Новые аналоги нуклеозидов и их 5'-трифосфаты: синтез и биологические свойства Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 577.113.3.017

НОВЫЕ АНАЛОГИ НУКЛЕОЗИДОВ И ИХ 5-ТРИФОСФАТЫ: СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Н.А. Голубева1, А.В.Иванов1'2, М.А. Иванов1, О.А. Батюнина1, А.В. Шипицын1, В.Л. Туницкая1, Л.А. Александрова1

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта; e-mail: ala2004@zmail.ru; Университет Осло, Центр медицинских исследований в России)

Синтезирован ряд бициклических фурано- и пирроло[2,3-0]пиримидиновыгх нуклеозидов и модифицированных по N1 атому и/или 6 положению пуриновых нуклеозидов. Среди нетоксичных бициклических нуклеозидов и ^-карбоксиалкиладенозинов только фуранопирими-дин с заместителем С10Н21 и ^-карбоксиметиладенозин проявили умеренную анти-ВГС активность в системе репликона вируса, а ^-гидроксиинозин - высокую анти-ВГС активность и высокую токсичность. Синтезированы 5'-0-трифосфаты полученных нуклеозидов и изучены как субстраты/ингибиторы ферментов ВПГ: РНК-зависимой РНК-полимеразы и NTP-зависимой РНК-хеликазы.

Вирус гепатита С (ВГС) относится к наиболее широко распространенным и опасным инфекциям [1, 2]. К настоящему времени известно всего несколько типов низкомолекулярных ингибиторов репликации ВГС, что делает актуальным поиск новых агентов анти-ВГС. В настоящей работе представлен синтез новых аналогов рибонуклеозидов, проверка их активности как ингибиторов репродукции ВГС в системе ВГС-репликона, а также синтез 5'-0-трифосфатов полученных нуклеозидов и изучение их как субстратов/ ингибиторов нуклеотид-зависимых ферментов ВГС: белков №5В (РНК-зависимой РНК-полимеразы) и N83 (КТР-зависимой РНК-хеликазы).

Нами была разработана схема получения ^-гид-роксиинозина (7а) в препаративных количествах окислением коммерчески доступного аденозина (5а) ■-хлорнадбензойной кислотой [7], с последующим де-заминированием аденозин ^-оксида (6а) нитритом натрия в кислой среде (схема 1) с выходом 45% (на две стадии). Ранее ^-гидроксиинозин (7а) получали окислением м-хлорнадбензойной кислотой инозина (8) N -морфолинилпуринрибозида (9) и -диметила-денозина (11) (выходы 24, 10 и <5%) [8]. Образование ^-гидроксиинозина (7а) можно объяснить либо последовательным, либо одновременным окислением по N положению и ^-экзоциклической группе пурина с образованием промежуточного соединения (10).

В литературе [9] широко представлены ^-заме-щенные производные аденозина, тем не менее аналогов с анионной группой (цвиттер-ионных структур) не описано; ^-карбоксиалкиладенозины (13а-с) синтезированы нами из 6-хлорпуринрибозида (12) реакцией с

соответствующей аминокислотой в присутствии N-этилдиизопропиламина (схема 1, 2). В безводной среде реакция практически не идет. Однако применение в качестве растворителя 20%-го водного диоксана позволило получить соединения (13a-c) с практически количественными выходами.

Спектры ЯМР Н, С и P регистрировали на спектрометре "Bruker AMXIII-400" с рабочей частотой 400, 133 и 162 МГц в D2O. В качестве внутреннего стандарта использовали натриевую соль 3-триметилсилил-1-пропансульфокислоты. Анализ методом ТСХ проводили на пластинках "Kieselgel 60 F254" в разных системах. УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре "Shimadzu UV-2401 PC" в воде (pH 7).

Культивирование репликона ВГС и определение его относительного титра при изучении свойств соединений проводили, как описано в работе [10]. Токсичность соединений в культуре клеток Huh7 определяли, используя MTT ("Sigma", США) [10].

^-гидроксиинозин (7a). К раствору 2,68 г (1 ммоль) аденозина в 50 мл 50%-го водного метанола при перемешивании добавляли 3,44 г (2 ммоль) м-хлорнадбензойной кислоты. Через 24 ч добавляли еще 3,44 г (2 ммоль) м-хлорнадбензойной кислоты и перемешивали 24 ч. Реакционную массу упаривали в вакууме, растворяли в воде и экстрагировали этилаце-татом. Водную фракцию очищали методом обраще-но-фазовой хроматографии на колонке с "LiChroprep RP-18" (50x400 мм), лиофилизовывали из воды и получали 2 г аденозин ^-оксида (6a). К раствору 2 г (0,7 ммоль) соединения (6a) в 50 мл воды добавляли

С х е м а 1

СбН1з

25 % ая. КН3,

СН3ОН

1: а Я = С6Н13; Ь Я = СН2ОС(СН3)3; с Я = СН2ОН; а Я = С5Н11; е Я = С6Н5; f Я = С10Н21; 4: а X = О, Я = С6Н13; Ь X = О, Я = СН2ОН; с X = КСН3, Я = С6Н13

Н3СЫ-

г

30 % ая. КН2СН3,

СН3ОН

С6Н13

1a-f

1. РОС13, протонная губка, (EtO)3PO, 4°С. 2. (Ви3КН)2Н2Р2О7, БМР, 20оС, 20 мин: 3. 1М водный ТЕАБ, 20°С, 40 мин

НО ОН 3

2 ч;

Я *

ООО

НО-Р-^Р-^Р-

ОН ОН ОН

НО ОН 4 а-с

Я

2

С х е м а 2

КН2

КН2

Ос > Ос > Ос > Ос >

шСРВЛ,

_^ ЯО—|

СН3ОН-Н2О I/

и

№КО2,

СН3СООН, Н2О

-и

НО ОН 5а-Ь

а Я = Н; Ь Я = Н4Р3О9

НО ОН 6а-Ь

НО ОН 7а-Ь

к

к

к

шСРВЛ,

СН3ОН-Н2О

НО ОН

К^-О

ЧиС>

кк

НО ОН 10

„_' НО—|

СН3ОН-Н2О /О\

Су

НО ОН 8

шСРВЛ, СН3ОН-Н2О

Н3^ /СН3

к

О

О

О

О

к

С х е м а 3

Cl

NHR

N'

4N' HO—

HO OH 12

nh2r,

диоксан, H2O

N

N HO

HO OH 13a-c

a R = CH2COOH; b R = CH2CH2COOH; c R = CH(CH3)COOH

11 мл (2 ммоль) уксусной кислоты и 13,8 г (2 ммоль) нитрита натрия. Перемешивали 2 сут, добавляли еще 6,9 г (1 ммоль) нитрита натрия, перемешивали 3 сут, упаривали в вакууме и очищали методом обращено-фазовой хроматографии на колонке с "ЫСкгвргвр ЯР-18" (50x400 мм). Продукт лиофили-зовытали из воды. Общий выгсод 1,28 г (45%) (физико-химические характеристики полностью совпадали с литературными [8]).

^-карбоксиалкиладенозины (13 а-с). К раствору 50 мг (0,17 ммоль) 6-хлорпуринрибозида (12) в 1 мл водного диоксана добавляли 300 мкл (1,74 ммоль) Н-этилдиизопропиламина и 78 мг (0,87 ммоль) в-аланина, 65 мг (0,87 ммоль) глицина или 78 мг (0,87 ммоль) аланина, выдерживали 2 сут при 37°С и упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 1 мл воды и очищали методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке с "ЫСкгвргвр КР-18" (20x200 мм) в линейном градиенте концентрации метанола (0^20%, V = 400 мл) в 0,02 М водном МН4НС03. Продукты лиофилизовывали из воды. Выход составил 95%.

^-(2-карбоксиэтил)аденозин (13а). УФ: А,макс = 267 нм (е = 16100). Спектр ЯМР 1Н (5, м.д.; КССВ, Гц): 8.09 и 8.01 (2с, 2Н, Н-2 и Н-8); 5.87 (д, 1Н, Н1', I 5.9); 4.63 (т, 1Н, Н2', I 5.6); 4.31 (~т, 1Н, Н3', I 5.6); 4.16 (~к, 1Н, Н4', I 2.8); 3.81 (дд, 1Н, Н5'а, I 2.8 и 12.9); 3.72 (дд, 1Н, Н5'Ь, I 3.6 и 12.9); 3.56 (уш.с., 2Н, СН2Н); 2.46 (т, 2Н, СН2С00Н, I 6.9). Спектр ЯМР 13С (5, м.д.): 178.62 (С00Н); 159.14 (С-6); 149.54 (С-4); 153.52 (С-2); 140.93 (С-8); 119.61 (С-5); 89.46 (С-1'); 86.75 (С-4'); 74.88 (С-3'); 71.70 (С-2'); 62.64 (С-5'); 37.84 (С-С00Н и С-НН).

N6-карбоксиметиладенозин (13Ь). УФ: А,макс = 266 нм (е = 15300). Спектр ЯМР 1Н (5, м.д.; КССВ,

Гц): 8.14 и 8.03 (2с, 2H, H-2 и H-8); 5.91 (д, 1H, H1', J 5.9); ~4.8 (сигнал Н2' частично перекрывается сигналом HOD); 4.33 (~т, 1H, H3', J 4.2); 4.18 (~к, 1H, H4', J 3.1); 3.97 (уш.с., 2H, CH2N); 3.83 (дд, 1H, H5'a J 2.7 и 12.9); 3.74 (дд, 1H, H5'b, J 3.7 и 12.9). Спектр ЯМР 13C (г, м.д.): 173.49 (COOH); 159.25 (C-6); 149.81 (C-4); 152.90 (C-2); 140.47 (C-8); 119.65 (C-5); 88.87 (C-1'); 86.13 (C-4'); 74.19 (C-3'); 71.03 (C-2'); 61.98 (C-5'); 44.93 (C-N).

N6-(1-кapбoкcиэтил) аденозин (13c). УФ: ^макс = 268 нм (е = 14800). Спектр ЯМР 1H (5, м.д.; КССВ, Гц): 8.11 и 8.01 (2с, 2H, H-2 и H-8); 5.89 (д, 1H, H1', J 5.9); ~4.8 (сигнал Н2' частично перекрывается сигналом HOD); 4.32 (~т, 2H, H3' и CH, J 4.2); 4.18 (~к, 1H, H4', J 2.8); 3.83 (дд, 1H, H5'a, J 2.5 и 12.9); 3.74 (дд, 1H, H5'b, J 3.6 и 12.9); 1.41 (д, 3H, CH3, J 7.2). Спектр ЯМР 13C (8, м.д.): 176.42 (COOH); 159.13 (C-6); 149.61 (C-4); 152.76 (C-2); 140.18 (C-8); 119.51 (C-5); 88.73 (C-1'); 85.94 (C-4'); 74.11 (C-3'); 70.89 (C-2'); 61.83 (C-5'); 52.18 (C-N);

18.38 (CH3).

3 i

5'-трифосфат N -гидроксиинозина (7b) синтезировали из 5'-трифосфата аденозина (5b) методом, описанным выше для нуклеозида. УФ: А,макс = 232 нм (е = 35000), 261 нм (е = 8500). Спектр .ЯМР 1H (5, м.д.; КССВ, Гц): 8.48 и 8.46 (2с, 2H, H-2 и H-8); 6.01 (д, 1H, H1', J 4.6); ~4.8 (сигнал Н2' частично перекрывается сигналом HOD); 4.46 (уш.с, 1H, H3'); 4.26 (уш.с, 1H, H4'); 4.12 (м, 2H, H5'). Спектр ЯМР 31P (5, м.д.): -6.44 (уш.с, 1P, P„); -10.64 (с, 1P, Py), -21.50 (уш.с, 1P, Pp).

Бициклические фурано[2,3-£>]пиримидиновые нукле-озиды (1a-f) синтезированы взаимодействием 5-иоду-ридина с терминальными алкинами в присутствии каталитических количеств Pd (0) и CuI [3, 4] анало-

Цитотоксичность в культуре клеток Huh7 и антивирусный эффект полученных соединений в системе репликона ВПГ

Соединение ЦД50, MKM ИД50, mkM

1a-e, 2, 3 >500 не активны

1f >500 30

7a 20 2-3

13a 100 30-50

13b,c >500 не активны

2'MeC * >200 1,23

4'N3C * >33 1,28

* Данные приведены в статье [11]; ЦД50 - концентрация соединения, вызывающая гибель 50% культивируемых клеток; ИД50 - концентрация соединения, на 50% подавляющая репликацию вируса

гично методу, предложенному ранее для получения соответствующих 2'-дезоксинуклеозидов [5, 6]. Обработка нуклеозида 1а водно-спиртовыми растворами аммиака или метиламина (схема 1) привела к пирро-ло- и N -метилпирроло[2,3-^]пиримидиновым нуклео-зидам (2) и (3) соответственно [3, 4].

Синтезированные нуклеозиды были испытаны как потенциальные ингибиторы репликации ВГС в системе репликона вируса [10] (таблица). Соединения (1-3) и (13b,c) оказались неактивны в этой системе и не обладали цитотоксичностью в концентрации до 500 мкМ в культуре гепатоцитов человека Huh7. Лишь бициклический нуклеозид (1f), содержащий заместитель С10Н12, и ^-карбоксиметиладенозин (13a) проявили умеренную анти-ВГС активность. В ряду ^-производных (13) только ^-карбоксиме-ти-ладенозин (13а) проявил умеренную токсичность. N1-Гидроксиинозин (7а) продемонстрировал высокую анти-ВГС активность и высокую токсичность в культуре клеток Huh7.

Механизм противовирусного действия большинства аналогов нуклеозидов включает их энзиматическое превращение в нуклеозид 5'-трифосфаты с последующим встраиванием в З'-конец вирусной ДНК или РНК, что приводит к ингибированию репликации вируса [12, 13]. Для поиска возможной мишени полученных нуклеозидов мы синтезировали ряд 5'-0-трифосфатов и исследовали их субстратную специфичность по отношению к ферментам ВГС: белки NS5B и NS3.

По методу [14] (схема 1) синтезировали 5'-трифос-фаты (4а-с) действием Р0С13 в триэтилфосфате в присутствии протонной губки с последующей конденсацией с трибутиламмонийной солью пирофосфорной кислоты. Выходы составляли 5-14% [3, 4]. 5'-Трифос-фат ^-гидроксиинозина (7Ь) был получен в две стадии окислением коммерчески доступного 5'-трифосфа-та аденозина (5Ь) с последующим дезаминированием 5'-трифосфата аденозин ^-оксида (6Ь) (схема 2).

5'-Трифосфаты бициклических нуклеозидов (4а-с) не узнавались РНК-полимеразой ВГС и проявляли крайне слабые ингибиторные свойства АТРазной реакции, катализируемой КГРазой ВГС, однако оказались сравнительно эффективными субстратами МГРазы (рисунок). Их активность лишь немногим уступала активности природного иТР [3, 4]. Различие в скоростях гидролиза и могло обусловливать наличие низкой псевдо-ингибирующей активности этих соединений. В то же время 5'-трифосфат ^-гидроксиинози-на (7Ь) заметно ингибировал АТРазную реакцию, катализируемой КТРазой ВГС (К 109 мкМ).

Приведенные выше данные указывают на необходимость дальнейшего изучения зависимости структу-ра/анти-ВГС активность этих групп соединений для более точной оценки перспективности их использования в качестве ингибиторов ВГП.

Авторы благодарны А.О. Кузякину (ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН) за предоставление белка N83 ВГС.

Гидролиз трифосфатов бициклических нуклеозидов и UTP, катализируемый NTP-зависимой РНК-хеликазой: 1 - UTP; 2 - 4b; 3 - 4c; 4 - 4a. Соединения (200 мкМ) инкубировали 5-30 мин с 0,2 мкг белка NS3 при 37°С в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 25 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2 и 1,5% (v/v) глицерина. Анализ продуктов проводили с помощью ВЭЖХ (колонка "Lichrosorb-NH2", 4x150 мм, 6 мкм) или ТСХ

Работа выполнена при финансовой поддержке программы Президиума РАН по молекулярной и клеточной биологии и грантов РФФИ №05-04-49492, 05-04-49500 и 04-04-49621.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Wasley A., Alter M.J. // Semin. Liver Dis. 2000. 20. P. 1.

2. RosenH.R., GretchD.R. // Mol. Med. Today. 1999. 5. P. 393.

3. Alexandrova L.A., Ivanov M.A., Victorova L.S., Kukhano-

va M.K. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2007 (в печати).

4. Иванов M.A., Иванов А.В., Красницкая И.А., и др. //

Биоорг. химия. 2007 (в печати).

5. RobinsM.J., BarrP.J. // J. Org. Chem. 1983. 48. P. 1854.

6. McGuigan C., Yarnold C.J., Jones G. et al. // J. Med. Chem.

1999. 42. P. 4479.

7. Kwong C.D., Krauth C.A. et al. // Nucleosides &

Nucleotides. 1998. 17. P. 1409.

8. Khandazhinskaya A.L., Shirokova E.A., Shipitsin A.V. et al.

// Collect. Czech. Chem. Commun. 2006. 71. P. 1107.

9. Gao Z.G., Blaustein J.B., Gross A.S. et al. // Biochem.

Pharmacol. 2003. 65. P. 1675.

10. Lohmann V., Korner F., Herian U. et al. // Science. 1999. 285. P. 110.

11. Klumpp K., Leveque V., Le Pogam S. et al. // Biol. Chem. 2006. 281. P. 3793.

12. De ClercqE. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. 1587. P. 258.

13. De Clercq E. // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. 1. P. 13.

14. Kovacs T., OtvosL. // Tetrahedron Lett. 1988. 29. P. 4525.

Поступила в редакцию 23.11.07

NOVEL RIBONUCLEOSIDE ANALOGUES AND THEIR 5f-O-TRIPHOSPATES: SYNTHESIS AND BIOLOGICAL PRORERTIES

N.A. Golubeva, A.V. Ivanov, M.A. Ivanov, O.A. Batyunina, A.V. Shipitsyn, V.L. Tunitskaya, L.A. Alexandrova

(Engelhardt Institute of Molecular Biology RAS; University of Oslo, Centre for Medical Studies in Russia)

Bicyclic furano- and pyrrolo[2,3-D ]pyrimidines and modified at N1 and/or 6 position purine nucleotides were synthesized. Among the tested non toxic bicyclic nucleosides and N6-alkyladenosines only [2,3-d]furopyrimidine with C10H21 substituent and N6-alkyladenosine showed moderate anti-HCV activity in a replicon system, and N1-hydroxyinosine demonstrated high anti-HCV activity and significant cytotoxicity. The corresponding nucleoside 5'-triphospates were synthesized and studied as substrates/inhibitors of HCV NS5B protein (RNA-dependent RNA polymerase) and NS3 protein (RNA helicase/NTPase).