CC BY
20
УДК 547.963.32:577.3
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ КОНЦЕНТРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ И АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ПУРИНОВОГО МЕТАБОЛИЗМА ШТАММА ESCHERICHIA COLI С ДЕЛЕЦИЕЙ СУБДОМЕНА ИНОЗИН 5Г-МОНОФОСФАТ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
М. А. Пимкин12, А. С. Соловьев1, Ю. С. Пимкина12, Дж. Д. Маркам2
1 Смоленская государственная медицинская академия 2 Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA
Инозин 5^-монофосфат дегидрогеназа (ИМФДГ) - фермент, участвующий в биосинтезе гуаниловых нуклеотидов. В дополнение к каталитическому домену, содержащему активный центр фермента, в структуре ИМФДГ выделяют эволюционно консервативный CBS- домен (субдомен), функция которого неизвестна. Аминокислотные замены в структуре субдомена ИМФДГ-1 человека ассоциированы с развитием пигментного ретинита, однако, как и полное удаление всего субдомена, не влияют на каталитическую функцию ИМФДГ. Для изучения in vivo функции субдомена ИМФДГ нами был создан штамм Escherichia coli MP101 c делецией хромосомной нуклеотидной последовательности, кодирующей субдомен. Полученные данные свидетельствуют о важной роли субдомена в поддержании физиологического пула АТР.
Инозин 5Г-монофосфат дегидрогеназа (ИМФДГ1; IMP:NAD оксидоредуктаза; E.C. 1.2.1.14) катализирует окисление инозин 5Г-монофосфата (IMP) в ксантозин 5Г-монофосфат (XMP), который далее превращается в гуанозин 5Г-монофосфат (GMP) в ходе реакции, катализируемой GMP син-тетазой (ГМФС) [1]. С метаболической точки зрения фермент ИМФДГ расположен в месте разветвления путей биосинтеза пуриновых нуклеотидов и направляет IMP по пути синтеза гуаниловых, нежели адениловых нуклеотидов [2]. Теоретически, таким образом, ИМФДГ может регулировать внутриклеточные концентрации (пулы) как адениловых, так и гуаниловых нуклеотидов. Вещества, ингибирующие ИМФДГ, используются в качестве препаратов антивирусного, иммуносупрессивно-го и противоопухолевого рядов, среди которых есть как клинически используемые препараты, так и препараты, находящиеся в стадии разработки .
В типичном случае клетка располагает несколькими источниками IMP [2]: 1) синтез IMP de novo путем последовательной сборки пуриново-го гетероцикла на основе рибозо-5-фосфата; 2) получение IMP путем дезаминирования AMP или восстановления GMP; 3) пуриновое основание ги-
поксантин является прямым предшественником IMP и может быть превращено в IMP путем присоединения к нему рибозо-5-фосфата. Таким образом, IMP может быть получен путем превращения «готовых» пуриновых нуклеотидов, нуклеозидов и оснований или синтезирован de novo из более простых, негетероциклических компонентов; во всех случаях предшественником рибозо-5-фос-фатной группировки IMP является 5-фосфорибо-зил 1-пирофосфат (PRPP) .
Мономер ИМФДГ составляют около 400 аминокислот. Коровый (каталитический) домен представляет собой (а/р)8-ствол, размером ~40 Ч 40 Ч 50 Е, где расположен активный центр фермента [3]. Среди белков, основным компонентом которых является (а/р)8-ствол, структура ИМФДГ уникальна наличием дополнительной структуры: CBS-домена (субдомена), состоящего из около 120 аминокислот, расположенных во вторичной структуре фермента между спиралью а2 и бета-цепью Р3. Несмотря на почти абсолютную консервативность субдомена ИМФДГ у представителей всех четырех царств клеточных организмов, его функциональное назначение остается неизвестным [3, 4]. С точки зрения первичной структуры субдомен остоит из двух
1Список сокращений: ИМФДГ, инозин 5Г-монофосфат дегидрогеназа; ТСХ, тонкослойная хроматография; АСС, аденилосукцинат синтетаза; ГМФР, гуанозин 5Г-монофосфат редуктаза; ГМФС, гуанозин 5Г-монофосфат синтетаза; PRPP, 5-фосфорибозил 1-пирофосфат; ФЭИ-целлюлоза, фосфоэтилениминцеллюлоза
тандемных повторов консервативной последовательности, называемой CBS. Свое название CBS последовательности получили благодаря гомологии с ферментом цистатионин ß-синта-зой (cystathionine ß-synthase). CBS последовательности всегда встречаются в виде тандемных повторов, которые получили название «CBS -домены», или «домены Бейтмана» [4].
Лишь в 2002 г функциональная значимость субдомена ИМФДГ нашла подтверждение, когда были описаны несколько семей пациентов с аутосом-но-доминантным пигментным ретинитом (RP10), ассоциированным с точковыми мутациями в гене ИМФДГ-1, в последовательности, кодирующей субдомен [5]. В одном случае была обнаружена замена Arg224 на Pro [6], в другом - замена Asp226 на Asn [5]. Несколько позже связь с RP10 была показана и для других аминокислотных замен в структуре CBS-домена, а также для одной аминокислотной замены в коровой структуре [7]. Данные мутации не влияют на ферментативную активность ИМФДГ [7], однако могут оказывать влияние на фолдинг и стабильность фермента [8]. В целом имеющиеся данные позволяют с уверенностью утверждать, что интактность субдомена не является обязательным условием для сохранения нормальной функции фермента in vitro [4]. Например, удаление всего субдомена с заменой его на цепочку из 4 аминокислот не повлияло на ферментативную активность очищенных препаратов ИМФДГ-2 человека [9]. Удаление субдомена ИМФДГ T. foetus привело лишь к снижению kcat на 30% от нормы, Km при этом оставалась нормальной; удаление CBS-домена не повлияло на структуру корового домена [10].
Согласно принципу A. Krogh [11], для изучения любой физиологической функции существует или может быть создан оптимальный организм. Для in vivo изучения функции субдомена ИМФДГ нами был сконструирован штамм Escherichia coli, у которого хромосомная последовательность, кодирующая CBS-домен ИМФГ и располагающаяся внутри последовательности корового домена, была удалена без смещения рамки считывания корового домена. Результаты измерений внутриклеточных концентраций (пулов) нуклеотидов и активностей ферментов пуринового метаболизма указывают на важную роль субдомена ИМФДГ в in vivo регуляции обмена адениловых нуклеотидов.
Материалы и методы
Штамм E. coli MP101 guaBACBS был сконструирован на основе штамма E. coli BW25113 с применением технологии рекомбинирования [12]. На первом этапе нуклеотидная последовательность, кодирующая CBS-домен в стуктуре хромосомно-
го гена guaB (аминокислотные остатки №№ 116
- 23В в структуре ИМФДГ), замещалась геном канамицин фосфотрансферазы (Kan), фланкированным FRT-последовательностями (сайтами распознавания FRT-рекомбиназы). На втором этапе рекомбинации ген канамицин фосфотрансферазы «вырезали» действием FRT- рекомби-назы. Данный метод оставляет на месте замещаемого сегмента хромосомной ДНК -. «шрам»: нуклеотиную последовательность одной копии FRT-сайта, соответствующую открытой рамке считывания из 24 аминокислотных остатков (GAA SKFLYFLENRNFGIGTKEDIH).
Измерение внутриклеточных концентраций нуклеотидов (нуклеотидных пулов) проводили методом мечения экспоненциально-растущих клеток E. coli в минимальной среде с добавлением радиоактивного изотопа фосфора в виде H333PO4 [13]. Культуру E. coli выращивали в минимальной среде MOPS [14] в течение 12-16 часов с ограничивающими рост концентрациями глюкозы (0,05 %). В типичных случаях рост культуры отстанавливался на показателе оптической плотности 0.7 - 0.8. Клетки осаждали центрифугированием и разводили до оптической плотности 0,1 - 0,3 свежей средой MOPS с концетрацией глюкозы 0,4 % и добавлением до 30 мк^/мл 33Pi- ортофосфорной кислоты (40
- 150 м^/мг). В присутствии 33Pi клетки выращивались до оптической плотности 0,5 - 0,6.
Для получения клеточных экстрактов, содержащих нуклеотиды, применяли метод кислотной экстракции без отделения клеток от среды [13]. Порции экспоненциально-растущей культуры смешивались с холодной муравьиной кислотой до ее конечной концентрации 0,5N. Смесь встряхивали и немедленно помещали в низкотемпературный холодильник (-800C). Для разделения, визуализации и измерения меченых нуклеотидов смеси применялся метод двухмерной тонкослойной жидкостной хроматографии на фосфоэтиленимин-целлюлоз-ных пластинах [13]. От 2 до 6 мкл экстракта наносили на хроматографическую пластину размером 20 х 20 см. Хроматограмму высушивали, промывали в 100% метаноле, затем вновь высушивали. Разделение проводили в растворе 1-го измерения (0.75 M Tris, 0.45 M HCl), после чего хроматограм-ма вновь промывалась в 100% метаноле и высушивалась. Для 2-го измерения использовался раствор, содержащий 74 г (NH4)2SO4, 0.4 г (NH4)HSO4, 4 г Na2EDTA на 100 мл H2O. После 2-го разделения пластина промывалась в 100% метаноле в течение 20 мин и высушивалась. Радиоавтографы получали экспозицией хроматографической пластины с радиочувствительным phosphorimaging-экраном компании Fujifilm. Компьютерная программа MultiGauge компании Fujifilm использовалась для измерения
и нормализации сигнала «пятен» хроматограмм, соответствующих индивидуальным нуклеотидам.
Абсолютные клеточные конценрации ATP измеряли с использованием люциферазного анализа в составе набора Enliten Luciferase ATP Assay System (компания Promega, США). Объем клетки E. coli был принят за 0.8285 мк3 в соответствии с ранее опубликованными данными [15]. Концентрации прочих нуклеотидов были установлены путем сравнения интенсивности полученнного от соответствующих пятен радиосигнала с интенсивностью сигнала от ATP [13].
Для получения белковых экстрактов клеточную культуру объемом 1 - 2 л, находящуюся в экспоненциальной фазе роста, осаждали центрифугированием. Полученную клеточную массу промывали раствором для экстракции (100 мМ Tris-HCl, pH 8.1, 2 мМ Na2EDTA, 0.1 мМ DTT, 30 мкМ PMSF), вновь осаждали центрифугированием и ресус-пендировали в том же растворе до плотности ~ 1011 КОЕ/мл. Клетки лизировали аппаратом French pressure cell press. Полученный лизат фильтровали через 0,2 мк вакуумный фильтр (Millipore, США) и подвергали диализу с использованием раствора для экстракции (см. выше) при 40C в течение 12 - 16 часов. Общую концентрацию белка в препаратах определяли методом Bradford protein assay (BioRad, США) [16].
Для измерения активности ИМФДГ использовали 0,02 - 0,03 мг белка клеточного экстракта в реакционной смеси, содержащей 100 мМ Tris-HCl, pH 8.1, 10 мМ KCl, 0.1 мМ DTT, 0.1 мМ NAD, 0.1 мМ IMP. Формирование продукта реакции, XMP, отслеживали спектрофотомет-рически по увеличению поглощения на 290 нм (е= 5.4 мМ-1 см-1) [17].
Активность АСС измеряли с использованием ^"^-IMP в качестве субстрата с последующим ТСХ-разделением радиомеченых продуктов реакции. ß^^-IMP был приобретен у компании Moravek Biochemicals, США. Реакционная смесь (25 мкл) отличалась от ранее опубликованной [18] более высоким содержанием GTP и состояла из 50 мМ HEPES, pH 7.0, 8 мМ ацетата магния, 0.2 мМ [8-14C]-IMP, 1.5 мМ GTP, и 8 мМ аспартата. После добавления в предварительно нагретую до 370C реакционную смесь 5 мкл экстракта (35 - 50 мкл белка) реакцию инкубировали при 370C в течение 5 мин, после чего для остановки реакции добавляли 11 N раствор муравьиной кислоты до концентрации 0,5 N и встряхивали. Реакционная смесь затем подвергалась центрифугированию при 10000 х g в течение 10 мин для осаждения преципитированного белка. Два мкл полученного супернатанта наносились на ФЭИ-целлюлозные ТСХ-пластинки и разделялись в 0.75 MTris, 0.45 M HCl [13].
Для измерения активности ГМФР пользовались методом Nakamura et al. [19] c незначительными изменениями. [8"14С]-GMP был приобретен у компании Moravek Biochemicals, США. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 100 мМ Tris-HCl, pH 7.24, 1 мМ EDTA, 6.6 мМ NADPH, 4 мМ DTT, 0.2 мМ [8-14C]-GMP (12 ма/ммоль). После добавления 5 мкл экстракта (35 - 50 мкг белка) реакцию инкубировали при 370C в течение 10 и 20 мин. Остановка реакции, центрифугирование и нанесение на ФЭИ-целлюлозные ТСХ пластинки проводили так же, как и при измерении активности АСС. ТСХ проводили в 0.85 M растворе KH2PO4, pH 3.4.
Результаты и обсуждение
Для создания штамма E. coli с удаленной хромосомной последовательностью, кодирующей CBS- домен ИМФГ (E. coli MP101 guaBACBS), мы воспользовались сравнительно недавно открытой технологией двухэтапного «рекомбинирования» [12]. В качестве родительского штамма использовали E. coli BW25113 [12]. Хромосомная последовательность CBS-домена была замещена на открытую рамку считывания из 24 аминокислот. Как и ожидалось, штамм E. coli MP101 guaBACBS характеризовался идентичной дикому типу скоростью роста на насыщенных средах (LB, TY) и минимальных средах (MOPS, М9), что свидетельствует о сохранении in vivo каталитической функции ИМФДГ, несмотря на полное удаление субдомена фермента.
Для измерениее пулов фосфоросожержащих низкомолекулярных компонентов клетки мы воспользовались методом, разработанным в лаборатории Ames [13]. Метод позволяет проводить измерение внутриклеточных концентраций свыше 20 нуклеотидов и некоторых других фосфоросодержащих молекул путем мечения клеточной культуры радиоактивными изотопами фосфора. Результаты такого анализа штамма E. coli MP101 guaBACBS стали неожиданностью: единственным параметром, заметно отличавшимся между мутантом и диким типом, оказался пул АТР, который был в 1.8 раз выше у E. coli MP101 (таблица 1). Концентрации прочих нуклеотидов, включая гуа-нилаты, претерпели меньше изменений. Незначительное снижение пулов пуриновых и пиримиди-новых нуклеотидов E. coli MP101 guaBACBS можно объяснить повышенным синтезом АТР и возникающим вследствие этого дефицитом PRPP [20].
Активности ИМФДГ и АСС в экстрактах MP101 оказались в 2 раза ниже обнаруженных в экстрактах дикого штамма, тогда как активность ГМФР мутанта была в 3 раза ниже, чем у дикого штамма (таблица 2).
Таблица 1. Внутриклеточные концентрации (пулы) нуклеотидов E. coli MP101 и E. coli BW25113
Штамм
Пул (мМ) ± a BW25113 MP101
ATP 3.50 ± 0.20 6.19 ± 0.27
ADP 0.220 ± 0.022 0.264 ± 0.057
AMP 0.215 ± 0.078 0.255 ± 0.090
dATP 0.193 ± 0.025 0.278 ± 0.019
GTP 1.726 ± 0.132 1.228 ± 0.179
GDP 0.069 ± 0.011 0.060 ± 0.014
dGTP 0.109 ± 0.019 0.086 ± 0.031
IMP 0.386 ± 0.064 0.513 ± 0.153
NAD 0.610 ± 0.094 0.861 ± 0.154
UTP 1.163 ± 0.253 0.732 ± 0.150
CTP 0.662 ± 0.119 0.443 ± 0.068
dCTP 0.157 ± 0.049 0.105 ± 0.049
NADPH 0.071 ± 0.016 0.086 ± 0.003
(P)PPGpp 0.366 ± 0.045 0.285 ± 0.045
XMP 0.147 ± 0.015 0.203 ± 0.053
Таблица 2. Активности ИМФДГ, АСС и ГМФР в экстрактах E. coli BW25113 и E. coli MP101 при росте на минимальной среде MOPS
Ферментативная активность (нмоль/ч/мг белка)
Штамм ИМФДГ АСС ГМФР
BW25113 25.55 ± 3.43 295.56 ± 12.36 43.87 ±11.08
MP101 11.83 ±1.41 124.36 ± 15.24 14.64 ± 2.86
Сниженная активность АСС штамма-мутанта контрастирует с его увеличенным пулом АТР. Однако активность фермента, измеренная в белковых экстрактах, подвергшихся диализу, в типичном случае отражает лишь абсолютную концентрацию активных молекул фермента и не дает надежной информации о том, какова будет ферментативная активность in vivo в условиях высоких концентраций белков, усиливающих межбелковые взаимодействия, и потенциальных аллостерических регуляторов. Возможно, снижение активности АСС
представляет собой механизм компенсации, посредством которого клетка пытается ограничить увеличение пула АТР, вызванное удалением субдомена ИМФДГ
Снижение активности ИМФДГ может быть обусловлено как специфическими проявлениями мутации, так и следствием нарушенных фолдинга и/или стабильности фермента, лишенного субдомена. Анализ белковых клеточных экстрактов МР101 путем иммуноблоттинга с поликлональным анти-ИМФДГ антителом (данные не показаны) показал наличие в цитоплазме низкомолекулярных фрагментов ИМФДГ Данный результат позволяет заключить, что мутантная форма ИМФДГ подвержена усиленному протеолизу in vivo. Снижение активности ГМФР в этом случае может быть компенсаторным явлением, позволяющим снизить конверсию GMP в IMP и удержать гуанилатный пул на физиологическом уровне. Действительно, несмотря на двукратное снижение активности ИМФДГ, фермента синтеза гуаниловых нуклеотидов, гуанилатный пул МР101 остается на близком к нормальному уровне.
Несмотря на более чем полувековую историю изучения путей биосинтеза и распада пуриновых нуклеотидов, точные механизмы регуляции внутриклеточного пула АТР остаются неизвестными. Несмотря на то, что ИМФДГ является ферментом биосинтеза гуаниловых нуклеотидов и не участвует непосредственно в синтезе аденилатно-го пула, удаление субдомена ИМФДГ приводит к значительному повышению внутриклеточных концентраций АТР. Напротив, концентрации гуаниловых нуклеотидов МР101 лишь незначительно снижены, несмотря на двукратное снижение активности ИМФДГ вследствие подверженности мутантного белка протеолизу. Перечисленные изменения не сказываются на способности МР101 к росту на минимальной среде. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о специфической роли субдомена ИМФДГ в регуляции внутриклеточных концентраций АТР.
^MTEPATyPA
1. Hedstrom, L., Gan, L. IMP dehydrogenase: structural schizophrenia and an unusual base // Curr Opin Chem Biol.- 2006.- V. 10.- N. 5.- P. 520-525.
2. Zalkin, H., Dixon, J.E. De novo purine nucleotide biosynthesis // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.- 1992.- V. 42.- N. P. 259-287.
3. Zhang, R., Evans, G., Rotella, F.J., Westbrook, E.M., Beno, D., Huberman, E., Joachimiak, A., Collart, F.R. Characteristics and crystal structure of bacterial inosine-5'-monophosphate dehydrogenase // Biochemistry.- 1999.- V. 38.- N. 15.- P. 4691-4700.
4. Ignoul, S., Eggermont, J. CBS domains: structure, function, and pathology in human proteins // Am J Physiol Cell Physiol.- 2005.- V. 289.- N. 6.- P. C1369-1378.
5. Bowne, S.J., Sullivan, L.S., Blanton, S.H., Cepko, C.L., Blackshaw, S., Birch, D.G., Hughbanks-Wheaton, D., Heckenlively, J.R., Daiger, S.P. Mutations in the inosine monophosphate dehydrogenase 1 gene (IMPDH1) cause the RP10 form of autosomal dominant retinitis pigmentosa // Hum Mol Genet. - 2002.- V. 11. - N. 5.- P. 559-568.
6. Kennan, A., Aherne, A., Palfi, A., Humphries, M., McKee, A., Stitt, A., Simpson, D.A., Demtroder, K., Orntoft, T., Ayuso, C., Kenna, P.F., Farrar, G.J., Humphries, P. Identification of an IMPDH1 mutation in autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP10) revealed following comparative microarray analysis of transcripts derived from retinas of wild-type and Rho(-/-) mice // Hum Mol Genet.- 2002.- V. 11.- N. 5.- P. 547-557.
7. Bowne, S.J., Sullivan, L.S., Mortimer, S.E., Hedstrom, L., Zhu, J., Spellicy, C.J., Gire, A.I., Hughbanks-Wheaton, D., Birch, D.G., Lewis, R.A., Heckenlively, J.R., Daiger, S.P. Spectrum and frequency of mutations in IMPDH1 associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa and leber congenital amaurosis // Invest Ophthalmol Vis Sci.- 2006.- V. 47.- N. 1.- P. 34-42.
8. Aherne, A., Kennan, A., Kenna, P.F., McNally, N., Lloyd, D.G., Alberts, I.L., Kiang, A.S., Humphries, M.M., Ayuso, C., Engel, P.C., Gu, J.J., Mitchell, B.S., Farrar, G.J., Humphries, P. On the molecular pathology of neurodegeneration in IMPDH1-based retinitis pigmentosa // Hum Mol Genet.- 2004.- V. 13.- N. 6.- P. 641-650.
9. Nimmesgern, E., Black, J., Futer, O., Fulghum, J.R., Chambers, S.P., Brummel, C.L., Raybuck, S.A., Sintchak, M.D. Biochemical analysis of the modular enzyme inosine 5'-monophosphate dehydrogenase // Protein Expr Purif.-1999.- V. 17.- N. 2.- P. 282-289.
10. Gan, L., Petsko, G.A., Hedstrom, L. Crystal structure of a ternary complex of Tritrichomonas foetus inosine 5'-monophosphate dehydrogenase: NAD+ orients the active site loop for catalysis // Biochemistry.- 2002.- V. 41.- N. 44.-P. 13309-13317.
11. Krogh, A. Progress in physiology // Am. J. Physiology.- 1920.- V. 90.- N. P. 243-251.
12. Datsenko, K.A., Wanner, B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2000.- V. 97.- N. 12.- P. 6640-6645.
13. Bochner, B.R., Ames, B.N. Complete analysis of cellular nucleotides by two-dimensional thin layer chromatography // J Biol Chem.- 1982.- V. 257.- N. 16.- P. 9759-9769.
14. Neidhardt, F.C., Bloch, P.L., Smith, D.F. Culture medium for enterobacteria // J Bacteriol.- 1974.- V. 119.- N. 3.- P. 736-747.
15. Harvey, R.J., Marr, A.G., Painter, P.R. Kinetics of growth of individual cells of Escherichia coli and Azotobacter agilis // J Bacteriol.- 1967.- V. 93.- N. 2.- P. 605-617.
16. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal Biochem.- 1976.- V. 72.- N. P. 248-254.
17. Zhou, X., Cahoon, M., Rosa, P., Hedstrom, L. Expression, purification, and characterization of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase from Borrelia burgdorferi // J Biol Chem.- 1997.- V. 272.- N. 35.- P. 21977-21981.
18. Juang, R.H., McCue, K.F., Ow, D.W. Two purine biosynthetic enzymes that are required for cadmium tolerance in Schizosaccharomyces pombe utilize cysteine sulfinate in vitro // Arch Biochem Biophys.- 1993.- V. 304.- N. 2.- P. 392-401.
19. Nakamura, H., Natsumeda, Y, Nagai, M., Shiotani, T., Weber, G. Direct assay method for guanosine 5'-monophosphate reductase activity // Anal Biochem.- 1992.- V. 206.- N. 1.- P. 115-118.
20. Petersen, C. Inhibition of cellular growth by increased guanine nucleotide pools. Characterization of an Escherichia coli mutant with a guanosine kinase that is insensitive to feedback inhibition by GTP // J Biol Chem.- 1999.- V. 274.- N. 9.- P. 5348-5356.
