-трифосфатов посвящено большое число публикаций [17-21], среди которых наше внимание привлекли фосфорибозилтрансфе-разы, недавно успешно использованные в каскадном пятикомпонентном синтезе пуриновых рибозид-5'-монофосфатов [22-24]. Известно, что нуклеозид-фосфорилазы термофильных микроорганизмов менее чувствительны к структуре субстратов [25, 26], что позволяет работать при 70-80оС и существенно увеличивает эффективность ферментативной реакции за счет повышения растворимости гетероциклических субстратов [27]. Все эти данные вызвали наш интерес к получению рекомбинантных ферментов: рибокиназы, фосфорибозилпирофосфат-синтетазы и аденин-фосфорибозилтрансферазы из термофильных микроорганизмов и изучению их субстратных свойств с целью определения потенциала этих ферментов в каскадном синтезе пури-новых нуклеозид-5-монофосфатов согласно схеме на рис. 1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клонирование
Гены TT_RS05985, TT_RS06430, TT_RS06315, кодирующие TthPRPPSl, TthPRPPS2 и TthAPRT, соответственно амплифицировали на матрице геномной ДНК штамма Thermus thermophilus HB27 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием синтетических праймеров. Ген QT17_05185, кодирующий RK из Thermus sp. 2.9, был оптимизирован по встречаемости кодонов для экспрессии в Escherichia coli и синтезирован химико-ферментативным способом из перекрывающихся олигону-клеотидов. Все гены клонировали в экспрессионный вектор pET-23d+ по сайтам узнавания рестриктаз NcoI и XhoI.
Культивирование штаммов-продуцентов
Штаммы E. coli BL21(DE3), Rosetta(DE3) и C3029/ pGTf2 трансформировали полученными экс-прессионными векторами pER-PRPPS1-Tth, pER-PRPPS2-Tth, pER-APRT-Tth и pER-RK-Tsp. Штаммы-продуценты, производные E. coli BL21(DE3) и Rosetta(DE3), культивировали при 37°С в среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Культивирование штаммов-продуцентов, производных E. coli C3029/pGTf2, проводили в среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, 20 мкг/мл хлорамфеникола и 1 нг/мл тетрациклина. После достижения культурами оптической плотности
A595 = 0.8 вносили ИПТГ до конечной концентрации 0.4 мМ и продолжали культивирование при 23 и 37оС. Длительность выращивания варьировала от 4 до 16 ч в зависимости от штамма. По окончании культивирования клеточную биомассу отделяли центрифугированием, гомогенизировали в соотношении 1 : 10 (w/v) в буферном растворе 50 мМ Трис-HCl, pH 8.5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ПМСФ и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора Labsonic P (Sartorius, Германия) в течение 10 мин при 4oC (цикл - 0.4 с, амплитуда - 30%). Содержание целевых ферментов в растворимой и нерастворимой клеточных фракциях определяли денситометрическим анализом электрофоретических гелей с помощью программы ImageLab 5.0 (Bio-Rad, США) [28]. Выбор остановили на штаммах-продуцентах, содержащих максимальное количество целевого белка в супернатанте: E. coli BL21(DE3)/pER-APRT-Tth (культивирование в течение 4 ч при 37°C после внесения ИПТГ), E. coli Rosetta(DE3)/pER-PRPPS1-Tth (4 ч при 37°C), E. coli C3029/pGTf2/pER-PRPPS2-Tth (5 ч при 37°С) и E. coli C3029/pGTf2/pER-RK-Tsp (16 ч при 23°С). Штаммы выращивали в 5—6 л культуральной среды.
Выделение и очистка TthPRPPS1, TthPRPPS2 и TspRK
Клеточную биомассу штаммов-продуцентов TthPRPPS1, TthPRPPS2 и TspRK ресуспендировали в буферном растворе 50 мМ Трис-HCl, pH 8.7, 1 мМ ПМСФ в соотношении 1 : 10 (w/v) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора Labsonic P в течение 20 мин при +4oC (цикл - 0.5 с, амплитуда -50%). Клеточный дебрис отделяли центрифугированием при 12000 об/мин в течение 30 мин при +4oC на центрифуге Hermle Z383K (HERMLE Labortechnik GmbH, Германия). При выделении TspRK осветленный клеточный лизат подвергали термической обработке в течение 10 мин при 65°С для осаждения примесных белков и ДНК. Осадок отделяли центрифугированием. Дальнейшее выделение ферментов осуществляли по одной схеме. Осветленный клеточный лизат наносили на колонку XK 16/20 (GE Healthcare, США) с сорбентом Ni2+-IDA (Qiagen, Германия), предварительно уравновешенным буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, pH 8.7. Отмывали от балластных белков буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, pH 8.7, 50 мМ имидазол. Целевой белок элюировали буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, pH 8.7, 200 мМ имидазол. После аффинной хроматографии к фракциям, содержащим целевой белок, добавляли EDТА до 5 мМ и концентрировали при помощи ультрафильтрационной ячейки Amicon 8200 объемом 200 мл (Millipore, США) на мембране YM 10 кДа (Millipore) при выделении TthPRPPS1
и TthPRPPS2, YM 30 кДа (Millipore) при выделении TspRK. Последующую очистку проводили на колонке HiLoad 16/60 с сорбентом Superdex 200 (GE Healthcare) в буферном растворе 20 мМ Трис-HCl, pH 8.5, 1 мМ ATP, 1 мМ MgCl2, 5% глицерина, 0.04% NaN3. Фракции, содержащие целевой белок, объединяли и концентрировали с помощью ультрафильтрации до конечной концентрации 12 ± 1 мг/мл как описано ранее. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд, используя БСА в качестве стандарта [29]. Чистоту белка определяли с помощью белкового электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [28]. Выделенные ферменты хранили при -80°С.
Выделение и очистка TthAPRT
Разрушение клеточной биомассы штамма-продуцента TthAPRT осуществляли по методике, описанной для других ферментов. В осветленный клеточный лизат добавляли NaCl до концентрации 300 мМ и проводили термическую обработку в течение 10 мин при 65°С. После осаждения осадка белка центрифугированием лизат наносили на колонку PD-10 с сорбентом Sephadex G-25 Medium (GE Healthcare, США), уравновешенным буферным раствором 20 мМ Трис-HCl, pH 9.0, 1.0 мМ EDTA. Раствор белка после обессоливания наносили на колонку XK 16/20 с сорбентом Q Sepharose XL (GE Healthcare, США), уравновешенным тем же буферным раствором. Целевой белок элюировали в линейном градиенте концентрации NaCl (от 0 до 400 мМ). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли и наносили на колонку XK 16/20 с Phenyl Sepharose HP (GE Healthcare, США), уравновешенной буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCl, pH 7.6, 1 М (NH4)2SO4, 1.0 мМ EDTA. TthAPRT элюировали в линейном градиенте (NH4)2SO4 (от 1 до 0 М). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией на полисульфоновой мембране PBGC 10 кДа до конечной концентрации 5.0 ± 0.5 мг/мл как описано ранее. Окончательную очистку проводили на колонке HiLoad 16/60 с сорбентом Superdex 200 20 мМ Трис^О-буфере pH 8.0, содержащем 50 мМ NaCl, 5% глицерина, 0.04% NaN3. Фракции, содержащие целевой белок, объединяли и концентрировали путем ультрафильтрации до конечной концентрации 12 ± 1 мг/мл. Концентрацию и чистоту белка определяли как описано ранее [28, 29]. Выделенный фермент хранили при -80°С.
Определение активности ферментов
Активность TspRK определяли радиохимическим методом по образованию О-рибофуранозо^-р^]-фосфата в присутствии [y-32P]ATP. Реакционная
смесь (0.05 мл, 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0) содержала 0.4 мМ динатриевой соли ATP, 1 мМ D-рибозы, 5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 1 мМ KH2PO4, 6 мкКи [y-32P]ATP и 0.15 мкг TspRK. Смесь термостатировали при 75°C. Аликвоты (0.8 мкл) отбирали через 10, 20 и 40 мин и наносили на пластинки с PEI-целлюлозой, затем элюировали водным 0.5 М дигидроортофосфатом калия. Количество образовавшегося D-рибофуранозо-5-[32Р]фосфата определяли на жидкостном сцинтил-ляционном счетчике TRI-CARB 2100TR (Packard BioScience Co.).
Активность TthPRPPS1 и TthPRPPS2 определяли в реакционной смеси, состоящей из 1 мМ динатриевой соли ATP, 1 мМ динатриевой соли О-рибозо-5-фосфата, 5 мМ MgCl2, 10 мМ KH2PO4, 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0, при 75°C. Добавляли 0.75 мкг TthPRPPS на 0.5 мл смеси.
Активность TthAPRT определяли в реакционной смеси, содержащей 1 мМ аденина, 1 мМ пента-натриевой соли 5-фосфорибозил-а-1-пирофосфата (PRPP), 5 мМ MgCl2, 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0, при 75°C. TthAPRT добавляли из расчета 0.125 мкг на 0.5 мл реакционной смеси. За единицы активности принимали количество продукта (мкмоль), образующееся за 1 мин.
Определение кинетических параметров рибокиназы
Реакционная смесь (0.5 мл, 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0) содержала (а) динатриевую соль ATP (от 0.01 до 0.6 мМ) и D-рибозу (1 мМ); (б) D-рибозу (от 0.01 до 8.0 мМ) и ATP (1 мМ) для определения значений КМ и для ATP и D-рибозы соответственно, 5 мМ MgCl2, 150 мМ KCl, 10 мМ KH2PO4 и 0.0175 мкг TspRK. Для каждого эксперимента готовили 16 реакционных смесей. Смеси термостатировали при 75°C в течение 12 мин, каждый эксперимент повторяли трижды. Затем определяли среднее значение скорости в трех опытах с одинаковой концентрацией фермента. Концентрации субстрата и продукта определяли с помощью ВЭЖХ в изократическом режиме элюи-рования 0.1 М KH2PO4 (вода, pH 6.0, скорость потока 0.5 мл/мин) с измерением на длине волны 254 нм (УФ-детектор Waters 2489; колонка Supelcosil LC-18-T, 5 мкм, 150 х 4.6 мм).
Определение кинетических параметров PRPP-синтетаз
Для определения кинетических параметров ферментов концентрацию ATP изменяли в интервале от 0.005 до 0.2 мМ. Аналогичный интервал использовали для D-рибозо^-фосфата. Остальные условия были такими же, как при определении ферментативной активности. Реакцию проводили в течение
2 мин в трех повторностях. Затем определяли среднее значение скорости в трех опытах с одинаковой концентрацией. Концентрации ATP и AMP определяли с помощью ВЭЖХ в изократическом методе элюирования 0.1 M KH2PO4, pH 6.0, скорость потока 0.5 мл/мин, длина волны - 254 нм (детектор Waters 2489; колонка Supelcosil LC-18-T, 5 мкм, 150 х 4.6 мм).
Определение кинетических параметров APR-трансферазы
При определении кинетических параметров APR-трансферазы концентрацию аденина изменяли в интервале от 0.005 до 0.2 мМ, а PRPP - от 0.05 до 1.2 мМ. Остальные условия были такими же, как при определении активности. Реакцию проводили в течение 1 мин в трех повторностях. Среднее значение скорости реакции определяли по результатам трех экспериментов с одинаковой концентрацией. Концентрации аденина и AMP определяли методом ВЭЖХ в изократическом методе элюирования 36% водным метанолом, скорость потока 0.5 мл/мин, длина волны - 254 нм (детектор Waters 2489; колонка MZ PerfectSil 100 ODS-3, 5 мкм, 150 х 4.6 мм).
Кинетические параметры определяли нелинейным регрессионным анализом при помощи программы SciDAVis v.0.2.4. Наблюдаемую каталитическую константу (k t) рассчитывали на одну субъединицу, массу которой определяли исходя из аминокислотной последовательности (32.0 кДа для TspRK, 34.5 кДа для TthPRPPS1, 34.6 кДа для TthPRPPS2 и 19.0 кДа для TthAPRT).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С целью изучения возможности трехступенчатого биосинтеза нуклеотидов проведены комплексные работы по получению и исследованию субстратных свойств рекомбинантных ферментов нуклеинового обмена - рибокиназы, двух PRPP-синтетаз и APR-трансферазы из T. thermophilus.
Ген QT17_05185, кодирующий RK из Thermus sp. 2.9, получен химико-ферментативным способом. Гены TT_RS05985, TT_RS06430, TT_RS06315, кодирующие TthPRPPS1, TthPRPPS2 и TthAPRT из T. thermophilus HB27, соответственно амплифици-рованы с геномной ДНК с помощью ПЦР. Все гены были клонированы в плазмидный вектор pET-23d+. Созданные в результате экспрессионные векторы pER-PRPPS1-Tth, pER-PRPPS2-Tth и pER-RK-Tsp содержали гибридные гены, объединяющие в одной рамке считывания последовательности, кодирующие ферменты и аффинную метку из шести остатков ги-стидина. Экспрессионный вектор pER-APRT1-Tth содержал немодифицированную последовательность, кодирующую TthAPRT.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 1. Стадии выделения и очистки рибокиназы, PRPP-^нтетаз и APR-трансферазы
Стадия очистки Объем, мл Концентрация белка, мг/мл Суммарный белок, мг
Рибокиназа из Thermus sp. 2.9
1. Разрушение ультразвуковым дезинтегратором 150* 8.3 1245
2. Термообработка 136 1.7 231.2
3. Металл-хелатная хроматография 30 1.9 57
4. Концентрирование 9 6 54
5. Гель-фильтрационная хроматография 28.5 1.28 36.4
6. Концентрирование 2.6 11.7 30.4
PRPP-синтетаза 1 из T. thermophilus HB27
1. Разрушение ультразвуковым дезинтегратором 150** 10 1500
2. Аффинная хроматография 100 0.8 80
3. Концентрирование 13 5.7 74.1
4. Гель-фильтрация 50 1 50
5. Концентрирование 4 12.3 49.2
PRPP-синтетаза 2 из T. thermophilus HB27
1. Разрушение ультразвуковым дезинтегратором 130** 11.2 1456
2. Аффинная хроматография 125 0.6 75
3. Концентрирование 10.3 6.2 63.9
4. Гель-фильтрация 37.5 1.2 45
5. Концентрирование 3.4 12 40.8
APR-трансфераза из T. thermophilus HB27
1. Разрушение ультразвуковым дезинтегратором 157*** 6 942
2. Термообработка 149 1.3 193.7
3. Гель-фильтрация 258 0.7 181
4. Анионообменная хроматография 72 1.2 86.4
5. Гидрофобная хроматография 73 0.8 58.4
6. Концентрирование 11 5 55
7. Гель-фильтрационная хроматография 52 0.87 45.2
8. Концентрирование 3.4 12.5 42.5
* Из 5.8 л культуры. ** Из 5 л культуры. *** Из 6 л культуры.
Этими плазмидами трансформировали штаммы E. coli BL21(DE3), Rosetta(DE3) и C3029/pGTf2. Подбирали условия культивирования штаммов-продуцентов, при которых целевые ферменты синтезировались в растворимой форме. Продуценты растворимых рекомбинантных TspRK и TthPRPPS2 получены на основе E. coli С3029/pGTf2. Этот штамм создан путем трансформации клеток E. coli С3029 плазмидным вектором pGTf2 (Takara Bio Inc.), несущим последовательности, кодирующие белки-шапероны GroES-GroEL-Tig под контролем промотора Pzt-1. Выбор штамма E. coli Rosetta(DE3) для биосинтеза TthPRPPS1 обусловлен тем, что ген TT_RS05985, кодирующий TthPRPPS1, содержит редко используемые в E. coli кодоны (один AGA, девять AGG, 10 CGG, один AUA, один CUA и 15 CCC). В штамме Rosetta(DE) синтезируются тРНК для этих редких кодонов. Рекомбинантную TthAPRT в растворимой форме получали в штамме E. coli BL21(DE3).
Выделение и очистка рибокиназы и двух PRPP-синтетаз включали стадии металл-хелатной и гель-фильтрационной хроматографии (табл. 1). Термическая обработка клеточного лизата при выделении TspRK позволила значительно обогатить фракцию целевым белком за счет агрегации клеточных белков и ДНК. При выделении обеих Ttfr.PRPPS аналогичная обработка не давала положительных результатов, а приводила к потере целевого белка. В связи с высокой вероятностью протеолиза металл-хелатную хроматографию проводили при охлаждении, а к объединенным фракциям добавляли EDТА. После проведения последней стадии очистки с помощью гель-фильтрационной хроматографии все белковые препараты концентрировали.
Выделение и очистка Ttfr.APRT включала стадии термической обработки, обессоливания, ани-онообменной, гидрофобной, гель-фильтрационной хроматографии и концентрирования (табл. 1).
Таблица 2. Кинетические параметры природных субстратов исследуемых ферментов
Субстрат Km, мкМ K., мкМ V , мкмоль/мин-мг max' ' кса, 1/с
Рибокиназа из Thermus sp. 2.9
ATP 75 ± 11 - 13 ± 1 6.8 ± 0.7 9.1 X 104
D-Рибоза 20 ± 6 1700 ± 400 13 ± 2 7.1 ± 1.2 3.5 X 105
PRPP-синтетаза 1 из T. thermophilus HB27
ATP 10 ± 2 - 0.71 ± 0.05 0.41 ± 0.03 4.3 X 104
D-Рибозо-5-фосфат 32 ± 6 - 0.85 ± 0.11 0.49 ± 0.06 1.5 X 104
PRPP-синтетаза 2 из T. thermophilus HB27
ATP 12 ± 2 - 20 ± 2 11 ± 1 9.9 x 105
D-Рибозо-5-фосфат 40 ± 4 - 24 ± 2 14 ± 1 3.4 X 105
APR-трансфераза из T. thermophilus HB27
Аденин 13 ± 2 - 6.0 ± 0.4 1.9 ± 0.1 1.4 X 105
PRPP 179 ± 35 - 9.2 ± 1.1 2.9 ± 0.4 1.6 x 104
Как и в случае TspRK, на первой стадии проводили термическую обработку осветленного клеточного лизата, но при этом в раствор добавляли соль (до 300 мМ хлорида натрия), что значительно ускоряло агрегацию примесных клеточных белков и ДНК.
При использовании разработанных методик выход всех рекомбинантных термофильных ферментов составил не менее 8-10 мг/л культуральной среды с электрофоретической чистотой не менее 95%.
Далее определяли кинетические параметры и оптимальные условия работы выделенных рекомби-нантных ферментов.
Специфическую активность TspRK определяли радиохимическим методом по образованию 0-рибофуранозо-5-[32Р]фосфата в присутствии [y-32P]ATP. За единицы активности принимали количество продукта (мкмоль), образующееся за 1 мин. Активность TspRK составила 5.5 ед/мг.
Специфическую активность TthPRPPS1 и TthPRPPS2 определяли опосредованно по образованию AMP в реакционной смеси (по данным ВЭЖХ) в присутствии двух субстратов: ATP и О-рибозо-5-фосфата. У первого фермента она составила 0.85 ед/ мг, а у второго - 11 ед/мг. Учитывая большие различия в активности ферментов, более рациональным представляется использование для синтеза нуклео-тидов второй синтетазы, учитывая более низкий расход белка. Свойства TthAPRT изучали на модельной реакции взаимодействия аденина с 5-фосфорибозил-a-1-пирофосфатом. Образование AMP наблюдали при помощи ВЭЖХ. Специфическая активность фермента составила 8.8 ед/мг.
При использовании в качестве субстрата рибозы в высокой концентрации обнаружено ингибирование
ферментативной активности TspRK. Данный эффект описан для рибокиназы человека [30]. Таким образом, результаты экспериментов с ATP анализировали с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен V = VmaxXS/(KM + S). В опытах с D-рибозой использовали уравнение, учитывающее эффект ингибиро-вания субстратом в результате связывания второй молекулы V = VmaxXS/(KM + S + S2/K.).
Кинетические параметры природных субстратов ферментов приведены в табл. 2.
Результаты определения оптимальных условий работы рекомбинантных ферментов приведены на рис. 2-4.
Изученные ферменты активны в широком температурном диапазоне. Максимальная активность TspRK и TthPRPPS1 наблюдалась при 85°C, тогда как активность TthAPRT при этой температуре снижалась на 35%. Поэтому было решено дальнейшие каскадные синтезы проводить при 75°C.
В отсутствие ионов магния в буферном растворе активность ферментов была очень низкой. При добавлении 0.25 мМ хлорида магния активность значительно увеличивается.
В области более высоких концентраций зависимость активности ферментов от концентрации ионов магния выглядит следующим образом: у TspRK и TthPRPPS1 активность снижается, у TthAPRT повышается, в случае TthPRPPS2 - резко повышается. Таким образом, каскадные реакции с участием TthPRPPS1 целесообразно проводить при концентрации хлорида магния 0.25-0.5 мМ, а с участием TthPRPPS2 - при 5 мМ.
Ферменты по-разному реагируют на добавление ортофосфата калия. Активность TspRK снижает-
с о н
к
<
-♦-TspRK -•-TtfiPRPPSI -*-TthPRPPS2 —TthAPRT
30 40 50 60 70 80 90 100 Температура,°C
2 3 Mg2+, мМ
Рис. 2. Зависимость активности ферментов от температуры. Активность при 75°C принята за 100%. Реакции проводили при температуре от 36 до 92°C в смеси объемом 0.05 мл (20 мМ Трис-HCl, pH 8.0), содержащей: 1) 0.4 мМ ATP, 1 мМ рибозы, 1 мM KH2PO4, 5 мM MgCl2, 50 мM KCl, 0.15 мкг TspRK; 2) 1 мM ATP, 1 мM О-рибозо-5-фосфата, 5 мM MgCl2, 10 мM KH2PO4, 0.75 мкг TthPRPPS1 или TthPRPPS2; 3) 1 мM аденина, 1 мM PRPP, 5 мM MgCl 0.125 мкг TthAPRT
Рис. 3. Зависимость активности ферментов от концентрации ионов магния. Активность при 1 мМ Mg2+ принята за 100%. Реакции проводили при температуре 75°C в смеси объемом 0.5 мл (20 мМ Трис-HCl, pH 8.0, от 0 до 5 мМ MgCl2), содержащей: 1) 0.4 мМ ATP, 1 мМ рибозы, 1 мM KH2PO4, 50 мM KCl, 0.15 мкг TspRK; 2) 1 мM ATP, 1 мM О-рибозо-5-фосфата, 10 мM KHPO„ 0.75 мкг TthPRPPS1 или TthPRPPS2;
24
3) 1 мM аденина, 1 мM PRPP, 0.125 мкг TthAPRT
ся, TthAPRT - практически не меняется, у обеих TthPRPPS существенно повышается, причем в случае TthPRPPS2 она начинает падать при концентрации свыше 25 мМ. Оптимальная концентрация для проведения каскадных реакций составляет 1025 мМ.
Наиболее критичным оставался вопрос о субстратной специфичности каждого фермента по отношению к различным углеводам.
О-рибоза и 2-дезокси-О-рибоза являются субстратами TspRK (рис. 5), при этом активность по де-зоксисахару составляет 57% от активности в отношении О-рибозы. Активность в отношении О-арабинозы и О-ксилозы превышает фоновую в 2 раза, что может указывать на их использование в качестве субстратов, но значительно менее специфичных. Активность в отношении О-глюкозы и О-ликсозы не обнаружена.
Проверена активность обеих TthPRPPS в отношении 2'-дезокси-ATP, -GTP и 2'-дезокси-GTP. Активность при использовании 2'-дезокси-ATP составила 80% от активности с ATP. Активность в отношении GTP и 2'-дезокси-GTP не обнаружена (данные не приведены). Можно предположить, что эти TthPRPPS относятся к ферментам первого типа [31]. Все реакции проводили в тех же условиях, в которых определяли активность, менялся лишь добавляемый субстрат. Оба фермента способны катализировать реакцию с О-арабинозо-5-фосфатом (рис. 6). При этом активность в отношении 2-дезокси-О-рибозо-5-
зоо
%
к А
200
150
100
-TspRK -TthPRPPSI -TthPRPPS2 TthAPRT
50 Pi, мМ
100
Рис. 4. Зависимость активности ферментов от концентрации неорганического фосфата. Активность при 10 мМ Pi принята за 100%. Реакции проводили при температуре 75°C в смеси объемом 0.5 мл (20 мМ Трис-HCl, 5 мM MgCl2, pH 8.0, от 0 до 100 мМ KH2PO4), содержащей: 1) 0.4 мМ ATP, 1 мМ рибозы, 50 мM KCl, 0.15 мкг TspRK, 2) 1 мM ATP, 1 мM О-рибозо-5-фосфата, 0.75 мкг TthPRPPS1 или TthPRPPS2, 3) 1 мM аденина, 1 мM PRPP, 0.125 мкг TthAPRT
фосфата не обнаружена, что говорит о важности ги-дроксильной группы по второму положению углевода для осуществления ферментативной реакции.
С целью определения возможности использования различных гетероциклических оснований для синтеза нуклеотидов проведено несколько реакций.
о4
.0 н
и О X
<
П" п 7É П п
.0 с
о а
н X
О Ы
Рис. 5. Ферментативная активность рибокиназы в присутствии различных углеводов. Реакции проводили при температуре 75°C в смеси объемом 0.05 мл (20 мМ Трис-HCl, pH 8.0), содержащей 0.4 мМ ATP, 1 мМ углевода (контрольная реакция без углевода), 1 мМ KH2PO4, 5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 0.15 мкг RK
100
80
и О X
<
60
40
20
BTthPRPPSI
I I
Rib-5P 2dRib-5P Ara-5P Контроль
Рис. 6. Субстратная специфичность PRPP-синтетаз в отношении различных 5-фосфатов углеводов. Реакции проводили при температуре 75°C в смеси объемом 0.5 мл (20 мМ Трис-HCl, pH 8.0), содержащей 1 мМ ATP, 1 мМ 5-фосфата углевода (контрольная реакция без углевода), 5 мМ MgCl2, 10 мМ KH2PO4, 0.75 мкг PRPPS. Rib - D-рибоза, 2dRib - 2-дезокси-О-рибоза, Ara - D-арабиноза
Таблица 3. Субстраты APR-трансферазы
Основание Конверсия за 24 ч, % MS продукта, [M+H]+
2,6-Диаминопурин 16.8 363.0786 (расч. 363.0813)
2-Хлораденин 97.6 382.0257 (расч. 382.0314)
2-Фтораденин 36.5 366.0564 (расч. 366.0611)
Аденин 50.0 348.0677 (расч. 348.0704)
2-Метоксиаденин 60.9 378.0812 (расч. 378.0809)
Nl-Метиладенин 78.2 362.0843 (расч. 362.0800)
Ы6-Бензиладенин 1.9 438.1117 (расч. 438.1173)
2-Аминобензимидазол 0.1 346.0796 (расч. 346.0799)
1,2,4-Триазол-3-карбокси-N-метиламид 0 -
Гуанин 0 -
Гипоксантин 0 -
7-Дезаза-2,6-диаминопурин 0 -
Примечание. Условия реакций: реакционные смеси (0.5 мл; 20 мМ Трис-НС1, рН 8.0, 75°С) содержали 0.4 мМ гетероциклического основания, 0.4 мМ PRPP, от 0 до 5 мМ МдС12, 1.25 мкг TfhAPRT.
Данные по синтезу нуклеотидов с помощью TthAPRT приведены в табл. 3.
Из приведенных в табл. 3 данных очевидно, что TthAPRT специфична в отношении 6-аминопури-нов. Хорошими субстратами оказались 2-хлораденин, ^-метиладенин, 2-метоксиаденин. Не обнаружено ферментативной активности в реакциях с гипок-сантином, гуанином, ^-бензиладенином, амино-бензимидазолом и 1,2,4-триазол-3-карбокси-N-метиламидом. В реакциях с 2-хлораденином равновесие оказалось сильно смещено в сторону образования нуклеотида (98% через 1 сут). Реакцию
проводили при 75°С, что в случае 2-хлораденина предпочтительней, ввиду его плохой растворимости. 2,6-Диаминопурин также оказался субстратом, в то время как в реакции с его 7-дезазааналогом образования продукта не наблюдалось, что говорит о необходимости атома азота в седьмом положении пурина.
После определения субстратной специфичности TthAPRT осуществлен каскадный синтез 2С1-АМР и 2F-AMP из соответствующих гетероциклических оснований и О-рибозы. Результаты представлены на рис. 7. Процесс каскадного синтеза нуклеотидов
О о 10 20
Время, ч
Рис. 7. Каскадный синтез 2CI-AMP и 2F-AMP из соответствующих гетероциклических оснований и D-рибозы. Реакционные смеси объемом 250 мкл содержали: 0.5 мМ D-рибозы, 1 мМ ATP, 0.4 мМ гетероциклического основания (2-хлор- или 2-фтор-аденина), 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ KH2PO4, 75°C, 0.3 мкг TspRK, 1.1 мкг TthPRPPSI, 0.25 мкг TthAPRT
контролировали с помощью хроматомасс-спектро-метрического анализа реакционной смеси, пробы отбирали через 1, 2, 24 ч от начала процесса. На рис. 8 приведены масс-спектры целевых продуктов.
Таким образом, на примере получения 2-хлор-(фтор)-аденозинмонофосфата (2С1-АМР и 2F-AMP) показана возможность использования системы термофильных ферментов для получения биологически активных нуклеотидов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования полиферментативного каскада термофильных ферментов нуклеинового обмена -рибокиназы, фосфорибозилпирофосфатсинтетазы и аденин-фосфорибозилтрансферазы для получении модифицированных нуклеотидов. Применение данного подхода создает предпосылки для замены химических методов получения нуклеотидов биокаталитическими. •
Авторы выражают благодарность Российскому научному фонду (РНФ проект № 14-50-00131) за финансовую поддержку работы.
А
хЮ 4
г-
1.S-10,5
в-
1 70.0211
зег 35 3
91 ftdll
I
L I i I L i 763.0606
IBB 150 2BB 25В 300 350 <00 150 500 55В EBB 65В 700 75В
Масса/заряд, m/z
21 . 1 -.А 1*1-
Я- ,6-
.4- Й-0- 366.0564
1 , 731 103
Ii 1 Ш5ТО *3f3 1 • 1 .1 1
' lis 1^0 1 -5 2ba 225 ЙО 275 300 'dl 6 350 Э 5 4ÖG 425 4M 4 'S 500 5 ■5 575 «Ö S25 650 6 5 700 ?i 5 7äü 7i5
Масса/заряд, m/z
Рис. 8. Масс-спектр продукта каскадного синтеза нуклеотида - 2С1-АМР, C10H13N5O7P1Cl1, [М + H]+ = 382.0328, [М-P-Rib]* = 170.0230 (А) и 2F-AMP, C10H13N5O7P1F1, [М + H]+ = 366.0564, [M-P-Rilb]+= 154.0511 (Б)
Б
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nelson D.L., Cox M.M. Nucleotides and Nucleic Acids. Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed. N.Y.: Worth Publ., 2000. 1255 с.
2. Bruce A. Molecular Biology of the Cell. N. Y.: Garland Publ., 2000. 974 с.
3. Scharer O.D. // Angew Chem. Int. Ed. Engl. 2003. V. 42. № 26. P. 2946-2974.
4. Jordheim L.P., Durantel D., Zoulim F., Dumontel C. // Nat. Rev. Drug Discov. 2013. V. 12. № 6. P. 447-464.
5. De Clercq E. // Rev. Med. Virol. 2009. V. 19. № 5. P. 287-299.
6. Diop-Frimpong B., Prakash T.P., Rajeev K.G., Manoharan M., Egli M. // Nucl. Acids Res. 2005. V. 33. № 16. P. 5297-5307.
7. Famulok M., Hartig J.S., Mayer G. // J. Chem. Rev. 2007. V. 107. № 9. P. 3715-3743.
8. Peng C.G., Damha M.J. // Nucl. Acids Res. 2007. V. 35. № 15. P. 4977-4988.
9. Golden J., Motea E., Zhang X., Choi J.S., Feng Y., Xu Y., Lee I., Berdis A.J. // ACS Chem. Biol. 2013. V. 8. № 11. P. 2452-2465.
10. Lakshman M.K. Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine. Weinheim: Wiley-VCH, 2008.
684 с.
11. De Clercq E. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2011. V. 51. P. 1-24.
12. Cen Y., Sauve A.A. // Nucleos. Nucleotides. Nucleic Acids
2010. V. 29. № 2. P. 113-122.
13. Mikhailopulo I.A., Miroshnikov A.I. // Mendeleev Commun.
2011. V. 21. P. 57-68.
14. Vineyard D., Zhang X., Donnelly A., Lee I., Berdis A.J. // Org. Biomol. Chem. 2007. V. 5. № 22. P. 3623-3630.
15. Stein C.A., Cheng Y.C. // Science. 1993. V. 261. № 5124. P. 1004-1012.
16. Motea E.A., Lee I., Berdis A.J. // Nucl. Acids Res. 2012. V. 40. № 5. P. 2357-2367.
17. Mikhailopulo I.A. // Curr. Org. Chem. 2007. V. 11. № 4. P. 317-335.
18. Wintersberger E. // Biochem. Soc. Trans. 1997. V. 25. № 1. P. 303-308.
19. Tesmer J. J., Klem T. J., Deras M.L., Davisson V.J., Smith J.L. // Nat. Struct. Biol. 1996. V. 3. № 1. P. 74-86.
20. Kim M.-J., Whitesides G.M. //Appl. Biochem. Biotech. 1987. V. 1. № 6. P. 95-108.
21. Scism R.A., Stec D.F., Bachmann B.O. // Org. Lett. 2007. V. 9. № 21. P. 4179-4182.
22. Scism R.A., Bachmann B.O. // ChemBioChem. 2010. V. 11. № 1. P. 67-70.
23. Nagy M., Ribet A.M. // Eur. J. Biochem. 1977. V. 77. № 1. P. 77-85.
24. Lee D., Moffatt B.A. // Physiologia Plantarum. 1993. V. 87. № 4. P. 483-492.
25. Zhou X., Mikhailopulo I.A., Cruz-Bournazou N., Neubauer P. // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2015. V. 115. P. 119-127.
26. Zhou X., Szeker K., Jiao L.-Y., Oestreich M., Mikhailopulo I.A., Neubauer P. // Adv. Synthesis & Catalysis. 2015. V. 357. № 6. P. 1237-1244.
27. Taran S.A., Verevkina K.N., Feofanov S.A., Miroshnikov A.I. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2009. V. 35. № 6. P. 739-745.
28. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.
29. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
30. Park J., van Koeverden P., Singh B., Gupta R.S. // FEBS Lett. 2007. V. 581. № 17. P. 3211-3216.
31. Kadziola A., Jepsen C.H., Johansson E., McGuire J., Larsen S., Hove-Jensen B. // J. Mol. Biol. 2005. V. 354. № 4. P. 815-828.
