CC BY
37
УДК 577.1 13.3
Производные 5-ариламиноурацила как потенциальные фармакологические агенты двойного действия
Е. С. Матюгина1, М. С. Новиков2, Д. А. Бабков2, В. Т. Валуев-Элистон1, К. Ванпуль3, С. Зикари3, А. Корона4, Е. Трамонтано4, Л. Марголис3*, А. Л. Хандажинская1**, С. Н. Кочетков1 1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32
2Волгоградский государственный медицинский университет, 400131, Волгоград, пл. Павших Борцов, 1
3Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA
4Department of Life and Environmental Sciences, University of Cagliari, Monserrato, 09042, Italy *E-mail: margolil@helix.nih.gov "E-mail: khandazhinskaya@bk.ru Поступила в редакцию 27.01.2015
РЕФЕРАТ Показано, что производные 5-ариламиноурацила, ранее продемонстрировавшие способность в концентрации 5-40 мкг/мл ингибировать рост Mycobacterium tuberculosis, являются также неконкурентными ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ-1, не проявляющими токсичности in vitro (на клетках МТ-4) и ex vivo (ткань миндалин человека).
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА производные 5-(фениламино)урацила, 5'-норкарбоциклические аналоги нуклеозидов, сочетанные инфекции ВИЧ и Mycobacterium tuberculosis, двойное действие.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ТБ - туберкулез; ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения; СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита; ННИОТ ВИЧ - ненуклео-зидный ингибитор обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека.
ВВЕДЕНИЕ
На сегодняшний день ВИЧ-инфекция и туберкулез (ТБ) считаются основными причинами смертности от инфекционных заболеваний в мире. Согласно последним оценкам ВОЗ, в 2013 году туберкулезом заболели 9 млн человек, умерли - 1.5 млн (из них у 360000 ТБ был ассоциирован с ВИЧ) [1]. В 2013 году в мире насчитывалось 35 млн больных СПИДом. В 2013 году ВИЧ-инфекция была выявлена у 2.1 млн человек, от СПИДа умерли 1.5 млн, причем ТБ остается основной причиной смерти больных с двойным инфицированием (66.5%) [2]. У ВИЧ-инфицированных повышен риск реактивации латентной формы туберкулеза (50% по сравнению с 10%), у больных ТБ ВИЧ-инфицированных отмечается высокий риск летального исхода. ВИЧ-инфицированные лица, принимающие противотуберкулезные препараты в стандартном 6-месячном режиме, имеют больший риск развития рецидива, чем
больные туберкулезом, получающие более длительный курс терапии [3]. Таким образом, одновременное заражение ТБ и ВИЧ представляет собой очень серьезную проблему и делает актуальным поиск препаратов двойного действия.
Недавно нами было показано, что определенные производные 5-ариламиноурацила обладают способностью влиять на активное деление клеток Mycobacterium tuberculosis. Полное ингибирование роста микобактерий соединениями (2), (3), (6), (7), (10), (15)-(17) и (19) (рис. 1) наблюдалось в концентрациях 5-40 мкг/мл, причем одно из них (19) проявило более высокую активность против штамма MS-115 с множественной лекарственной устойчивостью, включая пять основных противотуберкулезных препаратов первой линии (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол и пиразинамид), чем в отношении чувствительного лабораторного штамма H37Rv [4].
HN
сА-х
н
R
(1)—(8): Х = СН; (9)-(10): Х = N
(1): R = Н; (2): R = 3-Me; (3): R = 4-Me;
(4): R = 2,3-Me2; (5): R = 2,5-Me2;
(6): R = 4-nBu; (7): R = 4-nBuO;
(8): R = 4-PhO; (9): R = H; (10): R = 4-nBu
Рисунок 1.
(11): R = H; (12): R = Me; (13): R : (14): R = nBuO; (15): R = PhO
: nBu; (16): R = H; (17): R = Me; (18): R = nBu; (19): R = nBuO; (20): R = PhO
Данная работа посвящена оценке производных 5-ариламиноурацила в качестве ННИОТ ВИЧ и более детальному изучению токсичности представителей соединений данной группы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Соединения (1)—(20) были синтезированы как описано ранее [4].
1-(4'-Гидрокси-2'-циклопентен-1'-ил)-3-бензил-5-(фениламино)урацил (21)
К раствору соединения (11) (50 мг, 0.18 ммоль) в 5 мл диметилформамида (ДМФА) добавляли К2С03 (36 мг, 0.26 ммоль) и ВпВг (42 мкл, 0.35 ммоль). Реакционную массу перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Ход реакции контролировали при помощи ТСХ. Растворитель удаляли в вакууме масляного насоса. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюировали системой СНС13-СН3ОН (98 : 2). Получили 43 мг продукта (21) (66%) в виде желтоватого порошка. R/ = 0.32 (СНС13-СН3ОН, 98 : 2). *Н-ЯМР (СНС13): 7.50-7.49 (2Н, м, Н3, Н5-Вп), 7.32-7.23 (6Н, м, Н2„, Н3„ Н5„, Н6„, Н2, Н6-Вп3, 6.95-6.93 (2Н, м, Н5, Н4-Вп), 6.90-6.88 (1Н, т, НД 6.206.18 (1Н, м, Н2,), 6.01 (1Н, с, NH), 5.84-5.82 (1Н, м, Н3,), 5.61-5.58 (1Н, м, Нг), 5.23-5.16 (2Н, д, J = 13.70, СН2), 4.84-4.83 (1Н, м, Н4,), 2.86-2.85 (1Н, м, На5,), 1.70-1.66 (1Н, м, НЬ5,). 13С-ЯМР (СНС13): 160.80, 149.7:3 (С-4, С-2), 142.34 (С-4"), 139.24 (С-2'), 138.19 (С-4 Вп), 132.40 (С-3'), 129.63 (С-3", С-5"), 129.34 (С-3, С-5 Вп), 128.63 (С-2", С-6"), 127.91 (С-1"), 121.18 (С-1 Вп), 119.50 (С-5), 117.19 (С-6), 113.11 (С-2, С-6, Вп), 74.99 (С-1'), 61.05 (С-4'), 45.49 (С-5'), 39.94 (СН2).
1-(4'-Гидрокси-2'-циклопентен-1'-ил)-3-бензил-5-(п-метилфениламино)урацил (22)
Синтез проводили аналогично (21) исходя из соединения (12). Получили 35 мг продукта (22) (68%) в виде бело-желтого порошка. R/ = 0.43 (СНС13-СН3ОН, 98 : 2). *Н-ЯМР (СНС13): 7.50 -7.48 (2Н, м, Н3, Н5-Вп), 7.31-7.23 (4Н, м, Н2, Н4, Н6-Вп, Н5), 7.06-7.04 (2Н, м, Н_„, Н5„), 6.87-6.85 (2Н, м, Н2„, Н6„), 6.18-6.16 (1Н, м,
H2,), 5.94 (1Н, с, NH), 5.83-5.81 (1H, м, H3,), 5.58-5.56 (1H, м, Hr), 5.23-5.16 (2H, д, J = 13.76, СН2), 4.84-4.82 (1H, м, H4,), 2.87-2.83 (1H, м, HJ, 2.26 (3Н, с, СН3),
1.69-1.65 (1H,
H
3С-ЯМР (CHCl3): 160.75, 149.66
(C-4, C-2), 139.57 (C-4"), 139.14 (C-2'), 138.19 (C-4 Bn), 132.40 (C-3'), 130.14 (C-3", C-5"), 129.33 (C-3, C-5, Bn), 128.67 (C-2", C-6"), 127.88 (C-1"), 120.23 (C-1, Bn), 117.86 (C-2, C-6, Bn), 117.66 (C-5), 114.39 (C-6), 75.02 (C-1'), 61.12 (C-4'), 45.45 (C-5'), 39.94 (CH2), 20.76 (СН3).
Анти-ВИЧ-активность
Выделение рекомбинантной обратной транскрипта-зы ВИЧ-1 (гетеродимер р66/р51) и определение ее активности проводили как описано ранее [5, 6]. В качестве количественной характеристики ингибитор-ной активности соединений использовали константу ингибирования (К), рассчитанную по методу Диксона [7], для неконкурентных ингибиторов. В качестве контроля использовали ННИОТ первого поколения -невирапин.
Цитотоксичность in vitro
Препараты испытывали на цитотоксичность на культурах клеток МТ-4 с использованием автоматической системы подсчета клеток (ChemoMetec). Число жизнеспособных и мертвых клеток подсчитывали в контрольных и обработанных препаратами (6), (7) или (19) культурах. Препараты (6) и (7) тестировали в концентрациях 0.136-33 мкМ (0.035-9 мкг/мл), а препарат (19) - в концентрациях 0.272-66 мкМ (0.119-28 мкг/мл).
Жизнеспособные и мертвые клетки различали по накоплению йодата пропидия согласно инструкции производителя. Данные накапливали и анализировали с помощью программы Nucleoview (версия 1.0 ChemoMetec).
Токсичность ex vivo
Цитотоксичность препаратов (6), (7) и (19) определяли в тканях миндалин человека. Для каждой экспериментальной точки 27 тканевых фрагментов инкубировали с препаратом (19) (20 мкг/мл)
или с препаратами (6) или (7) (5 мкг/мл). Фрагменты ткани культивировали в течение 12 дней. Затем из контрольных и опытных образцов выделяли клетки, которые окрашивали комбинациями флуоресцентно меченных антител против CD3-QD605, CD4-QD655, CD8-QD705, CD25-APC, CD38-PE, HLA-DR-APC-Cy7, CXCR4-Brilliant violet 421, CCR5-PR-Cy5 CD45RA-FITC и CCR7-PE-Cy7 (Caltag Laboratories; Biolegend). Количество клеток различных фенотипов в выделенных суспензиях определяли с помощью проточной цитофлуороме-трии как описано ранее [8]. Объем анализированной суспензии контролировали с помощью бусинок Trucount (Becton Dickinson), подсчитанное число клеток нормировали по весу тканевых фрагментов, из которых они были выделены.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Структурное подобие соединений (1)—(20) синтезированным нами ранее производным урацила, которые являются ННИОТ ВИЧ [9, 10], дало нам основание предположить, что и эти вещества могут обладать сходными свойствами. Соединения (1)—(20) принадлежат к двум группам: (1)—(10) представляют собой 5-ариламинопроизводные урацила, а (11)—(20) содержат один или два дополнительных 4'-гидроксици-клопентеновых фрагмента и могут, таким образом, рассматриваться как 5'-норкарбоциклические аналоги 2',3'-дидезокси-2',3'-уридина. Несмотря на известную структурную близость с нуклеозидами, 5'-норкарбоциклические аналоги способны ингиби-ровать обратную транскриптазу ВИЧ по неконкурентному механизму, связываясь в так называемом гидрофобном «центре связывания ненуклеозидных ингибиторов» [9, 10]. Однако соединения (1)—(20), ин-гибирующие рост M. tuberculosis, не обладали способностью ингибировать обратную транскриптазу ВИЧ-1 (К. >> 200 мкМ). Единственным исключением стало соединение (15) (К. = 119 мкМ), относящееся к классу 5'-норкарбоциклических аналогов уридина.
С целью повышения анти-ВИЧ-активности представителей данного класса путем увеличения их гидрофобности были синтезированы N3-бензилпроизводные (21) и (22) (рис. 2). Эти соединения были получены с приемлемыми выходами (61-69%) реакцией исходных карбоциклических аналогов (11) и (12) с бензилбромидом в присутствии поташа. Структуры и чистота синтезированных соединений были подтверждены методами :Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии и ТСХ. Ингибиторная активность производного (22) в отношении обратной транскриптазы ВИЧ-1 оказалась несколько выше, чем у (21) (К. = 60 и >100 мкМ соответственно) и исходных соединений (11) и (12).
(11): R = H
(12): R = Me
Рисунок 2.
(21): R = H
(22): R = Me
Ранее мы оценили цитотоксичность синтезированных соединений на культурах клеток Vero, A549, Huh7 и показали, что они нетоксичны вплоть до концентрации 50 мкг/мл (CD50 >> 100 мкМ). Токсичность соединений (6), (7) и (19), проявивших наиболее выраженные противотуберкулезные свойства, мы дополнительно исследовали in vitro на культуре клеток МТ-4 и ex vivo на системе ткани миндалин человека.
На клетках МТ-4 соединения не проявили ни цито-токсических, ни цитостатических свойств в концентрациях вплоть до максимальных: 66 мкМ для (19), 33 мкМ для (6) и (7).
Оценка цитотоксичности соединений (20 мкг/мл для (19) и 5 мкг/мл для (6) и (7)) на разных типах клеток в тканевой системе показала отсутствие существенной гибели T-клеток (CD3 + ), B-клеток (CD3-), CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, а также подгрупп CD4+ лимфоцитов: наивных (CD45RA+/ CCR7 + ), центральных клеток памяти (CD45RA-/ CCR7+), эффекторных клеток памяти (CD45RA-/ CCR7-), дифференцированных эффекторных клеток памяти (Temra, CD45RA+/CCR7-), а также актированных CD4+ Т-лимфоцитов. Последние определяли как CD4+/CD25+, CD4+/CD38+ Т-клетки или CD4+/HLA-DR+. Во всех этих группах число клеток в обработанных препаратами и контрольных тканях не различалось.
Таким образом, хотя новые производные 5-ари-ламиноурацила и не показали значительной анти-ВИЧ-активности, однако, даже слабая активность соединений (15) и (22) говорит о наличии их сродства к обратной транскриптазе ВИЧ-1. Структурное подобие соединений такого типа многим высокоактивным противовирусным агентам ненуклеозидной природы, применяемым при ВИЧ-инфекции в качестве компонентов комплексной высокоинтенсивной антире-тровирусной терапии [11], в сочетании с выраженной противотуберкулезной активностью делает их интересными для дальнейших модификаций. •
Работа поддержана в рамках проекта № 13-04-91441 НИЗ совместной программы РФФИ - Национальные институты здоровья (США) и проекта РФФИ № 13-04-00742.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Global tuberculosis report 2014. WHO. http://www.who.int/ tb/publications/global_report/gtbr14_executive_summary. pdf?ua=1
2. Global HIV report 2014. WHO. http://www.who.int/hiv/data/ epi_core_dec2014.png?ua=1.
3. Nahid P., Gonzalez L.C., Rudoy I., de Jong B.C., Unger A., Kawamura L.M., Osmond D.H., Hopewell P.C., Daley C.L. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2007. V. 175. P. 1199-1206.
4. Matyugina E.S., Novikov M.S., Babkov D.A., Ozerov A.A., Chernousova L.N., Andreevskaya S.A., Smirnova T.G., Karpenko I.L., Chizhov A.O., Muthu P., et al. // Chem. Biol. Drug Design. 2015. Accepted article: DOI: 10.1111/cbdd.12603.
5. Novikov M.S., Valuev-Elliston V.T., Babkov D.A., Paramonova M.P., Ivanov A.V., Gavryushov S.A., Khandazhinskaya A.L., Kochetkov S.N., Pannecouque C., Andrei G., et al. // Bioorg. Med. Chem. 2013. V. 21. P. 1150-1158.
6. Le Grice S.F., Gruninger-Leitch F.R. // Eur. J. Biochem. 1990. V. 187. P. 307.
7. Dixon M. // Biochem. J. 1953. V. 55. № 1. P. 170-171.
8. Grivel J.-C., Margolis L. // Nature Protocols. 2009. V. 4. P. 256-269.
9. Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Babkov D.A., Novikov M.S., Ivanov A.V., Kochetkov S.N., Balzarini J., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L. // Med. Chem. Commun. 2013. V. 4. P. 741-748.
10. Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Geisman A.N., Novikov M.S., Chizhov A.O., Kochetkov S.N., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L. // Med. Chem. Commun. 2013. V. 4.
P. 1443-1451.
11. Tanaka H., Baba M., Saito S., Miyasaka T., Takashima H., Sekiya K., Ubasawa M., Nitta I., Walker R.T., Nakashima H., et al. // J. Med. Chem. 1991. V. 34. № 4. P. 1508-1511.
