CC BY
25
УДК 577.21
1-(4-Феноксибензил)-производные 5-аминоурацила и их аналоги — новые ингибиторы репликации аденовирусов человека
Н. А. Никитенко1*, Е. С. Гуреева2, А. А. Озеров2, А. И. Тухватулин1, Ф. М. Ижаева1, В. С. Прасолов3, П. Г. Дерябин1, М. С. Новиков2, Д. Ю. Логунов1
Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18
2Волгоградский государственный медицинский университет, 400131, Волгоград, пл. Павших Борцов, 1
3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32
*E-mail: nanthalia@gmail.com Поступила в редакцию 11.10.2017 Принята к печати 26.04.2018
РЕФЕРАТ Отсутствие эффективных способов лечения широко распространенных аденовирусных инфекций делает необходимой разработку новых терапевтических средств. Нами изучено ингибиторное действие новых производных 5-аминоурацила в отношении аденовирусов человека. Выявлена противоаденовирусная активность [4-(фенокси)бензил]-5-(фениламино)-6-азаурацила, 1-[4-(фенокси)бензил]-5-(морфолино)ура-цила, 1-[4-(4-хлорфенокси)бензил]-5-(морфолино)урацила и 1-[4-(4-фторфенокси)бензил]-5-(морфолино)-урацила.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аденовирусы человека, аденовирусная инфекция, ингибиторы репликации аденовирусов, производные 5-аминоурацила, репликация аденовирусов.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ HAdV - аденовирус человека; ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ГМДС - гек-саметилдисилазан.
ВВЕДЕНИЕ
Аденовирусы человека (HAdV) - безоболочеч-ные вирусы, геном которых представлен линейной несегментированной двухцепочечной ДНК [1]. Аденовирусные инфекции, которым подвержены люди всех возрастных групп, характеризуются широким распространением и высокой контагиозно-стью. Аденовирусы человека чаще всего поражают слизистые оболочки дыхательных путей [2, 3], глаз [4], желудочно-кишечного тракта [5]) и мочеполовой системы [6]. Наибольшую опасность аденовирусные инфекции представляют для пациентов с нарушениями иммунной системы (реципиентов трансплантатов гемопоэтических стволовых клеток, ВИЧ-инфицированных и др.) [7, 8], у которых аденовирусы могут вызывать развитие острых инфекционных заболеваний, приводящих к летальному исходу [9].
Селективные химиотерапевтические средства, высокоэффективные при аденовирусных инфекциях, в настоящее время отсутствуют [10]. Как правило, используют противовирусные средства широкого
спектра действия, такие, как интерферон или индукторы интерферона и препараты на основе кор-тикостероидов [11]. Однако лекарственные средства, относящиеся к группе индукторов интерферона, недостаточно эффективны из-за нечувствительности аденовирусов к интерферону. Невысокой активностью обладают и производные ацикло-нуклеотидов, например цидофовира - ^)-1-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил)цитозин [12], применение которого ограничивает высокая нефро-токсичность [13]. Таким образом, актуальным остается поиск нетоксичных химиопрепаратов, эффективных при аденовирусных инфекциях.
Цель представленной работы состояла в изучении ингибиторных свойств новых 5-аминопроизвод-ных урацила [14] в отношении аденовирусов человека. В результате анализа взаимосвязи структуры и биологической активности производных урацила, изученных ранее [15], были сконструированы и синтезированы новые производные 5-аминоурацила, предположительно являющиеся ингибиторами ДНК-
содержащих вирусов. Показано, что эти соединения с высокой эффективностью подавляют репликацию аденовирусов человека in vitro. Кроме того, изучена зависимость противоаденовирусного действия от наличия различных заместителей в структуре соединения. Так, определена ключевая роль ароматического фрагмента в выраженности ингибиторной активности исследованных соединений. Таким образом, выявлен новый тип ингибиторов репликации аденовирусов человека. Полученные данные могут послужить основой для исследований в области разработки новых средств противовирусной терапии in vivo.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Спектры ЯМР и 13С регистрировали на спектрометре Bruker Avance 400 (Bruker, Германия) (400 МГц для *H и 100 МГц для 13С) в ДМСО-D,., внутренний стандарт тетраметилсилан. Тонкослойную хроматографию выполняли на пластинах TLS Silica gel 60 F254 (Merck, Германия), используя в качестве элю-ента этилацетат. Пластины проявляли с помощью УФ-лампы VL-6.LC (Vilber, Франция). Температуры плавления измеряли в стеклянных капиллярах на приборе Mel-Temp 3.0 (Laboratory Devices Inc., США).
Исходные 5-(фениламино)урацилы и -6-аза-урацилы синтезировали согласно [16], 5-(морфолино)урацил - в соответствии с [17], 4-(фенокси)бензилбромиды получены путем бро-мирования исходных 4-(фенокси)толуолов молекулярным бромом при облучении светом в кипящем хлороформе в соответствии с [14]. Синтез исходных 1-[ю-(фенокси)алкил]-5-бромурацилов осуществляли путем конденсации эквимолярных количеств 2,4-бис(триметилсилилокси)-5-бромпиримидина и 1-бром-ю-(фенокси)алкана при нагревании до 160-170°С в течение 1 ч согласно [18].
Общий метод получения 1-[4-(фенокси)бензил]-5-амино-производных 6-азаурацила (1), (2) и урацила (соединения (3)-(5))
Суспензию 4.90 ммоль 5-амино-6-азаурацила или 5-аминоурацила и 0.1 г (1.87 ммоль) NH4Cl в 30 мл гексаметилдисилазана (ГМДС) кипятили в течение 12 ч до образования прозрачного раствора. Избыток ГМДС удаляли при пониженном давлении, остаток растворяли в 50 мл безводного 1,2-дихлорэтана, добавляли 4.94 ммоль 4-(фенокси)бензилбромида, после чего полученную смесь кипятили с защитой от влаги воздуха в течение 24 ч. Реакционную массу охлаждали до комнатной температуры, обрабатывали 10 мл изопропилового спирта, упаривали при пониженном давлении, остаток чистили флэш-хроматографией, элюируя смесью хлороформ-метанол (10 : 1).
Фракции, содержащие продукт, объединяли и упаривали досуха при пониженном давлении. Твердый остаток перекристаллизовывали из смеси этилаце-тат-гексан (2 : 1).
1-[4-(Фенокси)бензил]-5-(фениламино)-6-азаурацил (1). Выход 67%, Тпл 264-266°С, Rf 0.76 (этилаце-тат). 1Н-ЯМР (ДМСО^6), б, м.д.: 4.95 (2Н, с, СН2); 6.89-7.03 (5Н, м, Н-2', Н-3', Н-4', Н-5', Н-6'); 7.10 (1Н, т, J = 7.1 Гц, Н-4"'); 7.22 (2Н, т, J = 7.6 Гц, Н-3"', Н-5"'); 7.33 (2Н, т, J = 7.7 Гц, Н-3", Н-5"); 7.38 (2Н, д, J = 8.2 Гц, Н-2", Н-6"); 7.61 (2Н, д, J = 7.8 Гц, Н-2"', Н-6"'); 8.33 (1Н, с, №Н); 13С-ЯМР (ДМСО-Э6), б, м.д.: 52.7; 119.0; 119.1; 119.3; 122.4; 123.9; 128.9; 130.3; 130.4; 132.5; 139.8; 140.0; 148.0; 154.7; 156.8; 157.3.
1-[4-(Фенокси)бензил]-5-[(3,5-дихлорфенил)амино]-6-азаурацил (2). Выход 56%, Тпл 224.5-226°С, Rf 0.78 (этилацетат). *Н-ЯМР-спектр (ДМСО^6), б, м.д.: 4.95 (2Н, с, СН2); 6.93-6.98 (4Н, м, Н-2"', Н-4"', Н-6"', 7.10 (1Н, т, J = 6.9 Гц, Н-4'); 7.22 (2Н, т, J = 7.6 Гц, Н-3', Н-5'); 7.33 (2Н, д, J = 7.5 Гц, Н-2', Н-6'); 7.39 (2Н, д, J = 8.2 Гц, Н-3", Н-5"); 7.61 (2Н, д, J = 7.8 Гц, Н-2", Н-6"); 8.33 (1Н, с, №Н); 13С-ЯМР-спектр (ДМСО^6), б, м.д.: 31.1; 36.1; 40.3; 51.9; 116.9; 118.9; 120.9; 123.8; 130.3; 130.5; 132.0; 134.2; 139.6; 142.1; 147.9; 154.3.
1-[4-(Фенокси)бензил]-5-(морфолино)урацил (3). Выход 68%, Тпл 182-184°С, Rf 0.41 (этилацетат). *Н-ЯМР (ДМСОЪ6), б, м.д.: 2.82 (4Н, с, 2 х СН2); 3.64 (4Н, т, J = 4.4 Гц, 2 х СН2); 4.82 (2Н, с, СН2); 6.96 (2Н, д, J = 8.3 Гц, Н-2', Н-6'); 6.98 (2Н, д, J = 8.0 Гц, Н-3", Н-5"); 7.13 (1Н, т, J = 8.0 Гц, Н-4'); 7.18 (1Н, с, Н-6); 7.32-7.36 (4Н, м, Н-3', Н-5', Н-2", Н-6"); 11.37 (1Н, с, №Н). 13С-ЯМР (ДМСО^6), б, м.д.: 40.3; 50.2; 50.4; 66.3; 118.9; 119.0; 123.9; 127.2; 129.7; 130.2; 130.4; 132.3; 150.1; 156.5; 156.8; 161.2.
1-[4-(4-Хлорфенокси)бензил]-5-(морфолино)ура-цил (4). Выход 81%, Тпл 204-206°С, Rf 0.32 (этилацетат). *Н-ЯМР-спектр (ДМСО^6), б, м.д.: 2.82 (4Н, с, 2 х СН2); 3.64 (4Н, с, 2 х СН2); 4.80 (2Н, с, СН2); 6.80 (2Н, д, J = 7.6 Гц, Н-2', Н-6'2; 7.12 (2Н, д, J = 7.4 Гц, Н-3', Н-5'); 7.39 (2Н, д, J = 8.2 Гц, Н-3", Н-5"); 7.61 (2Н, д, J = 7.8 Гц, Н-2", Н-6"); 7.70 (1Н, с, Н-6); 11.42 (1Н, с, №Н). 13С-ЯМР-спектр (ДМСО^6), б, м.д.: 50.1; 50.5; 67.0; 118.8; 121.1; 122.5; 123.2; 124.5; 134.0; 134.1; 138.5; 149.8; 154.2; 160.1; 164.2.
1-[4-(4-Фторфенокси)бензил]-5-(морфолино)ура-цил (5). Выход 74%, Тпл 220-222°С, Rf 0.34 (этилацетат). Ш-ЯМР-спектр (ДМСО^6), б, м.д.: 2.85 (4Н, с, 2 х СН2); 3.66 (4Н, с, 2 х СН2); 4.79 (2Н, с, СН2); 6.79 (2Н, д, J = 7.9 Гц, Н-2', Н-6'2; 7.11 (2Н, д, J = 7.4 Гц,
Н-3', Н-5'); 7.36 (2Н, д, J = 8.2 Гц, Н-3", Н-5"); 7.60 (2Н, д, J = 7.9 Гц, Н-2", Н-6"); 7.69 (1Н, с, Н-6); 11.47 (1Н, с, N3H). 13С-ЯМР-спектр (ДМСО-D6), б, м.д.: 50.2; 50.6; 67.0; 118.8; 121.1; 122.5; 123.2; 124.5; 134.0; 134.1; 138.5; 149.8; 154.0; 154.2; 158.8; 160.1; 164.2.
Общий метод получения 1-[ю-(фенокси)алкил]-5-(морфолино)урацила (соединения (6)-(8))
Смесь 4.61 ммоль 5-бром-1-[ю-(фенокси)алкил]ура-цила и 1 мл (11.56 ммоль) морфолина кипятили в растворе 50 мл безводного этиленгликоля в течение 2 ч, охлаждали до комнатной температуры, добавляли к 250 мл холодной воды и оставляли на ночь при температуре 4оС. Образовавшийся осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из смеси этилаце-тат-гексан (3 : 1).
1-[3-(Фенокси)пропил]-5-(морфолино)урацил (6). Выход 66%, Тпл 169-170°С, Rf 0.31 (этилацетат). *Н-ЯМР-спектр (ДМСО^6), б, м.д.: 2.04 (2Н, кв, J = 6.3 Гц, СН2); 3.77 (2Н, т, J = 6.0 Гц, ^Н2); 3.87 (2Н, т, J = 5.7 Гц, СН2); 2.82 (4Н, с, 2 х СН2); 32.69 (4Н, с, 2 х СН2); 6.82-6.86 (3Н, м, Н-2', Н-4', Н-6'); 7.19 (2Н, т, J = 8.0 Гц, Н-3', Н-5'); 7.63 (1Н, с, Н-6); 11.37 (1Н, с, №Н). 13С-ЯМР-спектр (ДМСО-D6), б, м.д.: 28.0; 45.4; 50.1; 50.5; 64.6; 100.9; 112.2; 122.3; 138.6; 145.8; 151.0; 158.4; 163.9.
1-[4-(Фенокси)бутил]-5-(морфолино)урацил (7). Выход 78%, Тпл 156-159°С, Rf 0.65 (этилацетат). Ш-ЯМР-спектр^ДМСО^), б, м.д.: 1.64 (4Н, с, СН2); 3.67 (2Н, т, J = 6.2 Гц, СН2); 3.89 (2Н, т, J = 6.2 Гц, СН2); 2.85 (4Н, с, 2 х СН2); 3.66 (4Н, с, 2 х СН2); 6.79-6.83 (3Н, м, Н-2', Н-4', Н-62); 7.13 (2Н, т, J = 8.1 Гц, Н-3', Н-5'); 7.64 (1Н, с, Н-6); 11.41 (1Н, с, №Н). 13С-ЯМР-спектр (ДМСО-Э6), б, м.д.: 25.3; 25.7; 47.3; 50.4; 51.0; 66.8; 100.9; 114.4; 120.5; 129.5; 145.7; 151.0; 158.6; 165.8.
1-[5-(Фенокси)пентил]-5-(морфолино)урацил (8). Выход 71%, Тпл 162-163.5°С, Rf 0.78 (этилацетат). ^-ЯМР-спектр (ДМСО^6), б, м.д.: 1.39 (2Н, кв, J = 5.3 Гц, СН2); 1.63 (2Н, кв, J = 7.2 Гц, СН2); 1.72 (2Н, кв, J = 7.2 Гц, СН2); 3.67 (2Н, т, J = 7.2 Гц2 СН2); 3.93 (2Н, т, J = 6.5 Гц, СН2); 2.88 (4Н, с, 2 х СН2); 3.67 (4Н, с, 2 х СН2); 6.83-6.88 (3Н, м, Н-2', Н-4', Н-6'); 7.22 (2Н, т, J = 8.0 Гц, Н-3', Н-5'); 7.55 (1Н, с, Н-6); 11.29 (1Н, с, №Н). 13С-ЯМР-спектр (ДМСО-Э6), б, м.д.: 22.9; 28.6; 28.7; 47.8; 50.5; 51.0; 67.5; 101.2; 114.8; 120.8; 129.9; 146.2; 151.4; 159.0; 164.3.
Вирусы
В работе использовали рекомбинантный аденовирус человека типа 5, экспрессирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (HAdV5-eGFP) [19, 20].
Культура клеток
В работе использовали перевиваемые клетки эмбриона почки человека HEK293 [21]. Клетки линии НЕК293 культивировали на среде DMEM (Life Technologies, Великобритания), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Life Technologies, Великобритания), 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед./мл соответственно при температуре 37оС в атмосфере 5% СО2.
Тест МТТ
Клетки линии НЕК293 инкубировали в отсутствие (контроль) или в присутствии различных концентраций исследуемых соединений. Через 24-72 ч к клеткам добавляли 3-[4,5-диметилтиазолил-2-ел]-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ); итоговая концентрация МТТ составляла 0.5 мг/мл. После 2 ч экспозиции при 37°С живые клетки восстанавливали желтый МТТ до темно-фиолетовых гранул формазана. Культуральную среду убирали. Гранулы формазана растворяли в ДМСО, количество восстановленного продукта измеряли фотометрически на мультифункциональном планшетном ридере Synergy 2 Multi-Mode Reader (BioTek Instruments, США) при длинах волн 540 и 630 нм [22].
Резазуриновый метод
Клетки линии НЕК293 инкубировали в отсутствие (контроль) или в присутствии различных концентраций исследуемых соединений. Через 24-72 ч к клеткам добавляли краситель резазурин (Sigma, США), который восстанавливается митохондри-альными дегидрогеназами живых клеток до флуоресцирующего продукта резаруфина (при длинах волн возбуждения и эмиссии 530 и 590 нм). Интенсивность флуоресценции регистрировали на мультифункциональном планшетном ридере Synergy 2 Multi-Mode Reader (BioTek Instruments, США).
Определение количества копий генома аденовируса человека
Для оценки репликации HAdV5-eGFP через 24 ч после инфекции клетки собирали, выделяли суммарную ДНК с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Германия) согласно рекомендациям производителя. Количественную ПЦР проводили согласно [23] на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) с использованием реагента iTaq™ Universal Probes Supermix (Bio-Rad, США).
(1) R, = PhNH, R2 = H, X = N;
(2) R, = 3,5-Cl2C6H3NH, R2 = H, X = N;
(3) R, = морфолино, R2 = H, X = CH;
(4) R, = морфолино, R2 = Cl , X = CH;
(5) R, = морфолино, R2 = F, X = CH.
Рис. 1. Схема синтеза 1-[4-(фенокси)бензил]-производных 5-(фениламино)-6-азаурацила (1), 5-[(3,5-дихлор-фенил)амино]-6-азаурацила (2), а также 1-[4-(фенокси)бен-зил]- (3), 1-[4-(4-хлорфенокси)-бензил]- (4) и 1-[4-(4-фторфе-нокси)бензил]-производных 5-(морфолино)урацила (5)
Определение инфекционности аденовирусного потомства
Клетки линии НЕК293 заражали HAdV5-eGFP с множественностью инфекции 1 и 10 БОЕ/клетку. Через 3 ч после инфекции добавляли растворы соединений (1) и (3) (примеры 1 и 3 соответственно) в ДМСО в концентрации 25 мкМ. В качестве контроля использовали ДМСО, конечная концентрация которого в культуральной среде не превышала 0.1%. Через 48 ч культуральную среду собирали в микропробирки и замораживали при температуре -70оС. С целью разрушения клеток вируссодержащую среду размораживали при комнатной температуре и снова замораживали при -70оС. После повторного размораживания аликвоты 10-кратных разведений вируссодержащих стоков добавляли к клеткам линии НЕК293.
Статистическая обработка данных
Все данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение (СО). Статистическую значимость определяли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, США). Значение p <0.05 считали статистически значимым.
Синтез 1-[4-(фенокси)бензил]-производных 5-(фениламино)-6-азаурацила (1), 5-[(3,5-дихлор-фенил)амино]-6-азаурацила (2), а также 1-[4-(фе-нокси)бензил]- (3), 1-[4-(4-хлорфенокси)бензил]-(4) и 1-[4-(4-фторфенокси)бензил]-производных 5-(морфолино)урацила (5) был осуществлен путем конденсации 6-амино-3,5-бис(триметилсилилокси)-1,2,4-триазина или 2,4-бис(триметилсилилокси)-5-(морфолино)пиримидина с эквимолярным количеством соответствующих 4-(фенокси)бензилбромидов при кипячении в растворе безводного 1,2-дихлор-этана в соответствии с ранее описанным методом [24]. При этом выход соединений (1)-(5) составил 56-81% (рис. 1).
С целью изучения закономерности структура-противовирусная активность нами были синтезированы аналоги 5-(морфолино)-производного (3), у которых 4-(фенокси)бензильный фрагмент у № был заменен на ю-(фенокси)алкильный заместитель. Синтез соединений данной группы осуществлен путем амини-рования морфолином 5-бром-1-[ю-(фенокси)алкил] урацила при кипячении в растворе этиленгликоля в соответствии с ранее описанным методом [15]. Выход целевых 5-(морфолино)-производных урацила (6)-(8) составил 66-78% (рис. 2).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез соединений
Наиболее близкими по химическому строению к синтезированным соединениям являются 1-бензил-5-(ариламино)-производные урацила [15]. Эти соединения проявляют активность в отношении вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) и вируса Эпштейна-Барр. Это позволило нам предположить, что производные 5-аминоурацила и 5-амино-6-азаурацила, содержащие заместитель у № и являющиеся аналогами описанных соединений, могут проявлять ингибиторную активность в отношении ДНК-содержащих вирусов, в частности аденовирусов.
Цитотоксичность исследуемых соединений
Цитотоксичность соединений оценивали с помощью прижизненного окрашивания клеток линии НЕК293
(6) n = 1;
(7) n = 2;
(8) n = 3.
Рис. 2. Схема синтеза 5-(морфолино)-производных урацила (6)—(8)
1.5
о о-
ш и_
н С5 и тл <и <Р
5>
О Т! * <
<и I
1.0
и I
о
0.5
0.0
А
ДМСО (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)
Соединение
Рис. 3. Оценка относительного количества копий генома НAdV5-eGFP в клетках НЕК293 в присутствии исследуемых соединений (25 мкМ). Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы при *р < 0.05; ***р < 0.001
Таблица 1. Противоаденовирусная активность производных 5-аминоурацила
Соединение 1С „, мкМа 50' ТС п, мкМб 50 SIв
(1) 9.2 53.6 5.8
(3) 0.5 47.6 95
(4) 8.7 103.1 11.9
(5) 13.1 64.8 4.9
аКонцентрация полумаксимального ингибирования, при которой наблюдается снижение относительного количества копий генома HAdV5-eGFP на 50% по сравнению с контролем.
б Концентрация, при которой количество живых клеток сокращается на 50%. в Отношение ТС50 соединения к его 1С50.
МТТ или трипановым синим [25]. К клеткам добавляли исследуемые соединения, растворенные в диме-тилсульфоксиде, в диапазоне концентраций 2.5-200 мкМ. Контролем служили клетки, к которым вместо исследуемых соединений добавляли соответствующее количество ДМСО.
Прижизненное окрашивание клеток НЕК293 МТТ проводили через 48 ч после внесения веществ. Токсичность различных доз препарата определяли по жизнеспособности клеток относительно контроля. Все соединения в концентрациях до 25 мкМ не оказывали токсического действия на клетки НЕК293. Кроме того, была определена концентрация соединений, проявляющих ингибиторную активность в отношении аденовирусов человека, при которой количество живых клеток сокращается на 50% (ТС50). С этой целью подсчитывали клетки, селективно окрашенные трипановым синим, через 48 ч после добавления соединений. Результаты представлены в табл. 1.
Исследование противоаденовирусной активности 5-аминопроизводных урацила
В ходе оценки противоаденовирусной активности 5-аминопроизводных урацила клетки линии НЕК293 заражали рекомбинантным аденовирусом человека типа 5, экспрессирующим усиленный зеленый флуоресцентный белок HAdV5-eGFP с множественностью инфекции 1 БОЕ/клетку. Через 3 ч после инфекции добавляли исследуемые соединения в концентрации 25 мкМ: этого времени достаточно для завершения начальной стадии инфекционного цикла аденовиру-
са человека (взаимодействия вируса с рецепторами клеточной поверхности и проникновения в клетку). В качестве отрицательного контроля использовали ДМСО. Концентрация ДМСО во всех образцах не превышала 0.1%. Через 24 ч ингибиторную активность соединений оценивали по количеству копий генома HAdV5-еGFP методом количественной ПЦР [23]. Показано, что соединения (1), (3), (4) и (5) проявляют выраженную ингибиторную активность в отношении репликации HAdV5-eGFP (рис. 3).
Для соединений (1), (3), (4) и (5), обладающих ин-гибиторной активностью в отношении аденовирусов человека, была определена концентрация полумаксимального ингибирования (1С50), при которой наблюдается снижение относительного количества копий генома HAdV5-eGFP на 50% по сравнению с контролем. Клетки линии НЕК293 заражали HAdV5-eGFP с множественностью инфекции 1 БОЕ/клетку. Через 3 ч после инфекции добавляли исследуемые соединения в концентрации 0.5, 2.5, 5, 10, 15 и 25 мкМ. Концентрация ДМСО во всех образцах не превышала 0.1%. Через 24 ч ингибиторную активность соединений оценивали по количеству копий генома HAdV5-еGFP, которое определяли с помощью количественной ПЦР (рис. 4). Индекс селективности ^1) рассчитывали как отношение ТС50 соединения к его 1С50 (табл. 1). На основании количественных показателей ингибирования можно судить об эффективности противовирусного действия ряда соединений, т.е. о степени подавления репликации HAdV5-еGFP в культуре клеток НЕК293.
Л
о „
со "-Р н о4 и -Ф т т о 5 о
5 ^
О ш
ш
0
1
л
с ф
150
100
50
0
ТС50=53.6 мкМ
ДМСО 25 50 75 100 150 200 Концентрация (1), мкМ
1С50=9.2 мкМ
ДМСО 0.5 2.5 5 10 15 25 Концентрация (1 ), мкМ
ТС50=47.6 мкМ
0
ДМСО 25 50 75 100 150 200 Концентрация (3), мкМ
1С50=0.5 мкМ
ДМСО 0.5 2.5 5 10 15 Концентрация (3), мкМ
25
Рис. 4. Противоаденовирусная активность производных 5-аминоурацила. ТС50 и 1С50 соединений (1) (А) и (3) (Б). Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы при *р < 0.05; **р < 0.01
Обнаружено, что наибольший противовирусный эффект проявляет 5-(морфолино)-производное (3), 1С50 которого составила 0.5 мкМ, а SI = 95. Производные 6-азаурацила оказались либо на порядок менее активны (соединение (1)), либо вообще не проявляли ингибиторных свойств (соединение (2)). Также показано, что введение атома хлора (соединение (4)) или атома фтора (соединение (5)) в пара-положение 4-(фенокси)бензильного фрагмента существенно понижает ингибиторную активность. В то же время замена бензила в 4-(фенокси)бен-зильном фрагменте на алифатическую цепь привела к получению соединений (6)-(8), у которых полностью отсутствует противоаденовирусное действие. Данный факт свидетельствует о высокой значимости ароматического фрагмента в обеспечении противовирусных свойств исследованного ряда соединений.
Кроме того, было оценено влияние наиболее эффективных производных 5-аминоурацила - соединений (1) и (3), на инфекционность аденовирусного
Таблица 2. Титр потомства HAdV5-eGFP в клетках линии НЕК293
Множественность инфекции Соединение
ДМСО (1) (3)
М01 1 1 х 104 5.1 х 103 2.3 х 103
МО! 10 2.7 х 106 1.7 х 105 3.7 х 105
потомства HAdV5-eGFP. Наблюдали снижение титра вирусного потомства под воздействием указанных веществ (табл. 2).
На основании приведенных данных можно предположить, что механизм действия соединений исследуемого класса связан с ингибированием ключевых факторов репликации аденовирусов человека, таких,
Б
Л
[—ДМСО П Интактные клетки HEK293
|_| ДМСО □ Интактные клетки HEK293
О
т е л к
л
т
и О
е а
m
и
£
ы
со
120
100
80
60
40
20
1
3
0 10 Множественность инфекции, БОЕ/кл.
--S
к,
о т е л к ь т с о
е
а
в
и
ж
ы
со
120т □ 1
100-
80
60
40
20
0 10 Множественность инфекции, БОЕ/кл.
Рис. 5. Выживаемость клеток линии НЕК293, инфицированных HAdV5-eGFP, в присутствии 5-аминопроизводных урацила (1) и (3). А - данные, полученные с помощью МТТ-теста. Величина оптической плотности в контрольном образце интактных клеток линии НЕК293 принята за 100%. Все данные получены в ходе трех независимых экспериментов. Различия между опытными и контрольными образцами статистически значимы во всех случаях (р < 0.05). Б - данные, полученные резазуриновым методом. Интенсивность флуоресценции в контрольном образце интактных клеток линии НЕК293 принята за 100%. Все данные получены в ходе трех независимых экспериментов. Различия между образцами группы «ДМСО» и остальными образцами статистически значимы во всех случаях (р < 0.05). Статистически значимые различия между образцами интактных клеток и образцами группы «3» отсутствуют
Б
0
0
как вирусная ДНК-полимераза и продукты гена Е1А [26, 27].
В ходе эксперимента была оценена также выживаемость клеток линии НЕК293, зараженных HAdV5 с множественностью инфекции 10 БОЕ/клетку, в присутствии веществ (1) и (3) (рис. 5). Через 3 ч после заражения к клеткам добавляли растворы соединений (1) и (3) в ДМСО в концентрации 25 мкМ. Через 48 ч по данным теста МТТ выживаемость клеток при множественности инфекции 10 БОЕ/клетку составляла 74 и 59% в присутствии веществ (1) и (3) соответственно по сравнению с контролем. Эти данные согласуются с результатами, полученными при аналогичном анализе выживаемости клеток в ходе аденовирусной инфекции (MOI 10 БОЕ/клетку) с использованием резазурина. Так, под действием соединений (1) и (3) доля живых клеток не отличилась статистически значимо от доли в контрольном
образце (рис. 5). Полученные данные указывают на наличие противовирусного эффекта у исследуемых соединений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, открыт новый тип противоаденови-русных агентов ненуклеозидной природы, которые проявляют ингибирующий эффект в отношении аденовирусов человека. Возможно, соединения данного ряда окажутся перспективными в плане создания на их основе лекарственных средств, эффективных при аденовирусных инфекциях.
Работа поддержана грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук (гранты МК-1746.2017.7 и МК-2480.2017.7).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ghebremedhin B. // Eur. J. Microbiol. Immunol. 2014. V. 4. № 1. P. 26-33.
2. Gupta P., Tobias J.D., Goyal S., Hervie P., Harris J.B., Sadot E., Noviski N. // J. Intensive Care Med. 2011. V. 26. № 4.
P. 267-272.
3. Lu X., Trujillo-Lopez E., Lott L., Erdman D.D. // J. Clin. Microbiol. 2013. V. 51. № 4. P. 1089-1093.
4. Gonzalez-Lopez J.J., Morcillo-Laiz R., Munoz-Negrete F.J. // Arch. Soc. Esp. Oftalmol. 2013. V. 88. № 3. P. 108-115.
5. Eckardt A.J., Baumgart D.C. // Recent Pat Antiinfect Drug Discov. 2011. V. 6. № 1. P. 54-63.
6. Lynch J.P., 3rd, Fishbein M., Echavarria M. // Semin. Respir. Crit. Care Med. 2011. V. 32. № 4. P. 494-511.
7. Echavarria M. // Clin. Microbiol. Rev. 2008. V. 21. № 4. P. 704-715.
8. Florescu D.F., Hoffman J.A., the AST Infectious Diseases Community of Practice // Am. J. Transplant. 2013. V. 13 Suppl 4. P. 206-211.
9. Robinson C.M., Seto D., Jones M.S., Dyer D.W., Chodosh J. // Infect. Genet. Evol. 2011. V. 11. № 6. P. 1208-1217.
10. Pihos A.M. // J. Optometry. 2013. V. 6. № 2. P. 69-74.
11. Meyer-Rusenberg B., Loderstadt U., Richard G., Kaulfers P.M., Gesser C. // Dtsch Arztebl. Int. 2011. V. 108. № 27.
P. 475-480.
12. De Clercq E. // Antiviral Res. 2007. V. 75. № 1. P. 1-13.
13. Piscitelli S.C., Penzak S.R., Flexner C. // AIDS and Other Manifestations of HIV Infection / Ed. Wormser G. San Diego: Acad. Press, 2004. P. 913-930.
14. Новиков М.С., Никитенко Н.А., Озеров А.А., Гуреева Е.С., Прасолов В.С., Прокофьева М.М., Джаруллаева А.Ш., Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю. // Пат. 2628456 Российская Федерация. C07D 239/545 (2006.01), A61K 31/513 (2006.01), A61P 31/14 (2006.01) 2016.
15. Novikov M.S., Buckheit R.W., Jr., Temburnikar K.,
Khandazhinskaya A.L., Ivanov A.V., Seley-Radtke K.L. // Bioorg. Med. Chem. 2010. V. 18. № 23. P. 8310-8314.
16. Gerns F.R., Perrotta A., Hitchings G.H. // J. Med. Chem. 1966. V. 9. № 1. P. 108-115.
17. Phillips A.P. // J. Am. Chem. Soc. 1951. V. 73. № 3. P. 10611062.
18. Novikov M.S., Babkov D.A., Paramonova M.P., Khandazhinskaya A.L., Ozerov A.A., Chizhov A.O., Andrei G., Snoeck R., Balzarini J., Seley-Radtke K.L. // Bioorganic Med. Chem. 2013. V. 21. № 14. P. 4151-4157.
19. Шмаров M.M., Черенова Л.В., Шашкова Е.В., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Капитонов А.В., Неугодова Г.Л., Доронин К.К., Народицкий Б.С. // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. 2002. № 2. P. 30-35.
20. Logunov D.Y., Zubkova O.V., Karyagina-Zhulina A.S., Shuvalova E.A., Karpov A.P., Shmarov M.M., Tutykhina I.L., Alyapkina Y.S., Grezina N.M., Zinovieva N.A., et al. // J. Virol. 2007. V. 81. № 18. P. 9641-9652.
21. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C., Nairn R. // J. Gen. Virol. 1977. V. 36. № 1. P. 59-74.
22. Mosmann T. // J. Immunol. Methods. 1983. V. 65. № 1-2. P. 55-63.
23. Heim A., Ebnet C., Harste G., Pring-Akerblom P. // J. Med. Virol. 2003. V. 70. № 2. P. 228-239.
24. Babkov D.A., Chizhov A.O., Khandazhinskaya A.L., Corona
A., Esposito F., Tramontano E., Seley-Radtke K.L., Novikov M.S. // Synthesis. 2015. V. 47. № 10. P. 1413-1422.
25. Strober W. // Curr. Protoc Immunol. 2001. Appendix 3. Appendix 3B.
26. Nikitenko N.A., Speiseder T., Lam E., Rubtsov P.M., Tonaeva K.D., Borzenok S.A., Dobner T., Prassolov V.S. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 3. P. 100-107.
27. Nikitenko N.A., Speiseder T., Groitl P., Spirin P.V., Prokofjeva M.M., Lebedev T.D., Rubtsov P.M., Lam E., Riecken K., Fehse
B., et al. // Biochimie. 2015. V. 113. P. 10-16.
