CC BY
114
УДК 577.1 13.3.:577.152.1 11*205'134
Карбоциклические аналоги
инозин-5'-монофосфата:
синтез и биологическая активность
Е. С. Матюгина1, С. Н. Андреевская2, Т. Г. Смирнова2, А. Л. Хандажинская1*
1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32
2Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, 107564, Москва,
Яузская аллея,2
*E-mail: khandazhinskaya@bk.ru
Поступила в редакцию 03.08.2012
РЕФЕРАТ Осуществлен синтез 9-(4'-фосфонометокси-2'-циклопентен-1'-ил)гипоксантина и 9-(4'-фосфонометокси-2',3'-дигидроксициклопент-1'-ил)гипоксантина - изостерных карбоциклических аналогов инозин-5'-монофосфата. Показано, что синтезированные соединения способны ингибировать активность инозинмонофосфатдегидрогеназы (IMPDH II) человека (EC50 = 5 0 0 мкМ) и в концентрациях до
500 мкМ не влияют на рост Mycobacterium tuberculosis.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА карбоциклические нуклеозиды, конкурентное ингибирование, инозин-5'-монофосфат, IMPDH II человека, Mycobacterium tuberculosis.
ВВЕДЕНИЕ
Инозинмонофосфатдегидрогеназа (IMPDH, [КФ 1.1.1.205]) - один из ключевых ферментов биосинтеза de novo пуриновых нуклеотидов (GTP и dGTP). Природным субстратом IMPDH служит инозин-5'-монофосфат (IMP). IMPDH катализирует NAD+-зависимую реакцию, приводящую к образованию NADH и ксантозин-5'-монофосфата, который затем превращается в гуанозин-5'-монофосфат (GMP). Ингибирование IMPDH приводит к понижению внутриклеточного уровня гуанинсодержащих нуклеотидов, обеспечивая антимикробный, антипаразитарный, антивирусный, противоопухолевый и иммуноподавляющий эффекты [1, 2].
Существующие ингибиторы IMPDH по месту связывания с ферментом делятся на три группы: аналоги IMP, аналоги NAD+ и аллостерические ингибиторы. Модифицированные нуклеозиды, принадлежащие к первой группе, подвергаются внутриклеточному фосфорилированию и в виде 5'-монофосфатов конкурентно взаимодействуют с центром связывания IMP. Среди аналогов IMP есть обратимые ^'-моно-фосфаты рибавирина, 3-деазагуанозина, мизори-бина) и необратимые ингибиторы (5'-монофосфаты 2-винилинозина, 6-хлорпуриннуклеозида, 5-этинил-1-рибофуранозилимидазол-4-карбоксамида). Наиболее известными представителями второй группы ингибиторов являются тиазофурин, селеназофурин и микофеноловая кислота.
IMPDH человека представлена двумя изоформами - I и II, гомологичными на 84%. Фермент типа I преобладает в нормальных лимфоцитах и лейкоцитах, типа II - в активно делящихся и опухолевых клетках. Бактериальные IMPDH из разных источников значительно отличаются от фермента человека, процент гомологии составляет 30-41%. Сродство IMPDH из разных источников к одним и тем же ингибиторам может существенно различаться [2]. Например, IMPDH II человека более чувствительна к микофеноловой кислоте (К = 7 нМ), чем IMPDH I (К = 33 нМ), а активность данного соединения в отношении бактериальных ферментов еще ниже (К = 0.2-20 мкМ) [2]. Селективность IMPDH в отношении ингибиторов делает этот фермент весьма привлекательной мишенью для потенциальных противоопухолевых, антимикробных и анти-паразитарных препаратов [2].
Ингибирование IMPDH из Mycobacterium tuberculosis, как показано недавно, подавляет рост этой бактерии [3]. В настоящий момент основная задача в терапии туберкулеза - поиск новых препаратов, эффективных против штаммов, устойчивых к существующим лекарственным средствам. Механизм действия новых препаратов должен отличаться от механизма уже используемых лекарств, поэтому целесообразным представляется поиск новых противотуберкулезных агентов не среди представителей известных классов антибиотиков, а среди соединений другой природы, нацеленных на иные
ферменты-мишени. Среди лекарственных средств, применяемых при туберкулезе, нет аналогов нуклео-зидов, что в сочетании с их потенциальной активностью в отношении IMPDH позволяет считать такие аналоги перспективными для изучения в качестве антимикобактериальных средств.
В представленной работе описан синтез 9-(4'-фосфонометокси-2'-циклопентен-1'-ил)-гипоксантина (1) и 9-(4'-фосфонометокси-2',3'-дигидроксициклопент-1'-ил)гипоксантина (2) (рис. 1) - изостерных карбоциклических аналогов IMP, и оценена способность соединений 1 и 2 ингибировать IMPDH II человека и подавлять рост M. tuberculosis.
экспериментальная часть
В работе были использованы коммерчески доступные реактивы и растворители («Acros», «Aldrich» и «Flu-ka»). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 («Merck») в системах: CHCl3-MeOH, 98 : 2 (система А); CHCl3-MeOH, 9 : 1 (система Б), диоксан-ПН3, 4 : 1 (система В), изопропанол-ПН3-вода, 7 : 2 : 1 (система Г). Колоночную хроматографию выполняли на силикагеле Kieselgel (40-63 мкм, «Merck»), обращенно-фазовом силикагеле Lichroprep RP-18 и ионообменной смоле DEAE-Toyopearl. Системы для элюции указаны в тексте.
УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV-1201 (Япония). Спектры :Н-ЯМР, 31Р-ЯМР регистрировали на спектрометре AMX III-400 («Bruker») c рабочей частотой 400 МГц для 1Н-ЯМР (приведены химические сдвиги относительно внутренних стандартов - Me4Si для органических растворителей и 3-(триметилсилил)-1-пропансульфонат натрия (DSS) для D2O) и 162 МГц для 31Р-ЯМР (с подавлением фосфор-протонного спин-спинового взаимодействия; приведены химические сдвиги относительно внешнего стандарта - 85% фосфорной кислоты). Химические сдвиги приведены в миллионных долях.
Исходный 6-хлор-9-(4'-гидрокси-2'-циклопентен-
1'-ил)пурин (3) был синтезирован по ранее описанной методике [4].
6-Этокси-9-(4'-гидрокси-2'-циклопентен-1'-ил)пу-рин (4)
К раствору соединения 3 (300 мг, 13 ммоль) в 10 мл этанола добавляли прокаленный К2СО3 (300 мг, 2.3 ммоль), полученную суспензию кипятили в течение 1 ч. Ход реакции контролировали посредством ТСХ (система А). Растворитель удаляли в вакууме, остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, для элюции использовали систему Б, целевые фракции концентрировали в вакууме. Выделили 220 мг (78%) продукта 4 в виде белой пены. *Н-ЯМР ^^): 8.42 (1 Н, с, Н2), 7.95 (1 Н, с, Н8), 6.34-6.33 (1 Н, м, Н2,), 5.82 (1 Н, м, Н3,), 5.34-5.32 (1 Н, м, Нг), 4.86 (1 Н, м, Н4,), 4.64-4.62 (2 Н, м, О-СН2), 3.02-2.98 (1 Н, м, На5), 2.23-2.19 (1 Н, м, НЬ5), 1.5-1.48 (3 Н, м, СН3).
6-Этокси-9-(4'-этилфосфонометокси-2'-циклопентен-1'-ил)пурин (5)
К раствору соединения 4 (230 мг, 0.93 ммоль) в 5 мл диметилформамида (ДМФА) при перемешивании в токе аргона добавляли ПаН (33.5 мг, 1.4 ммоль) и Cs2CO3 (234 мг, 0.72 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 1.5 ч при комнатной температуре, добавляли раствор этилового эфира и-толуолсульфон илоксиметилфосфоновой кислоты (334 мг, 1.8 ммоль) в 2 мл ДМФА, и раствор перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре. Ход реакции контролировали при помощи ТСХ (система В). Растворитель удаляли в вакууме, остаток хроматографировали на колонке с DEAE-Toyopearl, элюировали линейным градиентом ПН4НС03 (0-0.2 М), целевой продукт 5 элюировали 0.1 М ПН4НС03, полученный раствор концентрировали, целевой продукт выделяли на колонке с обращенно-фазовым сорбентом LiChroprep ИР-18, элюировали линейным градиентом водного этанола (0-10%), продукт элюировали 8% раствором этанола в воде. Получили 240 мг (67%) продукта 5 в виде бесцветного масла. *Н-ЯМР ф20): 8.14 (1 Н, с, Н2), 8.06 (1 Н, с, Н8), 6.34-6.32 (1 Н, м, Н2), 6.15 (1 Н, м, Н3), 5.35 (1 Н, м, Н:), 4.63 (1 Н, м, Н4), 4.38 (2 Н, м, О-СН2), 3.76-3.72 (2 Н, м, О-СН2), 3.58-3.56 (2 Н, м, О-СН2-Р), 2.89 (1 Н, м, На5), 1.80 (1 Н, м, НЬ5), 1.33-1.29 (3 Н, м, СН3), 1.15-1.11 (3 Н, м, СН3). 31Р-ЯМР (D2O): 17.99 с.
9 Q Рис. 1. Инозин-
Q 5'-монофосфат
II N Н I
О \ I и его изостер-
НО-Р"°~Д о ;N ныекарбо
ОН \ / НО-Р ^ N N циклические
ОН
imp но он 1
аналоги
6-Этокси-9-(4'-этилфосфонометокси-2',3'-дигидроксициклопент-1'-ил)пурин (6)
К суспензии фосфоната 5 (200 мг, 0.54 ммоль) в смеси растворителей диоксан-вода (10 : 1) добавляли 0.5 М раствор тетраоксида осмия в диоксане и N-метилморфолиноксид (0.3 мл, 3 ммоль). Раствор перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Ход реакции контролировали посредством ТСХ (система Г). Растворитель удаляли в вакууме, остаток хроматографировали на колонке с DEAE-Toyopearl, элюировали линейным градиентом NH4HCO3 (0-0.3 M) и далее на колонке с обращенно-фазовым силикагелем Lichroprep RP-18, элюировали водой. Выход продукта составил 74%. УФ-спектры (Н2О, рН 7) X, 252.0 нм (є 9600). *Н-ЯМР (D2O): 8.36 (1 H, с, H2), 8.Г2£» (1 H, с, H8), 4.85 (1 H, м, НД 4.23 (1 H, м, H4), 3.92-3.89 (2 Н, м, О-СН2), 3.73 (2 Н, м, О-СН2), 3.60-3.59 (2 Н, м, О-СН2-Р), 2.88-2.85 (1 H, м, HJ, 2.10 (1 H, м, Hb5), 1.37 (3 Н, м, СН3), 1.21 (3 Н, м, СН3). 31Р-ЯМР (D2O): 18.23 с.
9-(4'-Фосфонометокси-2'-циклопентен-1'-ил)-гипоксантин (1)
К суспензии фосфоната 5 (100 мг, 0.27 ммоль) в ДМФА при перемешивании в токе аргона добавляли триметилбромсилан (0.65 мл, 5 ммоль), и полученный раствор перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Ход реакции контролировали по ТСХ (система В). Реакционную смесь нейтрализовали 25% водным аммиаком, растворитель удаляли в вакууме, остаток очищали методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке с Lichroprep RP-18, элюировали водой. Выделили 70 мг (84%) продукта 1 в виде лиофилизата. :Н-ЯМР (D20): 8.39 (1 H, с, H2), 8.26 (1 H, с, H8), 6.44-6.42 (1 H, м, Н2,), 6.18-6.17 (1 H, м, H3), 5.57-5.55 (1 H, м, Hj), 4.81 (1 H, м, H4), 3.61 (2 Н, м, О-СН2-Р), 3.04 (1 H, м, Н5), 1.93 (1 H, м, HJ. 31Р-ЯМР (D2O): 16.66 с.
9-(4'-Фосфонометокси-2',3'-дигидроксициклопент-1'-ил)гипоксантин (2)
Соединение 2 получали аналогично соединению 1, исходя из соединения 6 (140 мг, 0.35 ммоль). Выделили 105 мг (81%) продукта в виде лиофилизата. УФ-спектры (Н2О, рН 7) ^max 251.0 нм (є 9300). :Н-ЯМР (D20): 8.27 (1 H, с, H2), 8.11(1 H, с, H8), 4.20 (1 H, м, HJ, 3.93 (1 H, м, H4), 3.53-3.51 (2 Н, м, О-СН2-Р), 2.81 (1 H, м, Hа5), 2.07 (1 H, м, Hb5). 31Р-ЯМР (D2O): 14.06 с.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИя
Эксперименты по изучению способности синтезированных соединений ингибировать IMPDH II человека проводила компания «NovoCib» (Франция). Соединения 1 и 2 исследовали в тестах с рекомбинантной IMPDH II человека (~0.0003 единиц актив-
ности на лунку) при 37°С в 200 мкл буфера (KH2PO4 0.1 M, pH 7.8, NAD 250 мкМ, DTT 2 мМ) на 96-луноч-ном планшете. Реакция начиналась с добавления субстрата, IMP, в концентрации 250 мкМ. До начала реакции соединения инкубировали в буфере с IMPDH
II в течение 5 мин. Поглощение измеряли при 340 нм, на приборе iEMS Reader MF («Labsystems», Финляндия). В качестве положительного контроля использовали рибавирин. Влияние синтезированных соединений на активность IMPDH II человека тестировали одновременно в двух аналогичных экспериментах.
Противотуберкулезная активность
Препараты испытывали на чувствительном к противотуберкулезным препаратам лабораторном штамме M. tuberculosis H37Rv. Микобактерии были переведены в суспензию одиночных клеток в одинаковой фазе роста и стандартизованы по КОЕ [5]. Использовали обогащенную жидкую питательную среду Дюбо («Difco»).
Оценка эффективности препаратов
Влияние препаратов на рост штамма микобактерий изучали с помощью автоматической системы детекции роста Bactec MGIT 960 («BD», США). Суспензию микобактерий (500 мкл) инокулировали в 7.9 мл питательной среды. Конечная концентрация M. tuberculosis в образце составляла 106 КОЕ/мл. Анализировали по три повторности каждой пробы (концентрации), включая контрольные пробы без препарата. Анти-микобактериальное действие препаратов оценивали методом пропорций в формате TB Exist [6]. При тестировании этим методом сравнивают рост микобактерий, культивируемых с анализируемым препаратом, и рост контрольной культуры, разведенной в 100 раз по сравнению с опытной. Культура считается чувствительной (а соединение действующим) к такой концентрации препарата, при которой показатели роста в опыте не превышали 100 относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) при достижении 400 ОЕФ в контроле. Кроме того, методом абсолютных концентраций оценивали влияние соединений в концентрациях, меньших минимальной ингибирующей концентрации (МИК) на жизнеспособность микобактерий, по задержке роста культуры по сравнению с контролем. Рост культуры определяли автоматически с интервалом 1 ч, регистрировали с помощью программного обеспечения Epicenter («BD», США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
За последние десятилетия карбоциклические нукле-озиды стали объектом интенсивного изучения. Оказалось, что они обладают биологической активностью, в частности противовирусной и противоопухолевой
Н Oy-N N
ОС,Н
НО
N
2П5
125
3
О
<"NT "У
N'
б
4
0
II S' НО—Р
1
ос
ОС2Н5
fNxS
1 в
я,--. —•' 5 -------
0
Us
но-р
1
ос2н5
ОС2Н5
<"“Х^
6
но он
0
II/-
но-р
1
он
о
М"ЧИ
0
Iі У~
но-р
1
он
И N
но
111
он
NH
1 10 100 Концентрация, мкМ
1000
Схема. а — Этанол (абс.), K2CO3, кипячение 1 ч; б - NaH, TosOCH2P(O)(OC2H5)OH, Cs2CO3, ДМФА; в - OsO4, NMMO, диоксан; г - (CH3)3SiBr, ДМФА
[7]. Такие нуклеозиды узнаются многими ферментами и рецепторам, поскольку их структура сходна со структурой природных нуклеозидов, и при этом обладают повышенной стабильностью к расщеплению С-П-связи фосфорилазами и гидролазами.
В качестве карбоциклического фрагмента в соединениях 1 и 2 используется гидроксицикло-пентен. Аналоги с этим фрагментом называются 5'-норкарбоциклическими нуклеозидами. Замена первичного 5'-гидроксильного остатка на вторичный 4'-гидроксил приводит к понижению токсичности за счет потери субстратных свойств по отношению к клеточным киназам. Принимая во внимание невозможность внутриклеточного фосфорилирования 5'-норкарбоциклических ну-клеозидов, мы синтезировали метиленфосфонаты 9-(4'-гидроксициклопентен-1'-ил)гипоксантина и 9-(4',2',3'-тригидроксициклопент-1'-ил)гипоксан-тина (схема). Ранее было показано, что изостерные фосфонаты такого типа имитируют соответствующие монофосфаты, но существенно более устойчивы к действию гидролизующих и дефосфорили-рующих ферментов [8].
9-(4'-Гидрокси-2'-циклопентен-1'-ил)-6-хлорпу-рин 3 получали конденсацией эпоксициклопентена и 6-хлорпурина по ранее описанной методике [4]. Кипячение в этаноле соединения 3 приводило к образованию эфира 4, из которого реакцией с этиловыми эфирами тозилоксиметилфосфоновой или йодметил-
Рис. 2. Ингибирование активности IMPDH II в зависимости от концентрации соединений 1 и 2
фосфоновой кислот получали соединение 5. Эфир 5 гидролизовали до 9-(4'-фосфонилметиленокси-2'-циклопентен-1'-ил)гипоксантина 1 избытком три-метилбромсилана. Для получения монофосфоната
2 двойную связь соединения 5 окисляли тетраоксидом осмия в присутствии N-метилморфолиноксида, а затем удаляли этильные группы соединения 6 в присутствии триметилбромсилана (схема). Целевые продукты 1 и 2 очищали при помощи колоночной хроматографии на ионообменной смоле DEAE-Тоуореагі в линейном градиенте концентраций NH4HCO3. Последующую очистку от солей осуществляли на обращенно-фазовом силикагеле LiChroprep RP-18. Выход составил 84 и 81% соответственно.
Соединения 1 и 2 были проверены в качестве ингибиторов IMPDH II человека (рис. 2).
Как видно из рис. 2, карбоциклический аналог 1 в концентрации 500 мкМ подавлял активность фермента на 50% (К 474 мкМ), а соединение 2 на 35-39% (К 975 мкМ). В качестве контроля использовали монофосфат рибавирина, который ингибировал активность фермента на 50% в концентрации 2 мкМ, величина K природного субстрата IMP в данной системе составила 124.4 мкМ.
Также изучена способность монофосфонатов 1 и 2 ингибировать рост M. tuberculosis. Рост культуры M. tuberculosis H37Rv под действием соединений 1 и 2 в концентрации 2-100 мкг/мл (5-320 мкМ) был таким же, как в контроле - начало роста культур зафиксировано на 7-й день, выход в стационарную фазу роста - на 17-й. Время активного деления культуры - 10 сут. Соединение 2 лишь в концентрации
а
г
г
2
200 мкг/мл (578 мкМ) приводило к несущественной (на 2 сут) задержке начала роста культуры по сравнению с контролем.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Синтезированные 9-(4'-фосфонометокси-2'-цикло-пентен-1'-ил)гипоксантин и 9-(4'-фосфонометокси-2',3'-дигидроксициклопент-1'-ил)гипоксантин являются слабыми ингибиторами IMPDH II человека. В концентрации 20-200 мкг/мл эти соединения практически не влияют на рост культуры M. tuberculosis H37Rv in vitro, что может быть связано как с трудностью их проникновения в микобактериальную клетку из-за особенностей строения ее клеточной стенки, так и с наличием у микобактерий альтернативных
путей синтеза, необходимых для жизнедеятельности соединений. Нельзя также исключить, что IMPDH M. tuberculosis менее чувствительна к тестируемым соединениям, чем IMPDH II человека.
Авторы благодарят Л. Балакиреву и Н. Годарда из компании «NovoCib» (Франция, Лион) за биологические испытания синтезированных соединений с рекомбинантной IMPDH II человека.
Работа поддержана РФФИ (гранты № 11-04-12035-офи-м, 11-04-00603) и Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nair V., Shu Q. // Antiviral. Chem. Chemotherapy. 2007. V. 18. P. 245-258.
2. Shu Q., Nair V. // Med. Res. Rev. 2008. V. 28. № 2. P. 219-232.
3. Usha V., Hobrath J.V., Gurcha S.S., Reynolds R.C., Besra G.S. // PLoS One. 2012. V. 7. № 3. e33886.
4. Khandazhinskaya A.L., Shirokova E.A., Shipitsin A.V., Karpenko I.L, Belanov E.F., Kukhanova M.K., Yasko M.V. // Collect. Chech. Chem. Commun. 2006. V. 71. P. 1107-1121.
5. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларио-
нова Е.Е., Кузьмин А.В. // Пробл. туберкулеза и болезни легких. 2006. № 12. С. 43-48.
6. Siddiqi S.H., Rusch-Gerdes S. MGIT procedure manual for Bactec MGIT 960 TB system. Foundation for Innovative New Diagnostics, Geneva, Switzerland, 2006.
7. Matyugina E.S., Khandazhinskaya A.L., Kochetkov S.N. // Russian Chemical Reviews. 2012. V. 81. № 8. P. 729-746.
8. Wu T., Froeyen M., Kempeneers V., Pannecouque C., Wang J., Busson R., De Clercq E., Herdewijn P. // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. № 14. P. 5056-5065.
