Современные тенденции в биотехнологии нуклеозидов

Михайлопуло И. А.; Мирошников А. И.

УДК 577.1 13.6

Современные тенденции в биотехнологии нуклеозидов

И. А. Михайлопуло1*, А. И. Мирошников2

'Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220141, Минск, ул. Академика Купревича, 5/2,Беларусь

2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 29.04.2010 г

реферат В настоящем обзоре рассматриваются новые тенденции в биотехнологии нуклеозидов последнего десятилетия. Постоянно растущий интерес в изучении этого класса соединений стимулируется рядом факторов: (г) растущей потребностью в производстве в больших количествах природных 2'-дезокси-0-О-рибонуклеозидов, а также их модифицированных по гетероциклическому основанию и углеводному фрагменту аналогов для использования их в синтезе и изучении олигонуклеотидов, в том числе коротких интерферирующих РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) и т.п.; (гг) необходимостью создания современных технологий производства биологически важных аналогов природных нуклеозидов, включая противоопухолевые и противовирусные препараты; (ггг) необходимостью изучения известных и новых ферментативных превращений нуклеозидов и использования их в качестве инструментов эффективного синтеза новых нуклеозидных аналогов и производных, имеющих биомедицинский потенциал. Эти аспекты будут рассмотрены наряду с краткой ретроспективой этой области исследований.

ключевые слова нуклеозиды, ферменты метаболизма нуклеиновых кислот, химико-ферментативный синтез, биоимитирующий синтез.

введение

Нуклеозиды представляют собой большое семейство природных и химически модифицированных аналогов, характеризующихся огромным структурным разнообразием. Основные компоненты ДНК и РНК - четыре 2'-дезокси-ß-D-нуклеозида аденина (1), гуанина (2), тимина (3) и ци-тозина (4) и, соответственно, родственные им четыре ß-D-рибонуклеозида (5-8) (схема 1). Природные аналоги этих нуклеозидов, углеводный фрагмент или/и агликон которых изменен(ы) различным образом, были найдены в РНК, а также составляют подгруппу нуклеозидных антибиотиков, которая характеризуется удивительным разнообразием структур. 5'-Фосфорилированные нуклеозиды - нукле-отиды, являются важнейшими метаболитами биосинтеза ДНК и РНК, а также косубстратами и кофакторами огромного числа биохимических превращений.

Первый природный представитель семейства нуклео-тидов - инозин-5'-монофосфат ((9); IMP; название инозин происходит от греческого inos - мышца) был выделен из экстракта мяса Либихом (J.F. von Liebig), который описал его свойство интенсифицировать вкус. Синтез HIMP из инозина и его структура как рибонуклеозид-5'-монофосфата были описаны Левиным и Типсоном (P.A. Levene & R.S. Tipson) 88 лет спустя (схема 1) (см. [1] и работы, цитированные в этой статье). Интересно отме-

тить, что именно Левин (P.A. Levene) дал общее имя «ну-клеотид» соединениям, содержащим остаток фосфорной кислоты и образующимся в результате гидролиза нуклеиновых кислот, предложил имя «нуклеозид» для дефосфо-рилированных нуклеотидов и идентифицировал D-рибозу и позднее 2-дезокси^-рибозу в качестве компонентов соответственно РНК и ДНК [2-7].

Пионерские структурные исследования нуклеозидов и нуклеотидов в течение последней декады XIX и начала XX столетий показали, что ДНК и РНК включают в свой состав пять гетероциклических основания и две пентозы. Первая химическая конденсация двух компонентов была опубликована Э. Фишером и Хелферихом (E. Fischer & B. Helferich) в 1914 г. [8]; реакция серебряной соли 2,8-дихлорпурина и 2,3,4,5-тетра-0-ацетил-а^-глюкопиранозилбромида, последующие удаление защитных групп и дегидрогалогенирование приводили к неприродному нуклеозиду №-ф^-глюкопиранозил)аденину (10), структура которого была однозначно установлена Гул-ландом и Стори (J.M. Gulland & L.F. Story) спустя 24 года (схема 1) [9]. В промежутке между Первой и Второй мировыми войнами был опубликован ряд статей, посвященных химическому синтезу пиримидиновых и пуриновых нукле-озидов, однако систематические исследования химического синтеза нуклеозидов, нуклеотидов и олигомеров были на-

(1), X = H

(2'-Дезоксиаденозин; dAdo) (5), X = OH (Аденозин; Ado)

nh

Л

n nh,

(2), X = H

(2'-Дезоксигуанозин; dGuo) (6), X = OH (Гуанозин; Guo)

НО''-Pv

во

о—v n n

лр,

но он (9)

а/

но—\ „ n

(3), X = H;

R=Me (Тимидин; Thd); (7), X = OH; R = H (Ури-дин; Urd)

(4), X = H

(2 '-Дезоксицитидин; dCyd); (8), X = OH (Цитидин; Cyd)

nh,

Г <

HO A«-^V

ОН

(10)

n

J

чаты А. Тоддом (a. Todd) и сотр. в 1942 г. в Университете Кэмбриджа (Англия) и несколько позднее в США. С тех пор опубликовано множество монографий и обзоров, суммирующих огромный прогресс в этой области исследований (см., напр., [10-12]).

Систематические исследования биологических свойств нуклеозидов были начаты во второй половине 1940-х гг. Несколько ранее Филдс и Вудс (P. Fildes & D.D. Woods) сформулировали антиметаболитную теорию и ее положения в применении к дизайну аналогов природных соединений, обладающих биомедицинским потенциалом, стимулировали огромное количество исследований в этой области (см., напр., обзоры [13, 14]). Несмотря на умеренную предсказательную силу этой теории, большой массив синтезированных аналогов природных нуклеозидов и данных об их биологических свойствах (i) выявили весьма полезные инструменты изучения биохимических превращений, которые привели к пониманию механизма функционирования ферментов метаболизма нуклеиновых кислот, позволили (ii) проанализировать на ряде примеров зависимость структура-активность, что привело к рациональному дизайну новых аналогов с улучшенным соотношением активность-токсичность, и (iii) создать ряд противоопухолевых и противовирусных лекарств.

В течение тридцати лет после начала систематических исследований был обнаружен ряд структур-лидеров огромной биологической и медицинской важности, например, гетероциклические основания (6-меркаптопурин (11), тиогуанин (12), 5-фторурацил (13)), аналоги тимидина, модифицированные по С5 агликона (2'-дезокси-5-йодуридин

(14); Idoxuridine; Iduviran, 2'-дезокси-5-фторуридин

(15); FUDR; Floxuridine, (E )-5-(2-бромвинил)-2' -дезоксиуридин (16); BVDU; Brivudine) и при С3' углеводного фрагмента (3'-дезокси-3'-фтортимидин (17); FLT; Alovudine и 3'-дезокси-3'-азидотимидин (18); AZT; Zidovudine), ß-D-арабинофуранозилнуклеозиды (1-(ß-D-арабинофуранозил)-цитозин (19); aC, Cytarabine, -аденин (20); aA, Vidarabine, -гуанин (21); aG), 3-карбоксамидо-1-

ф^-рибофуранозил)-1,2,4-триазол (22); Виразол; Virazole; Ribavirin и гипермодифицированные пуриновые ациклону-клеозиды, аналоги, у которых углеводный фрагмент ну-клеозидов заменен на алифатическую цепь, которая имитирует пентофуранозную часть природных нуклеозидов, а именно, Ацикловир (23); ACV; Zovirax, Ганцикловир (24); DHPG; Cytovene, Буцикловир (25); Buciclovir, Пенцикловир (26); Penciclovir и Фамцикловир (27); 5'-ОАс-производное, согласно нуклеозидной нумерации; «prodrug» Пенциклови-ра; Famciclovir) (схема 2).

Обнаружение большого числа соединений, обладающих высокой противовирусной и/или противоопухолевой активностью, многие из которых были разрешены Агенством по продуктам питания и лекарствам, США (FDA, Food and Drug Administration, USA) к применению в США, а также выделение из природных источников нуклеозидных антибиотиков [15] стимулировали синтез огромного числа модифицированных нуклеозидов. Исследования, направленные на изучение механизмов противовирусной и противоопухолевой активности, дали обширный материал относительно метаболических превращений модифицированных нуклео-зидов, об их метаболической активации и дезактивации. Кроме того, эти исследования позволили установить ферментативные реакции, вовлеченные в проявление активности и выяснить роль механизмов утилизации нуклеозидов («salvage»-синтез) и участия вирускодируемых нуклео-зидкиназ в осуществлении ключевой стадии активации ну-клеозидов - их 5'-монофосфорилирования внутри клетки. Нуклеозидмонофосфаты далее метаболизируют до 5'-ди-и 5'-трифосфатов, и последние включаются в разнообразные метаболические превращения [14, 16-19].

Было установлено, что большинство нуклеозидных аналогов, проявляющих противовирусную и/или противоопухолевую активность в организме, не активны как таковые, но становятся активными после превращения в клетке в нуклеотиды внутриклеточными ферментами. В случае противовирусных агентов, нуклеозид-5'-трифосфаты часто являются настоящими ингибиторами вирусных ДНК-

СО CCI

(il)

(12)

N ЧЭ H

(13)

NHj

N

ijl >f n

i x

НО—\ „ N^^O

J—\ n '

Л^с

НО

ы чэ он

(19)

но

(14), X = I

(15), X = F

<л

^Н N

Br HO

nh

N-^O

(16)

(20), X = NH2, Y = H

(21), X = OH, Y = NH2

< *

HO^ n N"**^

HO OH (22)

HO

—\ о u HO—V n I

ho x

N'^O

(17), X = F

(18), X = N3

CCI

X Y Z

(23) O H O

(24) O CH2OH O

(25) O OH CH

(26) O CH2OH CH

(27) (5'-OAc) H CH2OAc CH2

или РНК-полимераз. В некоторых случаях полимеразы воспринимают аналог природного субстрата и, вводя аналог в растущую цепь, обрывают (терминируют) ее или продолжают рост цепи со значительным замедлением либо приводят к функционально некомпетентному биополимеру [16, 17].

В опухолевых клетках синтез активных соединений инициируется превращением гетероциклических оснований в соответствующие рибонуклеозид-5'-монофосфаты под действием нуклеозид-фосфорибозилтрансфераз или прямым 5'-фосфорилированием нуклеозидов под действием клеточных нуклеозидкиназ [14, 20-22]. Напротив, в вирусинфицированных клетках, первая, критически важная стадия активации противовирусных нуклеозидов состоит в 5'-монофосфорилировании под действием киназ, кодируемых вирусом [16, 17, 23].

Катаболическая дезактивация биологически активных нуклеозидов часто заключается в дезаминировании цито-зиновых и адениновых нуклеозидов под действием соответствующих дезаминаз, приводящем к неактивным производным [14, 24-26], и в фосфоролитическом гидролизе гликозидной связи нуклеозидфосфорилазами с образованием гетероциклических оснований и a-D-пентофураноза-1-фосфатов (см. [24, 27] и работы, цитированные в [27]).

Новые данные относительно метаболизма нуклеозидов и механизма их действия на мишени позволили увеличить активность первоначально обнаруженных соединений-лидеров путем защиты их от катаболических превращений или улучшив их доставку до целей, а также способствовали обнаружению новых биологически активных лидеров [18, 19, 28]. Примером первого подхода являются противоопухолевые средства Фторафур® (28), 5-фтор-5'-дезоксиуридин (29) и Капецитабин ((30); Capecitabine), родственные арабино-А нуклеозиды Кладрибин ((31); CdA; Cladribine), Флударабин ((32); Fludarabine) и Клофарабин ((33); Clo-farabine), которые высокоактивны в отношении различ-

ных форм лейкемии и устойчивы к дезаминированию аде-нозиндезаминазой [21, 22], и противолейкозное средство Неларабин ((34); Nelarabine), «prodrug» aG, с улучшенной в сравнении с первоначальным средством aG растворимостью и более высокой активностью [29] (схема 3).

Выяснение механизма действия AZT и установление в качестве биохимической мишени лекарств против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), обратной транс-криптазы, кодируемой вирусом, стимулировало синтез огромного числа разнообразных 2',3'-дидезоксинуклео-зидов, например, 2',3'-дидезоксицитидина ((41); ddC; Zal-cytabine; Hivid®), 2',3'-дидезоксиинозина ((42); Didanosine) и родственных нуклеозидов с С2'-С3'-двойной связью, 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидина ((35); d4T; Stavu-dine; Zerit®) и его цитозиновых аналогов ((36); d4C) и ((37), Reverset™), нуклеозидов с атомами кислорода или серы вместо С3'-атома углерода пентофуранозного кольца, 2-амино-2',3'-дидезокси-3'-оксааденозина ((38); Amdoxo-vir), 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина ((39); 3TC; Lamivudine; Epivir®), (-)^-Ь-3'-тиа-2',3'-дидезокси-5-фторцитидина ((40); (-)FTC; Emtricitabine; Emtriva®), а также большого числа гипермодифицированных ациклических нуклео-зидов с фосфонатной функцией и их депо-форм, например, ((43); Cidofovir, B = цитозин-1-ил) и ((44); Tenofovir, B = аденин-9-ил) [30-34] (схема 3).

Следует подчеркнуть, что пионерские исследования Шеффера и сотр. (H.J. Schaeffer) по синтезу и изучению биохимических свойств ациклических нуклеозидов привели к открытию 9-[2-гидрокси(этоксиметил)]гуанина ((23); Ацикловир; Acyclovir) в качестве противовирусного средства [35-38] и стимулировали синтез разнообразных ациклических нуклеозидов, модифицированных по агли-кону или в ациклическом фрагменте, включая фосфонат-ные аналоги нуклеозид-5'-фосфатов и их скрытых форм («prodrugs»), которые обнаружили широкий спектр биологической активности [39].

nh

N'4>

nh

^А ^ о ^^

но он но он но но

nhcoocsh,,

nh,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Схема 3

но

n х>

Л!У

(35), X = OH, Y = Me

(36), X = NH2, Y = H

(37), X = NH2, Y = F

HO

(38)

HO^ „ в

(41), B = цитозин-1-ил

(42), B = гипоксантин-9-ил

u_ U II ö = Y = x >" H, O F, = = = X X X 31) 32) 33) (34)

NH2 NH2 IT

о в JO..., J но у (39), Y = H (40), Y = F

HO^

(43), B = цитозин-1-ил и его "prodrugs" (44), B = аденин-9-ил и его "prodrugs" TDF

Вплоть до настоящего времени, подавляющее большинство модифицированных нуклеозидов были получены химическими методами. Большое число разработанных с этой целью синтетических подходов можно объединить в три основных направления: (г) конвергентный синтез, в котором используются производные сахаров или имитаторов сахаров в качестве гликозилирующих агентов, (гг) химические превращения природных нуклеозидов и (ггг) рациональная комбинация обоих указанных выше подходов. Несмотря на весьма впечатляющий прогресс, достигнутый в развитии химических методов, получение многих противовирусных и противоопухолевых лекарств, а также биологически активных соединений продолжает оставаться серьезной проблемой, что обусловливает высокую стоимость препаратов и, как следствие, ограничивает широкие биологические исследования и терапевтическое применение. Необходимость развития новой стратегии получения рассматриваемых соединений стала очевидна в конце 1970-х гг.

химико-ферментативная стратегия синтеза нуклеозидов (биотехнология нуклеозидов)

Среди большого числа ферментов обмена нуклеиновых кислот около 20 представляют интерес с точки зрения новых эффективных стратегий получения биологически важных нуклеозидов. Прежде всего, это относится к ферментам, катализирующим конденсацию гетероциклических оснований и сахаров с образованием гликозидной связи, а также к ферментам, катализирующим различные превращения нуклеозидов. Эти ферменты имеют первостепенное значение для изучения и разработки новых подходов к синтезу нуклеозидов.

Параллельно с пионерскими химическими исследованиями и изучением биохимических свойств модифициро-

ванных нуклеозидов были начаты работы по выделению ферментов обмена нуклеиновых кислот из природных источников и изучению механизмов их функционирования (см., напр., обзор [24]). Первые публикации Левина и сотр. [40-44] и Джонса (W. Jones) [45, 46] по активности, гидро-лизующей нуклеиновые кислоты и расщепляющей нукле-озиды, относятся к 1911 г.; позднее Левин и сотр. описали выделение «нуклеозидазы» из селезенки, почек и поджелудочной железы крупного рогатого скота, которая была способна гидролизовать аденозин и инозин в фосфатном буфере с одинаковой эффективностью, давая соответствующие основания и рибозу (рибозо-1-фосфат не был обнаружен в то время!), и изучили ее свойства [47-49]. Были определены оптимальная температура (37°С) и pH (7.5) реакции и было найдено, что (i) рибоза и аденин оказывают «замедляющее влияние на протекание реакции», (ii) каолин полностью адсорбирует частично очищенный фермент из раствора, при этом комплекс фермент-каолин является стабильным в пределах значений pH 4.0-8.0 при 40°С в течение 15 ч и демонстрирует одинаковый уровень активности и (iii) химически полученный адениновый нуклеозид, содержащий гексозу (структура нуклеозида не была установлена), не являлся субстратом фермента.

Позднее Калкар (H.M. Kalckar) изучил нуклеозидазу из печени крысы и показал, что (i) этот фермент является пурин-нуклезидфосфорилазой (PNP; КФ 2.4.2.1), которая фосфоролитически гидролизует инозин или гуанозин и при этом образуются рибозо-1-фосфат (позже была доказана структура: а-О-рибофуранозо-1-фосфат; (47); RP) (см. обзоры [24, 50]) и соответствующие пуриновые основания, гипоксантин или гуанин; (ii) инкубация RP с гипоксантином или гуанином в присутствии PNP приводит к быстрому образованию инозина или гуанозина [51, 52]. В статье Калкара

НО—\ 0 t

Лф

в

но x X = OH, H

np

+фосфат

-

- фосфат

/\ ее но x

(47), X = OH

(48), X = H

он

NP — нуклеозидфосфорилазы B — пиримидиновые и пуриновые гетероциклические основания

выделение RP в чистой форме было сообщено впервые. Вскоре после этой публикации Мансон и Лампен (L.A. Manson & J.O. Lampen) показали, что покоящиеся клетки Escherichia coli, а также бесклеточный экстракт содержат ферменты, гидролизующие 2'-дезоксиинозин и тимидин в присутствии неорганического фосфата до свободных оснований и сложного эфира дезоксирибозы, структура которого была установлена позднее как 2-дезокси-а-0-рибофуранозо-1-фосфат (48) [24, 53]. Авторы предположили, что этот экстракт содержит пурин- и пиримидин-нуклеозидфосфорилазы, специфичность которых оказалась подобна таковой ферментам млекопитающих. Более того, было представлено доказательство того, что эти бактериальные ферменты обратимо катализируют синтез нуклеозидов и их фосфоролитический гидролиз (схема 4).

Последующие исследования подтвердили и расширили эти фундаментальные наблюдения и показали, что пурин-нуклеозидфосфорилаза специфична в отношении 9-(ß-D-пентофуранозил)пуринов, причем PNP из млекопитающих специфична в отношении 6-оксопуринов (ср. с приведенными выше данными Левина и сотр. [47-49]) и их нуклео-зидов, а также некоторых аналогов, тогда как PNP из бактериальных источников проявляет очень широкий спектр специфичности, используя в качестве субстратов 6-оксо-и 6-аминопурины и их нуклеозиды наряду с многочисленными аналогами.

Тимидинфосфорилаза (TP; КФ 2.4.2.4) обратимо катализирует фосфоролиз тимидина (3) и 2'-дезоксиуриди-на, но не уридина (7) и 1-ф-0-арабинофуранозил)тими-на и -урацила, тогда как уридинфосфорилаза (UP; КФ 2.4.2.3) не различает ß-D-рибофуранозу и 2'-дезокси^-0-рибофуранозу в пиримидиновых нуклеозидах и акцептирует в качестве субстратов 1-ф-0-арабинофуранозил)-пиримидины. Цитозин и его нуклеозиды не являются

субстратами TP и UP, однако следует отметить два неожиданных наблюдения. Так, PNP в некоторых экспериментах обнаружила цитозинфосфорилазную активность [54]. Было также показано, что человеческая дезоксицитидинкина-за - цитозольный фермент, который играет ключевую роль в активации терапевтически важных нуклеозидных аналогов посредством их 5'-монофосфорилирования, фосфоро-литически расщепляет природные 2'-дезоксинуклеозиды, включая 2'-дезоксицитидин, до свободных гетероциклических оснований и 2-дезокси-а-0-рибофуранозо-1-фосфата [55].

Результаты пионерских исследований однозначно указывали на возможность ферментативного синтеза нуклеозидов исходя из пуриновых или пиримидиновых гетерооснований, используя или а-О-пентофуранозо-1-фосфат, или другой нуклеозид в качестве донора углеводного фрагмента (см. обзоры [24, 56]). Первые попытки использовать ферменты для синтеза пиримидиновых нуклеозидов были предприняты Фридкиным и Робертсом (M. Friedkin & D. Roberts) на примере синтеза тимидина и родственных нуклеозидов [57, 58] и Душинским и Хайдельбергером (R. Duschinsky & c. Heidelberger) при синтезе 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUDR, (15)) и 2'-дезокси-ß - D-рибофуранозил-5-трифторметилурацила (CF3-dUrd) [59-64]. Интересно отметить, что первое сообщение о синтезе FUDR ферментативным переносом остатка 2-дезоксирибофуранозы тимидина на 5-фторурацил (13) появилось в 1957 г. [59], затем препаративный ферментативный процесс был запатентован [60]. Эта же группа исследователей описала химический метод синтеза 5-фтор-2'-дезоксиуридина (15), а также ферментативный синтез с низким выходом другого противоопухолевого нуклеозида - CF3-dUrd, используя бесклеточный экстракт клеток E. coli в качестве источника тимидинфос-форилазы [36] (см. также обзоры [24, 56, 65-68]. Позднее ряд 5-замещенных нуклеозидов урацила, включая 2'-дезокси-5-йодуридин ((14); 55%), 5-фтор-2'-дезоксиуридин ((15); 65%) и Е-5-(2-бромвинил)-2'-дезоксиуридин ((16); 61%), был получен с использованием тимидина (3) или 2'-дезокси-гуанозина (2) в качестве доноров 2-дезоксирибофуранозы, соответствующих гетерооснований в качестве акцепторов и селекционированных клеток E. coli BM-11 в качестве биокатализатора [69].

Перенос пентофуранозного фрагмента пиримидиновых нуклеозидов на пуриновые гетерооснования и наоборот (реакция трансгликозилирования), катализируемый бактериальными нуклеозидфосфорилазами (NP), был продемонстрирован как очень эффективная методология синтеза

Схема 5

UP или TP фосфат

Х = OH, H Y = OH, NH2, H Z = рибо; Oh, h, nh2, f арабино; OH, F

Реакция трансгликозилирования

- урацил или тимин

"VVAJ - <;j¿ ^ "X/

Ж ео - фосфат f

y z (x-d-pf-1p

n

€ n

Н

R. = H, OH, NH2, sh, nhr R2 = H, OH, NH2, галоген

N

X

r2

UP и TP — уридин- и тимидинфосфорилазы соответственно PNP — пурин-нуклеозидфосфорилаза

большого числа аналогов природных пуриновых и пирими-диновых нуклеозидов высокой биологической и фармацевтической важности. Наиболее используемый путь заключается в переносе пентофуранозного фрагмента пиримидиновых нуклеозидов на пуриновые гетерооснования (схема 5).

Этот путь трансгликозилирования основывается на большом числе эффективных химических превращений легкодоступных природных пиримидиновых нуклео-зидов в разнообразные, модифицированные по углеводному остатку аналоги через промежуточное образование 02,2'(3';5')-ангидро-производных и последующее раскрытие ангидро-кольца под действием нуклеофильных агентов. Подобный подход к получению родственных пуриновых нуклеозидов не имеет, к сожалению, практического значения. Более того, различия в субстратной специфичности ТР и иР обусловливают возможность использования в реакциях трансгликозилирования большого числа доноров пен-тофуранозного остатка с оптимальной эффективностью. Так, например, 1-(2-дезокси-2-фтор-р-0-рибофуранозил)-урацил (схема 5, X = У = ОН; Z = рибо-¥) и 1-(2-дезокси-2-фтор-р-0-арабинофуранозил)тимин (схема 5, X = У = ОН; Z = арабино-¥) не обнаружили субстратной активности в отношении иР, и по этой причине иР не может быть использована в качестве биокатализатора; напротив, оба нуклеозида оказались низкоактивными, но все же субстратами ТР, что позволило использовать этот фермент в трансгликозилировании пуриновых оснований [70, 71].

Успешное использование нуклеозидфосфорилаз в качестве биокатализаторов для синтеза пуриновых арабино-зидов и многочисленных нуклеозидов, модифицированных по гетерооснованию и углеводному фрагменту, описаны в большом числе публикаций (см. обзоры [24, 56]).

В реакции трансгликозилирования с успехом были использованы три типа биокатализаторов: (г) селекционированные целые бактериальные клетки, проявляющие иР-и/или ТР- и РЫР-активности; (гг) целые бактериальные клетки-продуценты, экспрессирующие в большом количестве рекомбинантные нуклеозидфосфорилазы, и (ггг) очищенные рекомбинантные ферменты.

Целые бактериальные клетки в качестве биокатализаторов представляют собой, по сути, иммобилизованные природой ферменты, обеспечивающие рассматриваемые превращения. Использование биокатализаторов этого типа имеет определенные преимущества (относительно низкая стоимость) по сравнению с применением очищенных или иммобилизованных (инкапсулированных) ферментов. Следует, однако, учитывать, что целые бактериальные клетки могут обладать активностями, которые будут катализировать превращение субстрата и желаемого продукта реакции трансгликозилирования в производное, не представляющее интереса (см. ниже). С другой стороны, огромный прогресс, достигнутый в получении рекомбинантных ферментов на практическом уровне, делает эти биокатализаторы доступными для широкого применения, включая разработку биотехнологических процессов производства лекарств. В случае очень низкой субстратной активности донора пентофуранозного остатка или гетероциклического основания-акцептора применение очищенных рекомбинант-ных ферментов в качестве биокатализаторов представляет разумную альтернативу целым бактериальным клеткам.

Следует отметить, что побочные активности целых бактериальных клеток в ряде случаев могут быть рационально использованы для синтеза желаемого нуклеозида. Так, например, селекционированные клетки E. coli BM-11, обнаружившие наряду с UP- и PNP-активностями также высокую активность цитидиндезаминазы, были применены для синтеза aG (21) (15 мМ K-фосфатный буфер (рН 6.75), 60оС, 45 ч; выход в расчете на выделенный продукт 48-53%), с использованием арабинозида цитозина (19) и 2'-дезоксигуанозина (2) в качестве доноров соответственно D-арабино-фуранозного остатка и гуанина (51), образующегося in situ из dGuo (схема 6) [72]. Дезаминирование aC до арабинозида урацила (49) цитидиндезаминазой предшествует образованию а^-арабинофуранозо-1-фосфата (50) из au под действием uP.

Подобный подход был использован для синтеза 2'-дезокси-2'-фторгуанозина с 2'-дезокси-2' -фторцитидином в качестве донора 2-дезокси-2-фтор-

nh2

N

л.

nh

Л,

но L но

(19) (49)

Схема 6

о

У^о^он

(50)

но

(¡Г N NH2

но

♦ oi

un IN М

NH

А

n nh2

их

N NH2

у./он

(21)

(2)

(48)

(51)

(18)

h2n

(52); (dThd,,NH2)

NH,

rv1 < X J

(53) (Ade) ОНД^ОуЫ N

70-80%

H,N

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

(54); (¿¿Ааоз^)

NHBz

dThd

ddGuo,,

<XJ

(56) (AdeBz)

85-90%

NHBz

<XJ N

H,N

(57) (ddAdoBZ3'NH2)

80%

NHBz

^ —

°нЛр/

FmocHN

(58) (ddAdOBZ3,NHFmoC)

или

А — целые клетки E. coli в качестве биокатализатора; 20 мМ К-фосфатный буфер, pH 6.0, 50°C, 16 ч В — рекомбинантные TP и PNP E. coli или только PNP; 5 мМ К-фосфатный буфер, pH 7.0, 50°C, 24 ч

а^-рибофуранозо-1-фосфата [73]; следует отметить, что селекционированные клетки E. coli BMT-4D/1A в качестве катализатора синтеза 2'-дезокси-2'-фторгуанозина [73] представляются предпочтительными в сравнении с очищенными UP и PNP [70, 71].

Использование селекционированных клеток E. coli оказалось весьма эффективным в химико-ферментативном синтезе пуриновых 3'-амино-2' ,3'-дидезокси-ß - D -рибонуклеозидов (схема 7) [74]. Следует отметить, что AZT (18) не является субстратом ни TP, ни UP и по этой причине не может быть использован в качестве донора пентофуранозного остатка. Восстановление азидо-группы AZT дает 3'-амино-2',3'-дидезокситимидин ((52); dThd3,NH2), который оказался удовлетворительным субстратом TP, что позволило его использовать в качестве донора углеводного остатка. Перенос пентофуранозного остатка от dThd3,NH2 к аденину, катализируемый целыми клетками E. coli (20 мМ K-фосфатный буфер (рН 6.0), 50оС, 16 ч), протекал удовлетворительно, и желаемый 3'-амино-2',3'-дидезоксиаденозин ((54); ddAdo3,NH2) был получен с хорошим выходом. Однако замена аденина (53) на ^-бензоиладенин (56) в аналогичной реакции транс-гликозилирования приводила к получению ddAdo3,NH2 (54) вместо ожидаемого ^-бензоильного производного ddAdo3,NH2 (57) вследствие побочной активности целых клеток.

Принимая во внимание, что ddAdo3,NH2 с ортогонально защищенными аминогруппами (58) представляет интерес для синтеза олигонуклеотидов, мы недавно изучили реакцию трансгликозилирования с использованием очищенных рекомбинантных TP и PNP из E. coli [75]. Было найдено, что использование Thd3,NH2 в качестве донора остатка пентофуранозы и TP и PNP в качестве биоката-

лизаторов или комбинации донора ddGuo3,NH2 и биокатализатора PNP (5 мМ K-фосфатный буфер (рН 7.0), 50оС, 24 ч) приводит к получению желаемого ^-бензоильного производного ddAdo3,NH2 (57) с высоким выходом (схема 7) [76]. Стандартная обработка последнего Fmoc-OSU дает ddAdoBz3,NHFmoc (58) с ортогонально защищенными аминогруппами.

Возможные области применения нуклеозидфосфо-рилаз для синтеза нуклеозидов, а также ограничения этой методологии были изучены в деталях, однако некоторые очень интересные ферментативные реакции заслуживают рассмотрения, так как они дают ключ к пониманию механизма преобразований, катализируемых этими ферментами, и расширяют возможные области их применения.

Известно много публикаций, показывающих, что N7-атом пуринов играет очень важную роль в процессе фос-форолитического разрыва гликозидной связи пуриновых нуклеозидов (см. [77, 78] и работы, цитированные в [77]) и, по-видимому, также в обратной, синтетической реакции, катализируемой PNP E. coli, хотя механизм этой реакции до сих пор адекватно не изучен. Обнаружение высокой субстратной активности 3-дезазапуринов [79-81], 1-дез-аза-, 3-дезаза- и 1,3-дидезазапуринов (бензимидазолов, включая фтор-, хлор- и бромзамещенные) [82-84] в отношении PNP E. coli дает основание предположить ключевую роль двух атомов азота имидазольного кольца в рассматриваемой реакции, а именно один их них участвует в связывании гетерооснования в активном центре фермента, что приводит по всей вероятности к повышению нуклеофильности второго атома азота. Последнее обстоятельство способствует атаке этого атома азота на элек-трофильный С1-атом углерода а-О-пентофуранозо-1-

E . coli PNP Аспарагиновая кислота 204

E. coli PNP Аспарагиновая кислота 204

E coli PNP Аспарагиновая кислота 204

аталитическии центр

HO"V°J 9

НО X

Синтез

Фосфоролиз

фосфата и, в конечном итоге, приводит к образованию гликозидной связи (схема 8).

Примечательно, что механизм синтетической реакции, катализируемой нуклеозидфосфорилазами, не привлек достаточного внимания исследователей, и многие важные детали остаются невыясненными. Так, например, тип первоначального связывания субстрата или ингибитора с PNP E. coli (ср. типы связывания A и B на схеме 8) мог бы пролить свет на механизм функционирования фермента и дать ключ к пониманию некоторых необычных наблюдений. Участие двух атомов азота в этой реакции представляется очевидным, если принять во внимание, что 7-дезазагипок-сантин ((61); 7-DAH) является очень мощным ингибитором PNP (схема 8) [50, 85]. Туберцидин (59) и 7-дезазаинозин (60) не являются субстратами PNP и обнаружили очень

низкое сродство к активному центру фермента. Напротив, свободное основание, 7-дезазагипоксантин (61), узнается ферментом и образует очень прочный комплекс PNP-фосфат-7-DAH, что приводит к полному ингибированию фермента [85].

Тип связывания 7-DAH в активном центре PNP E. coli не выяснен; в принципе, можно предположить два разных типа связывания - А и В. Первый из них, тип А, подобен одному из двух возможных способов связывания природного субстрата в активном центре PNP посредством водородной связи карбоксила остатка аспарагиновой кисло-ты-204 (ср. тип А на схеме 8 и тип А на схеме 9). Очевидно, что тип А связывания 7-DAH в активном центре PNP E. coli не может приводить к образованию нуклеозида ввиду отсутствия №-атома азота (пуриновая нумерация). Тип свя-

НО ОН

(59), X = NH2

(60), X = OH

НО ОН (6)

а/

(61), (7-DAH)

PNP

R

о лд

н

?

н

1

R

о 7о

н. Н (О

1 X "i

NH

N

Схема 9

в

Возможные типы связывания 7-DAH в активном центре PNP; низкая ингибиторная активность 7-дезазаинозина по сравнению с 7-DAH говорит о возможности существования структуры В

J—\ еъ +

un пн н '

НО ОН 47

к

PNP + 7-DAH

(51)

о

Г-NAN но_ О pnp -^оу

о

л.

N

n^n-^nh,

(62)

о

(48)

(63)

Á N N _

(62-I)

о

-X

N NH

' Л —

N NH2 (62-II)

nh2

(62-III)

зывания В состоит в образовании необычной водородной связи между ОН-группой таутомерной формы циклического амида, что может, по-видимому, приводить также к стабилизации комплекса РЫР-фосфат-7-DAH (N9-H-структура), электронная или пространственная структура которого затрудняет или предотвращает нуклеофильную атаку на С1-атом а-О-пентофуранозо-1-фосфата (47) (схема 9).

Гипотетическая возможность образования структуры типа В неожиданно находит поддержку в удовлетворительной акцепторной активности 5-аза-7-дезазагуанина (62) в реакции гликозилирования с использованием 2-дезокси-а-0-пентофуранозо-1-фосфата (48) в качестве углеводного донора и PNP (из селезенки быка; Sigma) (см. [86] и работы, цитированные в этой статье). Действительно, гетерооснование может существовать в трех таутомерных формах (62-I-III), и одна из них, структура (62-III), может узнаваться PNP и тем самым приводить к образованию нуклеозида в результате нуклеофильной атаки свободного ^-атома азота на С1-атом углерода углеводного субстрата (схема 10). Следует, однако, отметить, что расчеты методами ab inito (6-31G**) и полуэмпирическими (PM3, в воде) (HyperChem 8.1) таутомерных структур показали, что структура II является термодинамически наиболее стабильной, тогда как структуры III и I менее стабильны (И.А. Михайлопуло, не опубликовано).

Представляется очевидным, что тип связывания 7-DAH и 5-аза-7-дезазагуанина (62) в активном центре PNP и возможные пути использования этих данных для получения некоторых нуклеозидов 7-дезазапурина заслуживают более детального изучения.

Метаболические и ферментативные превращения противовирусного соединения ^(1,3,4-тиадиазол-2-ил)-цианамида (LY217896; (64)) (схема 11) представляют собой другой пример совершенно необычных биотрансформаций [87, 88]. Это соединение обнаруживает некоторое структурное сходство с гетероциклическими основаниями противовирусного нуклеозида Виразол ((22); Ribavirin) и противоопухолевого С-нуклеозида тиазофурина (65). Оно проявило активность против вирусов гриппа типа А и В in vitro и на моделях животных, но оказалось неэффективным в клинических тестах против экспериментальной инфекции вируса А (H1N1). Несколько метаболитов этого ге-

тероцикла были обнаружены в экспериментах на клетках млекопитающих, а также животных, и структура трех метаболитов была установлена (схема 11). Следует отметить, что 1-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)мочевина (68), которая является главным метаболитом у мышей и крыс, не обнаружила активности в экспериментах in vivo и in vitro.

Было найдено, что пурин-нуклеозидфосфорилазы из селезенки теленка и эритроцитов человека, а также бактериальный фермент (Sigma, N-8265) катализируют превращение тиадиазольного гетероцикла в присутствии а-О-рибофуранозо-1-фосфата (47) в N4- и ^-рибозиды (66) и (67) (37°С, 20-70 ч, 2-200 ед. PNP; соотношение N4-и ^-рибозидов =1 : 3 (60-65% суммарный выход) при высоких концентрациях PNP и =3 : 1 (12-14% суммарный выход) при низких концентрациях PNP) [89]. Интересно, что образование мезоионного [88] или ионного (как показано на схеме 11) ^-рибозида (66) протекает, по-видимому, необратимо, тогда как ^-рибозид (67) оказался субстратом PNP.

Нельзя не отметить некоторые удивительные находки этого блестящего исследования. Во-первых, тиадиазоль-ное основание проявляет широкий спектр противовирусной активности in vitro и в моделях на животных против ортомиксо- и парамиксовирусов; при оральном или внутривенном введении, а также в качестве аэрозоля защищает мышей против летальных вирусных инфекций гриппа А или В, однако не проявляет токсичности и активности против гриппа в фазе I изучения на здоровых волонтерах [89]. Во-вторых, результаты по фармакокинетике тиади-азольного основания также отличаются большим разнообразием. В-третьих, в отличие от изложенного выше, PNP млекопитающих и бактериальной природы проявляют близкое каталитическое подобие в реакции рибозилиро-вания основания, несмотря на хорошо известные различия субстратных свойств двух указанных типов PNP в отношении природных субстратов. Эти данные указывают на то, что ^(1,3,4-тиадиазол-2-ил)цианамид (64), не имеющий общих с природными субстратами структурных особенностей, обладает функциональностью, которая достаточна для реализации синтетической реакции, катализируемой двумя различными типами пурин-нуклеозидфосфорилаз. Тестирование новых гетероциклических оснований в качестве субстратов PNP может привести к обнаружению этой функциональности, что, в свою очередь, расширит представления о механизме функционирования и синтетических возможностях фермента.

Использование целых бактериальных клеток в качестве биокатализатора реакции трансгликозилирова-ния (схема 5) предполагает, что клетки содержат UP, TP и PNP. У бактерий помимо указанных нуклеозидфосфо-рилаз были обнаружены некоторые другие фосфорилазы, представляющие интерес для ферментативного синтеза нуклеозидов. Например, нуклеозидфосфорилаза, выделенная из Klebsiella sp. штамм LF1202, обнаружила очень интересные свойства [90]. Она состоит из пяти идентичных субъединиц с молекулярной массой 25 000 Да, согласно SDS-ПААГ-электрофорезу, и проявляет активности пиримидин- и пурин-нуклеозидфосфорилаз. Инозин, аденозин (5), 2'-дезоксиаденозин (1), гуанозин (6) и 2'-дезоксигуано-зин (2) обнаружили одинаковые субстратные свойства (отн.

N

< 1 4 N

ОН \ 0 N-n

НО ОН (22) (Рибавирин)

NH2

(в © S-

CN

Н-4Г

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

\\ N

но он

№-р-0-Рибофуранозид (66) (метаболит в моче мышей, но не крыс; не активен)

Структурно-подобные биологически активные нуклеозиды

N3

14

N-(1,3,4-Тиадиазол-2-ил)цианамид (64) (активен против вирусов гриппа А и В у животных и in vivo, не эффективен в отношении экспериментальной вирусной инфекции гриппа А (H1N1) у людей)

<т

С

II

о

,nh2

1-(1,3,4-Тиадиазол-2-ил)мочевина (68) (основной метаболит в моче мышей и крыс; не активен в экспериментах in vitro и in vivo)

NH2

ОН

НО ОН (65) (Тиазофурин)

ОН

CN

НО ОН

SU

N'-p-D-Рибофуранозид (67) (метаболит в моче мышей, но не крыс)

Метаболическое превращение

Ферментативное превращение (PNP + (47)) Химическое гликозилирование

активность =100%) в фосфоролизе (величины К для инозина и неорганического фосфата (Р.) равны соответственно 0.66 и 0.56 мМ); 2'-дезоксиинозин оказался в 2.5 раза более активным субстратом; ксантозин и его 2'-дезоксипроизвод-ное не обнаружили субстратных свойств. В реакции синтеза субстратные свойства гипоксантина и аденина были схожи (величины К для гипоксантина и а-О-рибофуранозо-1-фосфата (47) равны 0.45 и 0.14 мкМ соответственно); гуанин оказался несколько менее активным в синтетической реакции. Что касается пиримидиновых нуклеозидов, уридин оказался лучшим субстратом (отн. активность 368%) в сравнении с 2'-дезоксиуридином (95%) и тимидином (29%); близкие по величине константы Михаэлиса К были найдены для уридина (0.38 мМ) в реакции фосфоролиза и для ура-цила в синтетической реакции (0.44 мМ). Субстратная активность урацила в синтетической реакции с а-0-ИЕ-1Р и 2-дезокси-а-0-рибофуранозо-1-фосфатом (48) равна соответственно 82 и 39%; тимин проявил несколько меньшую активность в реакции с 1-фосфатом (48) (17%); цитидин и 2'-дезоксицитидин, а также цитозин не обнаружили субстратной активности в ферментативных реакциях.

Нуклеозидфосфорилаза KleЪsiella sp. была использована для синтеза аА из аи и аденина (молярное соотношение 3 : 1). По данным ТСХ, в оптимизированных условиях реакции (0.1 М К-фосфатный буфер, рН 8.0; в 1 мл реакционной смеси: концентрация аденина 6.7 мМ и 0.86 ед. фермента; 50°С, 30 ч) =90% аденина превращается в аА [90].

Ширае и Екозеки (Н. Shirae & К. Yokozeki) выделили из Erwinia carotovora AJ 2992 фермент, катализирующий

фосфоролиз оротидина (ОгР), и изучили его свойства [91]. Оротидин подвергался необратимому фосфоролизу до оро-товой кислоты и 1-фосфата (47), и фермент не обнаружил строгой специфичности. Действительно, уридин оказался на два порядка более активным субстратом в сравнении с оротидином (отн. активность соответственно 100 и 1%); более того, 5-метилуридин (10%), аи (11%), 2'-дезоксиуридин (22%), 3'-дезоксиуридин (11%) и 2',3'-дидезоксиуридин (1%) оказались субстратами препарата ОгР. Уридинфосфори-лаза присутствовала в препаратах ОгР на каждой стадии очистки ОгР, и авторам не удалось разделить два типа активности. Обе активности проявлялись в виде одной полосы при SDS-ПААГ-электрофорезе, что позволяет предположить идентичность двух белков. Очищенный фермент имел молекулярную массу 68000 ± 2000 Да, что предполагает димерную структуру. Наиболее интересное наблюдение состоит в том, что оптимальные температуры и значения рН фосфатного буфера составляют 60°С и 6.0 для оротидин-фосфорилазной активности и 70°С и 7.0 для уридинфосфо-рилазной. В целом, несмотря на различия в оптимальных условиях проявления двух активностей, можно предположить, что препарат фермента из Е. carotovora AJ 2992 представляет собой иР с широким спектром субстратной специфичности.

^-Дезоксирибозилтрансферазы ^ИТ; нуклеозид:пурин-(пиримидин)-дезоксирибозилтрансферазы; КФ 2.4.2.6] представляют собой другой тип ферментов, которые имеют большое значение как биокатализаторы синтеза ну-клеозидов (обзор пионерских работ см. [92]). В отличие

B1 и B2 — пиримидиновые и пуриновые гетероциклические основания

от нуклеозидфосфорилаз, DRT катализируют прямой перенос фрагмента дезоксирибозы между нуклеозидом и гетерооснованием-акцептором без промежуточного образования фосфата 2-дезокси-О-рибофуранозы. Реакция протекает через промежуточное образование ковалентно связанного остатка 2-дезокси-а-О-рибофуранозы, гли-козидный гидроксил которой и карбоксил глутаминовой кислоты активного центра фермента образуют сложно-эфирную связь (схема 12) (см. [93] и работы, цитированные в этой статье).

DRT присутствуют главным образом в некоторых видах бактерий семейства Lactobacillus и были первоначально обнаружены МакНаттом (W.S. MacNutt) [94] в Lactobacillus helveticus и выделены Рушем и Бетцом (A.H. Roush & R.F. Betz) [95]; позднее DRT была очищена из L. leichmanii Беком и Левиным (W.S. Beck & M. Levin), и ее свойства были изучены [96]. Бактерии Lactobacillus содержат белки с двумя типами ферментативной активности, которые были первоначально выделены Холгиным и Кардино (L. Holguin & R. cardinaud) аффинной хроматографией из L. helveticus: DRT класса I (другое название пурин-дезоксирибозилтрансфераза, PDT), которые специфично переносят остаток 2-дезокси-D-рибофуранозы от пуринового нуклеозида к пури-новому основанию, и DRT класса II (другое название нуклеозид-дезоксирибозилтрансфераза, NDT), катализирующие перенос 2-дезокси-О-рибофуранозы между пурин-пуринами, пиримидин-пиримидинами и пурин-пиримидинами [97]. В ранних работах по субстратной специфичности DRT были обнаружены (i) строгая специфичность в отношении 2-дезокси-О-рибофуранозы и отсутствие субстратных свойств у p-D-рибонуклеозидов [92], (ii) весьма широкая толерантность DRT в отношении различных модификаций природных пуринов [96, 98, 99], (iii) субстратная активность цитозина в качестве акцептора 2-дезокси- и 2,3-дидезоксирибозидных фрагментов и соответствующих пуриновых и пиримидиновых нуклео-зидов в качестве доноров углеводных остатков [100] (см. обзор [24]).

Несколько очень интересных наблюдений с точки зрения возможного практического использования DRT было сде-

лано в течение двух последних десятилетий. Так, Д.А. Кар-сон и Д.Б. Вассон (D.A. carson & D.B. Wasson) изучили субстратную специфичность NDT L. helveticus (ATCC, #8018), очищенной согласно [96], и нашли, что фермент обладает широкой специфичностью как в отношении доноров углеводного фрагмента, так и пуриновых и пиримидиновых акцепторов [100]. Тестируя 2',3'-дидезокси-р^-нуклеозиды (ddN) в качестве доноров углеводного фрагмента (ацетатный буфер, pH 6.0, эквимолярное соотношение донора и акцептора, 37°С), авторы обнаружили исключительно высокую активность цитозина в качестве акцептора (16-60 нмоль-мин-ьмг-1 фермента; донорскую активность в ряду dT > ddG > ddC > ddA > ddI); а также определили донорскую активность 2',3'-дидезоксицитидина (ddC) и 3'-дезокситимидина (dT) в пределах 2.2-11.6 нмоль-мин-ьмг-1 фермента для аденина, гуанина и гипоксантина в качестве акцепторов.

Первая рекомбинантная NDT из L. leichmanii (DRTII) была получена Куком и сотр. (W.J. cook et al.) [101], которые изучили также биохимические свойства фермента [102-104] и архитектуру его активного центра [105]. В на-тивном состоянии фермент представляет собой гексамер и состоит из идентичных субъединиц, и две субъединицы образуют полный каталитический центр. Вольфенден и сотр. (R. Wolfenden et al.) обнаружили лиазную активность у NDT L. leichmanii и нашли, что промежуточное 1-О-глутамилпроизводное 2-дезокси-а^-рибофуранозы распадается в отсутствие гетероциклического основания с образованием D-рибаля. Последний стереоспеци-фически реагирует с аденином под действием NDT L. leichmanii, давая 2'-дезоксиаденозин в водном растворе и его 2'-а-дейтериевое производное в D2O (схема 13) [102]. Подобным же образом синтезировались тимидин и 2'-дезоксиуридин из D-рибаля и соответствующих ге-терооснований. Практическое использование результатов этого исследования для химико-ферментативного синтеза 2'-р^-дезоксинуклеозидов не было до сих пор изучено, однако развитие работ в этом направлении представляется важным в свете доступности D-рибаля посредством химических методов (см., напр., [106, 107]) и рекомбинантного фермента.

но

NH,

+

НО

и..;

NDT

НО \ 0 N НО H(D)

UJ

(70) (D-рибаль) (53) (Ade)

(1) (2'-Дезоксиаденозин) 1-2'aD (2 '-а-Дейтеро-2 '-дезоксиаденозин)

NDT — нуклеозиддезоксирибозилтрансфераза, выделенная из Lactobacillus leichmanii; D-рибаль (0.155 ммоль) + аденин (0.093 ммоль) + фермент (2.84 мг) в 0.1 М K-фосфатном буфере (2.9 мл, pH 5.7); 37°C. HO - 3 ч; DO - 32 ч

Следует отметить, что рекомбинантная NDT L. 1е1^тапп катализирует стерео- и региоспецифичный перенос 3-азидо-2,3-дидезокси-р-О-рибофуранозы от AZT на 2-амино-6-замещенные пуриновые основания (50 мМ Па-цитратный буфер, рН 6.0; 50°С, 21-28 сут) с образованием соответствующих пуриновых №-р-0-нуклеозидов с умеренным выходом. Тот же фермент был использован в качестве биокатализатора для синтеза пуриновых 4'-тионуклеозидов [104]. 2'-Дезокси-4'-тиоуридин (в виде смеси с а-аномером, полученной химическим гликозилированием урацила) был использован в качестве донора углеводного фрагмента в реакции трансгликозилирования ряда пуриновых оснований под действием NDT (50 мМ цитратный буфер, рН 6.0; 50°С, 5 сут). Индивидуальные 9-(2'-дезокси-4'-тио-р^-рибофуранозил)пурины были получены с выходом 5-58% после трудоемкой обработки реакционной смеси и хроматографии. Следует отметить, что тимидин- и пурин-нуклеозидфосфорилазы в качестве катализаторов реакции трансгликозилирования дали негативный результат.

Идентификация глутаминовой кислоты-98 ^1и-98) в качестве нуклеофила активного центра рекомбинантной

NDT L. leichmanii была осуществлена Портером и сотр. (D.J.T. Porter et al.) [108]. Авторы детально изучили взаимодействие четырех пар изомерных нуклеозидов, а именно 9-(2-дезокси-2-фтор-р^-рибо(арабино)-фуранозил) аденинов (71) и (72), 2-амино-9-(2-дезокси-2-фтор-р^-рибо(арабино)фуранозил)аденинов (73) и (74), 1-(2-дезокси-2-фтор-р^-рибо(арабино)фуранозил)тиминов (75) и (76) и 9-(р^-арабинофуранозил)гуанина ((21); aG). Инкубация фермента (2 мкМ) с арабинозилнуклеозидами (72), (74) или aG (каждый в концентрации 100 M) при 25°С в течение 20 мин приводила к ингибированию трансферазной активности соответственно на 91, 72 и 21%; тиминовые нуклеозиды не ингибировали фермент. Ферменты, активность которых была подавлена, содержали стехиометри-ческое количество ковалентно связанной 2-дезокси-2-фтор^-арабинозы, и их активность восстанавливалась при обработке аденином, при этом одновременно образовывался арабинозид аденина (72). Результаты протеоли-за ингибированного фермента позволили предположить, что у-карбоксильная группа глутаминовой кислоты-98 этерифицируется в процессе катализа (схема 14). Наконец, рекомбинантный фермент, Glu-98-остаток которого заменен на аланиновый, оказался на три порядка менее активным в сравнении с рекомбинантным ферментом на-тивной структуры.

Позднее Камински (Р.А. Kaminski) получил рекомби-нантные PDT и NDT L. helveticus и установил, что полипептиды обнаруживают 25.6% идентичности в области связывания субстрата с Glu-98 активного центра фермента [109]. Оба фермента катализировали превращение 2-аминопу-рина и 2,6-диаминопурина в соответствующие 2-дезокси-ß-D-рибонуклеозиды со скоростью, сравнимой с таковой для природных пуриновых оснований. 4-Аминоимидазол-5-карбоксамид (AICA) и имидазол-5-карбоксамид (ICA) оказались плохими субстратами, и их 2-дезоксирибози-лирование требовало больших количеств фермента и продолжительного времени инкубации. Следует отметить, что специфичная активность PDT была выше таковой

ОН

НО F

Гетероциклическое основание — B

(71) Аденин-9-ил (72)

(73) 2-Аминоаденин-9-ил (74) (75) Тимин-1-ил (76)

ОН

НО

Схема 14

NH2 N

J, NDT + аденин

N NH2

- 2,6-Диаминопурин

N

НО

(74)

NDT — рекомбинантный фермент L. leichmanii

NH2

ОН

<'Д j N

(72)

для NDT во всех четырех изученных реакциях трансгли-козилирования (экспериментальные детали не были приведены).

Структура рекомбинантной 2'-дезоксирибозилтрансфе-разы L. helveticus (PDT) была определена рентгенострук-турным анализом [93], при этом было найдено некоторое ее подобие со структурой NDT L. leichmanii [105]. Было установлено, что в случае PDT L. helveticus нуклеофилом активного центра фермента является остаток Glu-101, который атакует гликозидный атом углерода нуклеози-да, при этом атом кислорода при С3' фуранозного фрагмента участвует в образовании водородной связи с одним из атомов кислорода карбоксильной группы Glu-101 (схема 12). Гликозилированная структура PDT, образующаяся в результате инкубации фермента с арабинозидом аденина (72), содержит остаток 2-дезокси-2-фтор-а-0-арабинофуранозы, ковалентно связанный с одним из атомов кислорода остатка Glu-101. Сравнение структур комплексов PDT-2'-дезоксиаденозин и NDT-6-селеноинозин (в той же работе [105]) позволило объяснить специфичность PDT в отношении 2'-дезоксинуклеозидов, а именно атомы кислорода при С2' и С3' рибонуклеозида участвуют в образовании водородной связи с Glu-101, делая невозможным формирование промежуточной структуры с ковалентно связанным углеводным остатком (ср., схема 12).

Недавно Каминским и сотр. было проведено очень интересное исследование, направленное на поиск NDT с улучшенной активностью в отношении синтеза пуриновых 2',3'-дидезоксинуклеозидов [110]. Авторы сконструировали библиотеку случайных мутантов ndt-генов L. leichmanii (Ll) и L. fermentum (Lf) с вариабельной частотностью ну-клеотидных замен (между 1 и 10 на 1 последовательность). Кроме того, авторы разработали метод функционального скрининга и провели селекцию мутантов, пригодных для синтеза 2',3'-дидезоксинуклеозидов. Оказалось, что ну-клеотидная последовательность соответствующих генов содержит единичную замену (G3A), которая приводит к замене алифатической аминокислоты на кислоту, содержащую гидроксильную группу, а именно Ala15 на Thr (L. fermentum) или Gly9 на Ser (L. leichmanii). Единственная замена оказалась достаточной для усиления активности в отношении дидезоксинуклеозидных субстратов. Авторы заключили, что активность, отвечающая за перенос 2,3-дидезоксирибозильного остатка, предполагает наличие дополнительной гидроксильной группы у остатка в положении 9 (Ll) или 15 (Lf) с тем, чтобы компенсировать отсутствие такой группы в молекуле субстрата. Оба мутант-ных фермента обнаружили также более высокий уровень трансферазной активности в отношении 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокси-р-0-рибофуранозилнуклеозидов. Было установлено (без экспериментальных деталей), что Lf-NDT-A15T-фермент катализирует на уровне миллимоль и с хорошим выходом (до 70%) синтез 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезоксиаденозина и 2',3'-дидегидро-2',3'- дидезоксиино-зина при использовании 2',3'-дидегидро-2',3'- дидезоксиу-ридина (d4U) в качестве донора пентофуранозного остатка [110].

Сравнение реакций трансгликозилирования, катализируемых частично очищенным ферментом NDT L. helveticus [111] или пуриннуклеозидфосфорилазой E. coli (Sigma),

дало неожиданный результат [112, 113]. Не вдаваясь в подробности, авторы показали, что реакции, катализируемые NDT, протекают с большей региоселективностью, чем катализируемые PNP, и этот результат сильно зависит от структуры гетерооснования-акцептора (см. также [24]).

Помимо Lactobacilli, N-дезоксирибозилтрансферазы были выделены из простейших одноклеточных паразитов critinia lucilliae (см., напр., [109]) и Trypanosoma brucei brucei (см. [114, 115] и работы, цитированные в [114]). Фермент из т. b. brucei был очищен в 400 раз до >95% гомогенности из формы, паразитирующей в крови, и его свойства были изучены [79]; позднее был получен также рекомби-нантный фермент [80]. В отличие от ферментов Lactobacilli, фермент T. b. brucei оказался N-рибо-гидролазой с рибо-нуклеозидгидролазной активностью преимущественно в отношении инозина, аденозина и гуанозина в качестве субстратов. Величины kcat/Km для рекомбинантного фермента и инозина, аденозина и гуанозина в качестве субстратов были определены равными соответственно (х 106 М-1-с-1) 1.6, 1.4 и 0.7. Пиримидины и 2'-дезоксинуклеозиды оказались плохими субстратами со значениями kcat/Km порядка 103 М-Ьс-1 и 102 М-Ьс-1 соответственно. 3-Дезазааденозин, 7-дезазааденозин (Туберцидин) и формицин В ингибиро-вали фермент с константами ингибирования K, равными соответственно 1.8, 59 и 13 мкМ. Насколько нам известно, фермент не был использован до сих пор для синтеза ну-клеозидов.

Суммируя вышеизложенное, следует подчеркнуть, что химико-ферментативная (биотехнологическая) стратегия вытесняет многостадийные химические процессы, позволяет осуществлять ключевые превращения с высокой эффективностью, регио- и стереоселективностью. Значительный прогресс в получении биологически важных аналогов природных нуклеозидов достигнут благодаря рациональной комбинации химических методов и биохимических превращений. Использование рекомбинантных нуклеозид-фосфорилаз и N-дезоксирибозилтрансфераз в качестве биокатализаторов синтеза природных нуклеозидов и их модифицированных аналогов представляет значительный интерес для создания современных технологических процессов. Следует подчеркнуть, что обе группы ферментов удачно дополняют друг друга и позволяют найти более рациональный путь синтеза желаемого продукта. Несомненно, что использование химико-ферментативной методологии позволяет улучшить соотношение цена-качество в производстве ряда лекарств.

новые тенденции в биотехнологии нуклеозидов

В течение последнего десятилетия был опубликован ряд работ, которые дают новый импульс развитию биотехнологии нуклеозидов. Большое внимание уделено использованию а-О-пентофуранозо-1-фосфатов в качестве субстратов ферментативного синтеза нуклеозидов. Следует подчеркнуть, что ферментативный и химический синтезы О-пентофуранозо-1-фосфатов имеют богатую предысторию (см. [24]). Однако только в последнее время было опубликовано несколько интересных с точки зрения потенциального практического использования сообщений. В этой области следут в первую очередь отметить два направления исследований, а именно: (i) биохимический (микробиологи-

ческий, ферментативный) ретро-синтез 2'-дезоксирибо-нуклеозидов и (ii) химический синтез О-пентофуранозо-1-фосфатов и их последующая ферментативная конденсация с гетероциклическими основаниями.

Метаболические превращения пентоз изучены довольно обстоятельно (см., напр., обзор [116]). Нуклеозиды рассматриваются и для бактерий, и для клеток эукариот как носители углеводов, которые служат источником углерода и энергии. а-О-Рибофуранозо-1-фосфат (47) получается главным образом из пуриновых нуклеозидов под действием PNP; далее фосфат (47) включается в (i) гликолиз, (ii) метаболическую активацию пиримидиновых гетерооснований с образованием рибонуклеозидов (например, превращение 5-фторурацила в 5-фторуридин, катализируемое УФ) и (iii) ферментативное равновесное превращение под действием фосфопентомутазы (PPM) в О-рибофуранозо-5-фосфат (77), который, помимо участия в гликолизе и пентозофос-фатном цикле, является предшественником 5-фосфо-а-О-рибофуранозил-1-пирофосфата (PRPP). Последний служит донором остатка 5-фосфо-О-рибофуранозы в син-

тезе нуклеозидов de novo и используется 5-фосфорибозил-трансферазами в «утилизации» пуриновых и пиримидино-вых гетерооснований («salvage»-синтез). Катаболические превращения 2'-дезоксинуклеозидов протекают также под действием нуклеозидфосфорилаз и PPM, при этом образующийся 2-дезокси-0-рибофуранозо-5-фосфат (78) необратимо метаболизирует далее в D-глицеральдегид-3-фосфат ((79); Gla-3P) и ацетальдегид (80) под действием бактериальных и эукариотических дезоксирибоальдолаз (схема 15).

Возможность реверсивного ретро-пути синтеза нуклеозидов, исходя из Gla-3P и ацетальдегида, была изучена Раапом и сотр. (J. Raap et al.) [117, 118]. Авторы описали двухстадийное ферментативное гликозилирование в одной колбе тимина и урацила (меченные 13С- и 15П-атомами) с помощью 2-дезокси-а-0-рибофуранозо-1-фосфата ((48); также меченного 13С в различных положениях) с использованием коммерческой TP. Синтез 1-фосфата (48) был осуществлен из 2-дезокси-0-рибофуранозо-5-фосфата (78) посредством стереоспецифичной С5 ^ С1-транслокации

■cb'V

■ бе

+

H

о© НО с-НО^—X ^О

-Р'

II

о

(80)

DERA и TPI

ОН РРМ

но

он

но

(79)

(78)

о® ° но^р.о^Д^он

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

II

о

(81)

о'Р\'он

еЪ

(48)

\ о <

Тимин/ТР \ V

tX.

men

OH—\ п "N' "О

НО

(3)

DERA — 0-2-дезокси-5-0-фосфатальдолаза была выделена из суперпродуцирующего штамма E. coli DH5a (ATCC 89963)

ТPI — триозофосфатизомераза из пекарских дрожжей (Sigma); (81) (2.5 ммоль), ацетальдегид (200 ммоль), DERA (300 ед.) и TPI (700 ед.); инкубация при 20°C в течение 2 ч приводила к образованию (78) (2.0 ммоль) PPM — выделена из суперпродуцирующих клеток E . coli и частично очищена (12 000 ед. на 84 мг белка; 1 ед. превращает 1 ммоль 5-фосфата (78) в 1 -фосфат (48) за 1 мин); оптимальная активность PPM достигалась в присутствии Mn2+ и 0-глюкозо-1,6-дифосфата

TP — тимидинфосфорилаза E. coli (Sigma); инкубация 5-фосфата (78) (0.1 моль) и тимина (0.4 моль) в присутствии PPM (100 ед.) и ТФ (25 ед.) при 43°C в течение 1.5 ч приводила к образованию тимидина (3) (61 ммоль; 61%)

фосфата, катализируемой частично очищенной рекомби-нантной PPM. В свою очередь, 13С-меченные 5-фосфаты были получены из дигидроксиацетонмонофосфата (81) в присутствии избытка ацетальдегида под действием де-зоксирибоальдолазы (DERA) и коммерческой триозофос-фатизомеразы (TPI, из пекарских дрожжей). Дигидрок-сиацетонмонофосфат был получен химическим способом. Превращение (78) ^ (48) и конденсацию с тимином или ура-

цилом проводили в одной колбе и соответствующие 2'-де-зоксирибонуклеозиды были получены в индивидуальном виде с выходом 50-60% (схема 16). Следует подчеркнуть, что огромный избыток ацетальдегида был использован для того, чтобы сместить метаболическую реакцию в обратном, синтетическом направлении.

Подобный подход был использован Огавой и сотр. (3. Ogawa et а1.) для синтеза 2'-дезоксинуклеозидов из ди-

Схема 17

H3cY

(80)

но о

(79)

DERA и TPI

Клетки Klebsiella pneumoniae

HO

Ч® У

(81)

О©

он

РРМ

но

он

но

СГР\'ОН

©о

N

nh2

N т

<Х

n^n'Vpnp ОНЛ^°у но

Л

rvS

(78)

(48)

(1), X = nh2 (82), X = OH

TPI и DERA — триозофосфатизомераза и 0-2-дезоксирибоза-5-0-фосфат клеток Klebsiella pneumoniae B-4-4; инкубация (81) (117 ммоль) и (80) (200 ммоль) в присутствии отцентрифугированных клеток (16.6% по весу) при 30°C в течение 2 ч давала 5-фосфат (78) (84.3% на взятый в реакцию (81 ))

PPM и PNP — рекомбинантные фосфопентомутаза генетически модифицированных суперпродуцирующих клеток E . coli pTS17/BL21 + пурин-нуклеозидфосфорилаза (Sigma) (инкубация 5-фосфата (78) (25 ммоль) и аденина при 30°C в течение 3 ч приводила к образованию (ВЭЖХ) 2 '-дезоксиинозина ((82), 9.7 ммоль) и 2 '-дезоксиаденозина ((1), 0.6 ммоль); 2 '-дезоксиинозин (82) образовывался из первоначального продукта реакции 2'-дезоксиаденозина (1) под действием аденозиндезаминазы (ADA), присутствующей в клетах E coli)

ATP ADP

ОН

D-глюкоза

HO-Pv ✓ О OG

О

V.....он

о'еЪ ADP ATP

он

с2н5он + со2

но

D-фруктофуранозо-1,6-дифосфат JFDP)_

пекарские дрожжи

О© НО

hoV<OV>

II

о

(79)

но

г.0 °

Клетки E. coli, продуцирующие DERA ~ н

(81)

О

II

но-Ло

ое

он PPM

но

р\"он

еЪ

(78)

Клетки E. coli, продуцирующие PPM

(48)

NH2

<13

N

й nVpnp он

<' Д J

но

(1), X = NH2 (82), X = OH

N

гидроксиацетонмонофосфата и ацетальдегида через промежуточное образование 5-фосфата (78) [119, 120]. Авторы отселекционировали Klebsiella pneumoniae B-4-4 для эффективного синтеза 5-фосфата (78), который был превращен в 1-фосфат (48) в присутствии трансформированных клеток E. coli, E. coli pTS17/BL21, продуцирующих PPM E. coli. Без выделения в индивидуальном виде 1-фосфат (48) вводили в конденсацию с аденином в присутствии коммерческой PNP, и в результате были получены 2'-дезоксиа-денозин (1) и 2'-дезоксиинозин (82) в соотношении =1 : 16. Образование последнего в качестве основного продукта реакции объясняется присутствием в клетках E. coli pTS17/ BL21 аденозиндезаминазы (ADA), которая дезаминиру-ет первоначально образующийся 2'-дезоксиаденозин (1). Следует отметить, что штамм K. pneumoniae B-4-4 оказался толерантным к высокой концентрации ацетальдегида, смещающего обратимую реакцию, катализируемую DERA, в сторону синтеза 5-фосфата (78).

Позднее Огава и сотр. (J. Ogawa et al.) объединили алкогольную ферментацию пекарских дрожжей и DERA-продуцирующие клетки E. coli для синтеза 5-фосфата (78) [121-124]. Процедура синтеза 2'-дезоксирибонуклеозидов включала 4 стадии: 1 - в результате алкогольной ферментации дрожжей синтезируется фруктозо-1,6-дифосфат (FDP); 2 - DERA-продуцирующие клетки E. coli 10B5/pTS8 превращали FDP в равновесную смесь дигидроксиацетон-монофосфата (81) и D-глицеральдегид-З-фосфата (79); ферментативная конденсация (79) и ацетальдегида (высокая концентрация ацетальдегида необходима для предотвращения обратной реакции!) приводила к образованию 5-фосфата (78); 3 - последний превращался в 1-фосфат (48) под действием PPM-продуцирующих клеток E. coli

pTS17/ BL21, и, наконец, стадия 4, которая проводилась в одной колбе в присутствии гетероциклического основания и при этом к реакционной смеси добавляли коммерческие препараты PNP или TP, так как активность этих ферментов в используемых клетках E. coli была недостаточной.

В случае синтеза 2'-дезоксиаденозина (1) также наблюдалось образование 2'-дезоксиинозина (82) в результате дезаминирования первого под действием аденозиндезами-назы использованных клеток E. coli. Ксилол и полиокси-этиленлауриламин использовали для улучшения проницаемости клеток E. coli, что приводило к повышению выхода 5-фосфата (78).

Следует отметить, что микробный синтез [119-124] ограничен получением 2'-дезокси^-0-рибонуклеозидов (выделение индивидуальных продуктов пока не описано). Кроме того, удовлетворительная растворимость гетероциклического основания в реакционной смеси является важной предпосылкой успешного синтеза нуклеозидов; так, например, очень низкая растворимость гуанина делает маловероятным синтез 2'-дезоксигуанозина. Следует также иметь в виду, что побочная ферментативная активность, присутствующая в используемых клетках, может препятствовать получению желаемого нуклеозида.

Второе направление исследований, химико-ферментативный синтез, заключается в химическом синтезе а-О-пентофуранозо-1-фосфатов и их последующим использовании в ферментативной конденсации с гетероциклическими основаниями. Это направление представляется более разноплановым и привлекательным для синтеза биологически важных нуклеозидов, модифицированных по углеводному фрагменту и основанию. Действительно, а-О-пентофуранозо-1-фосфаты являются универсаль-

Схема 19 ( о

А

НО—\ „ N ^О

(17) ^Т)

\ о

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

}—> ОМе

(83)

(R =

1. Ac2O/AcOH/H2SO4, 0°С, 2.5 ч

2. 4 н. На/1,4-диоксан, 0°С, 8 ч

3. (/) о-Н3РО4/п-Ви31|, 4 А мол. сито, МеС11/4-Ме-2-пентанон (10 : 1), 0°С, 6 ч

(//) с-С6Н„МН2

0Р(0)(0Н)2 К0^\.0.

259%

1Ю

259%

О^ 0

0Р(0)С>2

2УЫН3®

(а : в ~ 87 : 13)

(84)

Гуанин/РМР Водн. КОН, Сахар : гуанин = 1 : 0.84 50°С, 48 ч (моль)

СаС12, 40-60°С, 5 ч 2бЗ%

Y = циклогексил

0Р(0)(0Н)2

(85)

НО

Л0/1 ы

(86) (FLG)

ын2

* Синтез: Abdel-Bary Н.М., Е1-ВагЬагу А.А., Khodair А.1., et а1. // Ви11. Бос. Chim. Fr. 1995. V. 132. Р. 149.

ными гликозилирующими агентами и могут быть использованы как для синтеза пиримидиновых и пуриновых нуклеозидов, так и в реакции с любыми другими гетероциклическими основаниями, которые обнаружат субстратные свойства в отношении нуклеозидфосфорилаз.

Возможность реализации этой стратегии была убедительно продемонстрирована практически одновременно с обнаружением нуклеозидфосфорилаз и ^-дезоксирибозилтрансфераз. В этом контексте нельзя не упомянуть пионерские исследования по фосфоролизу и ресинтезу пуриновых 2'-дезоксирибозидов под действием нуклеозидфосфорилаз млекопитающих [40-49], выделение 2-дезокси-а-О-рибофуранозо-1-фосфата (48) в виде кристаллической циклогексиламмониевой соли [24, 53] и синтез тимидина и ряда 5-замещенных пиримидиновых 2'-дезок-сирибонуклеозидов [57, 58]. Позднее был осуществлен химический синтез а- и р-аномеров О-рибофуранозо-1-фосфата и 2-дезокси-О-рибофуранозо-1-фосфата (см., напр., [24]).

Группа исследователей изучила синтез нуклеозидов конденсацией а-О-пентофуранозо-1-фосфатов с гетероос-нованиями под действием нуклеозидфосфорилаз [125-127]. Прежде всего, была разработана «индуцированная кристаллизацией асимметрическая трансформация» для сте-реоселективного синтеза 2-дезокси-а-О-рибофуранозо-1-фосфата (48) и его р-О-аномера [125, 126]. Оба аномера были выделены в индивидуальном состоянии в виде стабильных бис(циклогексиламмониевых) солей, и однозначно было доказано, что первый является субстратом РЫР, тогда как р-О-аномер, как и ожидалось, не обнаружил субстратной активности. 2-Дезокси-а-О-рибофуранозо-1-фосфат (48) был использован для синтеза 2'-дезокси-2-

хлораденозина (Кладрибин) в одну стадию конденсацией с 2-хлораденином или в две стадии через промежуточное образование 9-(2-дезокси-р-О-рибофуранозил)-2,6-дихлораденина [128]. Этот метод был затем успешно распространен на синтез 2,3-дидезокси-3-фтор-5-0-(4-фенил)-бензоил-О-рибофуранозо-1-фосфата (в виде смеси =87 : 13 а- и р-аномеров (85) и (84)) из метил-2-дезокси-О-рибофуранозида (83), и а-аномер этой смеси был использован после удаления 5-О-защитной группы в качестве ключевого субстрата РЫР для синтеза 2',3'-дидезокси-3'-фторгуанозина (86) путем ферментативного гликозилиро-вания гуанина (схема 19) [127, 129].

Данная работа имеет огромное значение для дальнейшего развития этого направления исследований, так как она дает ясный ответ на вопрос: если потенциальный нуклеозид-донор, модифицированный в углеводном фрагменте, обнаружил исключительно низкую субстратную активность в отношении нуклеозидфосфорилазы и не может служить донором (например, FLT (17) в отношении ТР и иР), означает ли это, что соответствующий а-О-пентофуранозо-1-фосфат (например, 1-фосфат 2,3-дидезокси-3-фтор-а-О-рибофуранозы) также будет лишен субстратных свойств в отношении нуклеозидфос-форилаз. Известно, что ряд пиримидиновых нуклеозидов, легкодоступных химическими методами, не являются субстратами ТР и/или иР и по этой причине не могут служить донорами пентоз. Химический синтез соответствующих а-О-пентофуранозо-1-фосфатов и тестирование их субстратных свойств представляет значительный интерес. Работа Коматсу и сотр. (Н. Komatsu еЬ а1.) [127] дает мощный импульс развитию исследований в этом направлении.

2-Дезокси-0-рибоза

Ac2O/CAL B АсО^ 0

Ac2O/Py АсО-л. 0 EtOH/CAL B НО -ОН —2-»- V V-OAc -»>

'"Л^О. Ac2O/Py

V ~>-он —2—»- V V-c

Схема 20

(87)

(88)

но/\> А,В о©

140%

ОН

но 5-Фторурацил или

5-бромурацил (78) PPM + TP

в1»

он

NH

N'4

(48)

(15), R = F (60%) (90), R = Br (100%)

D-Арабиноза

1. MeOH/ H2SO4

2. Ac2O/Py

3. CRL/EtOH HO

'Vy

AcO

А,В

OMe -

О Ac 124%

(91)

-ОН 2-Фтораденин \

но PPM + PNP 40% H(/

(92) (32)

CAL B — липаза Candida antarctica B

CRL — липаза Candida rugosa

PNP и TP - Sigma-Aldrich

PPM — рекомбинантная фосфопентомутаза

Условия рекаций:

А -(i) ^Ю)2Р-К-Рг),/тетразол/ ТГФ; (ii) f-Bu-OOH B — (i) H2 (ra^)/Pd(OHf)2/C; (ii) ионообменная хроматография

(Ba2+ ^|а+-обмен) C — (48) и (92) (1 мМ)/TP или PNP/глюкозо-Ьб-дифосфат

(5 х 10-4 М) HOCH2CH2SH (50—100 мМ); Трис-буфер (pH 7.0)

Недавно Монтсеррат и сотр. (J.M. Montserrat et al.) описали химико-ферментативный синтез нуклеозидов из D-рибозы, 2-дезокси-О-рибозы и D-арабинозы [130]. Пен-тозы были превращены в 5-фосфаты (в виде натриевых солей) химическими методами с использованием в некоторых случаях липаз для введения/удаления защитных групп. Совместное действие PPM, которая катализирует превращение 5-фосфатов в 1-фосфаты, и конденсация последних с гетерооснованиями в присутствии PNP или TP приводили к образованию соответствующих нуклеозидов (схема 20).

Работа Монтсеррат и сотр. представляет значительный интерес как пример рационального химико-ферментативного синтеза О-пентофуранозо-5-фосфатов (ср., например, с данными работ [118, 119, 121-123]). В первую очередь следует отметить универсальность подхода

к синтезу О-пентофуранозо-5-фосфатов, так как использование липаз для региоселективного введения и удаления ацетильных защитных групп не лимитируется, по-видимому, изученными пентозами.

Значительный интерес представляет синтез 9-(2-дезокси-2-фтор-Р - 0-арабинофуранозил)пури-нов, описанный в работе Ямада и сотр. (К. Yamada et al.) [131, 132]. В этом случае отсутствуют простые и надежные методы синтеза потенциального донора углеводного фрагмента, и поэтому химический синтез 2-дезокси-2-фтор-а-О-арабинофуранозо-1-фосфата (96) и его использование в качестве универсального гликозилирующего агента представляет резонную альтернативу химическому гликозилированию гетерооснований (схема 21). Исходным соединением служила коммерчески доступная

BzO

(93)

HBr

BzO

(94)

Фосфорилирующий реагент: H3PO4/BU3N/CH3CN +

мол. сита 4А/ Bu3N (20°C, 1 ч) + Bu4NI (10 мин)

1. H3PO4/ мол. сита 4Â/MeCOEt (80°C, 2 ч)

(соотношение а/р = 3.1; 56%)

2. NH4OH/MeOH_

Cхемa 21

NH,

О

нолрДон

но

(95)

но и

VOH 0О

(96)

N

iXJ

Аденин (4 ммол^/PNP (2000 ед.) HO^ Q N' 20 мМ K-фосфатный буфер (pH 7.6), У ¿Л

50°С, 144ч Фильтрация через мембрану, ODS-колоночная хроматография

Суммарный выход 29% (исходя из бромида (94))

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

НО

(72)

J PNP — экстракт клеток Bacillus stearothermophilus |

Универсальный гликозилирующий агент ферментативного синтеза нуклеозидов

нол>

° ©оОН

( a-D-PF-1p|

Х = OH, NH2, H

Y = рибо; oh, OAlkyl, H, NH2, F арабино; OH, F C2-ß-Me/C2-a-OH, H, F

OH

RK

X Y D-Пентофураноза (D-PF)

o'o °

X Y D-PF-5P

PPM

OH

a-D-PF-1P

UP, TP или PNP

-фосфат

HO^. 0 В

UP и TP - уридин- и тимидинфосфорилазы соответственно

PNP - пурин-нуклеозидфосфорилаза

RK - рибокиназа

PPM - фосфопентомутаза

1-0-ацетил-3,5-ди-0-бензоил-2-дезокси-2-фтор-а^-арабинофураноза (93), которая была превращена в бромид (94) и далее в смесь =3 : 1 а- и ß-фосфатов (96) и (95). Эта смесь без выделения в индивидуальном виде а-аномера (96), который является субстратом PNP, была использована в синтезе №-пуриновых 2-дезокси-2-фтор-Р-0-арабинофуранозилнуклеозидов с удовлетворительным выходом. Следует иметь в виду, что химическое гликози-лирование приводит в ряде случаев к образованию смесей аномеров (пурины и пиримидины) и региоизомеров (пурины) [11, 12].

Анализ приведенных выше результатов приводит к выводу, что узким местом этой стратегии получения нуклео-зидов является трудоемкий и малоэффективный синтез a-D-пентофуранозилфосфатов. Однако, несмотря на это, данная стратегия получения биологически важных нуклео-зидов представляет несомненный интерес и может служить ценным дополнением к рассмотренным выше химико-ферментативным методам.

Недавно нами была предложена новая стратегия синтеза нуклеозидов, которая состоит в последовательном превращении пентоз в нуклеозиды в присутствии ге-терооснований под действием рекомбинантных ферментов E. coli, а именно рибокиназы (RK) (D-пентоза ^ О-пентозо-5-фосфат (D-PF-5P)), фосфопентомутазы (PPM) (D-PF-5P ^ а^-пентофуранозо-1-фосфат (D-PF-1P)) и нуклеозидфосфорилазы (NP) (D-PF-1P + гетероос-нование ^ нуклеозиды) (схема 22) [133].

Получение рекомбинантной RK, а также уридин- (UP), тимидин- (TP) и пурин-нуклеозидфосфорилаз (PNP) было описано нами ранее [134]. Было найдено, что RK катализирует в оптимальных условиях фосфорилирование первичной гидроксильной группы не только D-рибозы и 2-дезокси^-рибозы, но и D-арабинозы и D-ксилозы. Эти данные говорят о возможности использования RK в качестве биокатализатора первой стадии каскадного превращения пентоз в нуклеозиды. Стереоспецифичная С5 ^ С1-транслокация фосфата под действием PPM является резонным мостом в предложенной нами стратегии превра-

щения пентоз в нуклеозиды, и это обстоятельство побудило нас получить рекомбинантную PPM и тестировать возможность практической реализации идеи. Предварительные результаты превращения D-рибозы или 2-дезокси-D-рибозы в пиримидиновые и пуриновые нуклеозиды под действием очищенных рекомбинантных E. coli RK, PPM и нуклеозидфосфорилаз были недавно опубликованы (схема 23) [135].

Анализ оптимальных условий реакции с участием RK [133], PPM и NP [134] обнаружил существенные различия. Принимая это во внимание, были выбраны компромиссные условия каскадного превращения пентоз в нуклеози-ды в одной колбе, которые позволяют удовлетворительно функционировать всем используемым ферментам, а именно: общий объем реакционной смеси 2 мл; состав буферного раствора: 2 мМ ATP, 50 мМ KCl, 3 мМ MnCl2, 20 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 2 мМ пентоза, 2 мМ гетерооснование; температура реакции 20°C; ферменты (в соответствующих единицах): RK 7.65; PPM 3.9; TP 4.5; UP 5.4; PNP 4.68. Результаты превращения D-рибозы и 2-дезокси^-рибозы в пиримидиновые и пуриновые нуклеозиды представлены на схеме 23 и в табл. 1.

Таблица 1. Образование нуклеозидов в каскадном ферментативном синтезе в одной колбе при 20°С (содержание соответствующего нуклеозида (%) в реакционной смеси в определенный отрезок времени)

Время реакции, ч Инозин (99) 2'-Дезокси-инозин (82) Тимидин (3)/ 2'-дезокси-уридин (98)* 1-(ß-D- Рибофуранозил)-тимин (97) / уридин (7)*

0.5 45.9 18.8 14.5/0.9 4.7/27.6

1 46.1 27.3 17.6/1.1 8.5/26.6

24 38.4 38.3 - -

44 - - 34.7/33.2 19.9/17.5

96 29.4 34.4 - -

*Тимидинфосфорилаза (TP) и уридинфосфорилаза (UP) были использованы в синтезе нуклеозидов тимина и урацила соответственно.

ОН НО X

0-рибоза: X = ОН; 2-Дезокси^-рибоза: X = Н

НО

НО X

О- уон

(47), X = ОН

(48), X = Н

Рекомбинантные ферменты Е. соИ:

RK — рибокиназа

РРМ — фосфопентомутаза

ТР — тимидинфосфорилаза

иР — уридинфосфорилаза

PNP — пурин-нуклеозидфосфорилаза

RK

ОН АТР/КС1/МдС12

Тимин/ТР или

урацил/иР

-фосфат Гипоксантин/PNP

НО »у N

о'е °

НО X

ОН

РРМ

(77), X = ОН

(78), X = Н

НО X

R = СН3

(3), X = Н (тимидин)

(97), X = ОН (риботимидин) R = Н

(7), X = ОН (уридин)

(98), X = Н (2 -дезоксиуридин)

(99), X = ОН (инозин)

(82), X = Н (2 -дезоксиинозин)

Примечательно, что образование инозина происходит быстрее в сравнении с образованием 2'-дезоксиинозина и достигает максимального выхода через 30 мин. Следует отметить, что синтез 2'-дезоксирибонуклеозидов пуринов и их аналогов протекал со значительно большей эффек-тивностю в условиях реакции трансгликозилирования в сравнении с синтезом рибонуклеозидов [82-84]. Очевидно, что изученные условия каскадного превращения пен-тоз в нуклеозиды требуют тщательной оптимизации с тем, чтобы добиться высоких выходов желаемых продуктов. На примере синтеза Кладрибина (31) нами было показано, что при соотношении субстратов 2-дезокси-О-рибозы и 2-хлораденина (100) 1.5 : 1 (моль/моль) желаемый про-

дукт образовывался с выходом более 90% (схема 24) [136].

Как уже отмечалось выше, химический синтез а-D-пентофуранозо-1-фосфатов достаточно сложен для того, чтобы эти соединения нашли широкое применение для получения препаративных количеств нуклеозидов. Предварительные результаты каскадного превращения пентоз в нуклеозиды под действием трех ферментов говорят о целесообразности более детального изучения этой стратегии с целью определения области возможного применения и ограничений.

Анализ химических методов получения пенто(гексо)-фуранозо-1-фосфатов [125-132, 137-147], а также различные методы активации аномерного атома углерода (см.

но

он

но

2-Дезокси^-рибоза

ын2

(100)

[ RK+PPM+PNP )

АТР/Ш/МдС12 > 90 %

ын2

Схема 24

щ

но

(31)

Рекомбинантные ферменты Е. соИ:

RK — рибокиназа

РРМ — фосфопентомутаза

— пурин-нуклеозидфосфорилаза

НО

psi;

НО ОН

HÔ)~OH

он он

D-Арабиноза

Гетероциклические основания

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

X

NU <' N" 1 -AN 1 А N Y

H

(104), X = (105), X = NH2; Y= F OMe; Y = NH2

PNP — рекомбинантная пурин-нуклеозидфосфорилаза из E. coli

АсО

АсОУ^ОАс

/Же

ОАс ОАс

АсО

(101)

АсО ОАс (102)

(метод МакДональда)

il

но

о

Р.....О

о \ и он

7—' он но он I

но

(50)

НО ОН

(103)

Гетеро-

основание/

PNP

<Т1 N v

но

(32); X = NH2; Y= F (77%) (34); X = OMe; Y = NH2 (46%)

обзор [139]) показывает, что большинство из них трудоемки и приводят к получению желаемых фосфатов с низкими выходами. Как можно было ожидать, в основном наблюдалось образование смесей аномеров, и только, по-видимому, уникальная «асимметрическая трансформация, индуцированная кристаллизацией» приводит к преимущественному образованию желаемых 2-дезокси-а-0-пентофуранозо-1-фосфатов [85].

Будучи относительно простым, метод, предложенный МакДональдом (D.L. MacDonald) [140-144], представляется наиболее эффективным и побудил нас применить его для синтеза а^-пентофуранозо-1-фосфатов. Следует отметить, что метод МакДональда показал свою эффективность в синтезе гексопиранозо-1-фосфатов и только в работе Аспиналла и сотр. (G.O. Aspinall et al.) он был использован для получения a-L-арабинофуранозо^-фосфата: выдерживание перацетилпроизводного L-арабинофуранозы (смесь а,р-аномеров) в безводной фосфорной кислоте и безводном THF при 50°С в течение 2 ч давало после обработки реакционной смеси смесь L-арабинофуранозо-1-фосфата (преимущественно a-L-аномер) и L-арабинопиранозо-!-фосфата (оба в виде циклогексиламмониевых солей) с суммарным выходом 19% [147]. Следует отметить, что убедительных физико-химических данных в пользу указанных структур не было представлено.

Принимая во внимание, что большое число пуриновых и пиримидиновых p-D-арабинофуранозидов проявляют

высокую противовирусную и противоопухолевую активность (см. выше, а также [18, 19, 148-150]), мы обратились к синтезу О-арабинофуранозо-1-фосфата по МакДональду и использовали его для синтеза пуриновых нуклеозидов. Свежеполученный тетраацетат D-арабинозы представлял смесь а,р-аномеров фуранозной (101) и пиранозной (102) форм (ср., [151]), и его обработка по МакДональду приводила к образованию аморфной смеси a-D-арабинофуранозо-1-фосфата (50) и ß - О-арабинопиранозо-1-фосфата (103) (=50% суммарный выход; соотношение изомеров от 1.5 : 8 до 1 : 2, согласно 'H-ЯМР). Эта смесь была протестирована в реакции с 2-фтораденином (104) и 2-амино-6-метоксипурином (105), катализируемой рекомбинантной PNP E. coli.

Было найдено, что 1-фосфат пиранозной формы (102) не ингибирует в оптимальных условиях (водный раствор, pH 7.0, 55°С; 1 ч) синтез 9-ф-0-арабинофуранозил)-2-фтораденина ((32); Флюдарабин), который был выделен с 77% выходом (схема 25) [152]. Неожиданным представляется тот факт, что скорость образования Флударабина была подобна скорости синтеза 2-фтораденозина из a-D-рибофуранозо-1-фосфата (Sigma) и 2-фтораденина (104) в присутствии рекомбинантной PNP E. coli.

Высокая скорость образования Флударабина оказалась неожиданной (ср., [130]). С химической точки зрения, конденсация а^-пентофуранозо-1-фосфатов с гетерооснова-ниями происходит в результате нуклеофильной атаки ато-

Таблица 2. Результаты оптимизации пространственной структуры а(р)-0-пентофураноза(пираноза)-1-фосфатов (в виде мононатриевых) солей методом ab initio (HyperChem, 8.1; in vacuo, 6-31G* уровень)

Соединение Положительный парциальный заряд на Cl-атоме Полная энергия образования, ккал/моль Конформация пентофуранозного (пиранозного) кольца

(47); Rib/-a1P 0.425 -808 850.3 C1-exo

(48); dRib/-a1P 0.454 -762 140.7 C3-endo

(50); Ara/-a1P 0.464 -808 841.6 ОА-ехо

0.410 -808 868.5 (более стабильна)

(103); Arap-ßlP 0.451 -808 856.8 4Ci (менее стабильна)

ма азота гетерооснования на электрофильный аномерный атом углерода 1-фосфата. Для того чтобы оценить элек-трофильные свойства С1-атома, мы использовали метод ab initio для оптимизации структуры ряда близких по строению фосфатов, а именно 1-фосфатов a-D-рибофуранозы ((47); Rib/-a1P), a-D-2-дезоксирибофуранозы ((48); dRib/alP) и ((50); Ara/-a1P) (табл. 2). Из данных табл. 2 следует, что положительные заряды С1-атомов 2-дезоксирибо-и арабино-фосфатов близки по величине и выше, чем заряд рибо-изомера. Последний, у которого ^ис-расположение фосфатной функции и С2-гидроксила, является более стабильным в сравнении арабино-фосфатом. Пространственные структуры рибо- и 2-дезоксирибо-фосфатов предпочтительны для нуклеофильной атаки, и С2-гидроксил арабино-изомера создает незначительные стерические препятствия подходу основания к С1-атому [152].

Различия в положительном парциальном заряде С1-атомов рибо- и 2-дезоксирибо-фосфатов согласуются с более эффективным транс-дезоксирибо-зилированием в сравнении с транс-рибо-зилированием дезазапуринов [24, 82] и бензимидазолов [24, 83, 84]. Подобная субстратная активность Rib/-a1P и Ara/-a1P в реакции с 2-фтораде-нином объясняется, по-видимому, взаимодействием двух факторов: большим парциальным положительным зарядом С1-атома Ara/-a1P, с одной стороны, и негативным стери-ческим влиянием С2-гидроксила, с другой (ср. с данными работы [130]).

Следует отметить, что расчеты говорят о более высокой термодинамической стабильности обоих конформеров ß-D-арабинопиранозо-1-фосфата, а именно 4С и 4С^ в сравнении с Ara/-a1P. Эти различия, по-видимому, объясняют преимущественное образование пиранозного фосфата в реакции МакДональда.

В отличие от 2-фтораденина, реакция 2-амино-6-метоксипурина (105) и Ara/-a1P (в виде смеси с Arap-ßlP) в присутствии рекомбинантной PNP E. coli в описанных выше условиях достигала равновесия при эквимолярном соотношении исходного гетерооснования и продукта реакции, 2-амино-9-ф^-арабинофуранозил)-6-метоксипурина ((34); Неларабин), который был выделен с выходом 44%.

Этот результат согласуется с ранее описанным синтезом Неларабина с выходом 53% трансарабинозилированием 2-амино-6-метоксипурина (105), использующим 1-(ß-D-арабинофуранозил)урацил (49) в качестве донора углеводного фрагмента и UP и PNP E. coli в качестве биокатализаторов [153].

Ранее нами было найдено, что транс-2-дезоксирибози-лирование ^-ацетилгуанина c тимидином или 2'-дезокси-гуанозином в качестве доноров углеводного остатка и соответственно TP/PNP или PNP в качестве биокатализаторов первоначально приводит к образованию ^2-ацетил-7-(2-дезокси-р^-рибофуранозил)гуанина, который постепенно перегруппировывается в термодинамически более стабильный №-ацетил-9-(2-дезокси-р^-рибофуранозил) гуанин [76]. В описанных выше синтезах Флударабина и Неларабина мы не наблюдали подобного течения реакции. Этот результат позволяет предположить, что электронная структура гетероциклического основания определяет тип связывания гетерооснования в активном центре PNP, что обусловливает региоселективность ферментативной реакции.

заключение

Анализ результатов химико-ферментативного синтеза нуклеозидов убедительно показывает высокую эффективность этой методологии, которая представляет интерес для создания биотехнологических процессов получения биологически важных соединений. Гликози-лирование гетероциклических оснований катализируется двумя типами ферментов: нуклеозидфосфорилазами и N-дезоксирибоз-илтрансферазами; указанные ферменты проявляют различную субстратную специфичность и поэтому взаимно дополняют друг друга с точки зрения их использования в качестве биокатализаторов.

В целом, изложенные выше результаты демонстрируют очевидные преимущества химико-ферментативных методов синтеза нуклеозидов в сравнении с химическими. Во-первых, ферментативные методы полностью отвечают принципам «зеленой химии», так как, как правило, не используют агрессивных реагентов (ацетальдегид - исключение) и органических растворителей. Во-вторых, высокая эффективность ферментативных превращений и стерео-(только ß-D-нуклеозиды!) и региоселективность (исключение - отдельные специфические случаи) упрощают процессы выделения желаемых соединений и повышают их качество. Все это вместе взятое приводит к снижению затрат на производство биологически важных соединений, делает их доступными для широкого изучения, а лекарственные средства - для широкого применения. •

Авторы выражают благодарность Международному научному и технологическому центру (МНТЦ, проект

№ В-1640) за финансовую поддержку настоящего исследования. И.А. Михайлопуло глубоко признателен Фонду Александра фон Гумбольдта (Бонн — Бад-Годесберг, Германия) за постоянное внимание и частичную финансовую поддержку.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Levene P.A., Tipson R.S. // J. Biol. Chem. 1935. V. 111 (2). P. 313-323.

2. Levene P.A., Mandel H. // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1908. V. 41 (2). P. 1905-1909.

3. Levene P.A., Jacobs W.A. // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1909. V. 42 (2). P. 2469-2473.

4. Levene P.A., Jacobs W.A. // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1909. V. 42 (2). P. 2474-2478.

5. Levene P.A., Jacobs W.A. //Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1911. V. 44 (1). P. 746 - 753.

6. Levene P.A., London E.S. // J. Biol. Chem. 1929. V. 83 (2). P. 793-802.

7. Levene P.A., Mori T. // J. Biol. Chem. 1929. V. 83 (2). P. 803-816.

8. Fischer E., Helferich B. // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1914. V. 47 (1). P. 210-235.

9. Gulland J.M., Story L.F. // J. Chem. Soc. 1938. P. 259-261.

10. Michelson A.M. The chemistry of nucleosides and nucleotides. London: Acad. Press, 1963. 600 p.

11. Lukevics E., Zablocka A. Nucleoside Synthesis: Organosilicon Methods. Chichester: Ellis Horwood, 1991. 496 p.

12. Vorbrüggen H., Ruh-Pohlenz C. // Organic reactions / Eds Pa-quette L.A. et al. New York: Wiley, 2000. V. 55. P. 1-630.

13. Bardos Th.J. // Topics Curr. Chem. 1974. V. 52. P. 63-98.

14. Langen P. Antimetabolites of nucleic acid metabolism. New York: Gordon and Breach, 1975. 273 р.

15. Suhadolnik R.J. // Progr. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1979. V. 22. P. 193-291.

16. De Clercq E. // J. Med Chem. 2010. V. 53 (4). P. 1438-1450.

17. De Clercq E. // Med. Res. Rev. 2009. V. 29 (4). P. 611-645.

18. Modified nucleosides_in biochemistry, biotechnology and medicine / Ed. Herdewijn Piet. Wiley-VCH, 2008. 900 p.

19. Famulok M., Hartig J.S., Mayer G. // Chem Rev. 2007. V. 107. P. 3715-3743.

20. Elion G.B. // Science. 1989. V. 244. P. 41-46.

21. Gandhi V., Plunkett W. // Curr. Opinion Oncol. 2006. V. 18. P. 584590.

22. Bonate P.L., Arthaud L., Cantrell, Jr., W.R., et al. // Nature Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. P. 855-863.

23. De Clercq E. // Intern. J. Antimicrob. Agents. 2009. V. 33. P. 307-320.

24. Mikhailopulo I.A. // Current Org. Chem. 2007. V. 11. P. 317-335.

25. Montgomery J.A. // J. Med. Chem. 1980. V. 23 (10). P. 1063-1067.

26. Montgomery J.A. // Heterocycles. 1984. V. 21 (1). P. 137-150.

27. De Crercq E. // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. V. 1. P. 13-25.

28. Ftorafur. An anticancer drug. (Pamphlet) / Compiled by Germane S., et al. Riga: Zinatne, 1979. 358 р.

29. Buie L.B., Epstein S.S., Lindley C.M. // Clin. Therapeutics. 2007. V. 29 (9). P. 1887-1899.

30. De Clercq E. // Nature Rev. Drug Discovery. 2007. V. 6. P. 1001-1018.

31. De Clercq E. // Antiviral Res. 2010. V. 85 (1). P. 19-24.

32. De Clercq E. // Adv. Virus Res. 2009. V. 73. P. 1-53.

33. Ferir G., Kaptein S., Neyts J., De Clercq E. // Rev. Med. Virol. 2008. V. 18. P. 19-34.

34. Vivet-Boudou V., Didierjean J., Isel C., Marquet R. // Cell. Mol. Life Sci. 2006. V. 63. P. 163-186.

35. Schaeffer H.J., Bhargava P.S. // Biochemistry. 1965. V. 4 (1). P. 71-76.

36. Schaeffer H.J., Vince R. // J. Med. Chem. 1965. V. 8 (1). P. 33-35.

37. Schaeffer H.J., Gurwara S., Vince R., Bittner S. // J. Med. Chem. 1971. V. 14 (4). P. 367-369.

38. Schaeffer H. J., Beauchamp L., de Miranda P., et al. // Nature. 1978. V. 272. P. 583-585.

39. De Clercq E., Holy A. // Nature Rev. Drug Discovery. 2005. V. 4. P. 928-940.

40. Levene P.A., Medigreceanu F. // J. Biol. Chem. 1911. V. 9 (3). P. 375-387.

41. Levene P.A., Medigreceanu F. // J. Biol. Chem. 1911. V. 9 (3). P. 389-402.

42. Levene P.A., Yamagawa M., Weber I. // J. Biol. Chem. 1924. V. 60 (3). P. 693-706.

43. Levene P.A., Weber I. // J. Biol. Chem. 1924. V. 60 (3). P. 707-715.

44. Levene P.A., Weber I. // J. Biol. Chem. 1924. V. 60 (3). P. 717-720.

45. Jones W. // J. Biol. Chem. 1911. V. 9 (2). P. 129-137.

46. Jones W. // J. Biol. Chem. 1911. V. 9 (2). P. 169-180.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

47. Levene P.A., Yamagawa M., Weber I. // J. Biol. Chem. 1924. V. 60 (3). P. 693-706.

48. Levene P.A., Weber I. // J. Biol. Chem. 1924. V. 60 (3). P. 707-715.

49. Levene P.A., Weber I. // J. Biol. Chem. 1924. V. 60 (3). P. 717-720.

50. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. // Pharm. Ther. 2000. V. 88. P. 349-425.

51. Kalckar H.M. // Federation Proc. 1945. V. 4. P. 248-250.

52. Kalckar H.M. // J. Biol. Chem. 1947. V. 167 (2). P. 477-486.

53. Manson L.A., Lampen J.O. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193 (2). P. 539-547.

54. Araki T., Ikeda I., Matoishi K., et al. Eur. Pat. Appl. 2002, 32 p. CODEN: EPXXDW EP 1254959 A2 20021106 CAN 137:348820 AN 2002:847552 CAPLUS

55. Usowa E., Maltseva T., Földesi A., et al. // J. Mol. Biol. 2004. V. 344. P. 1347-1358.

56. Lewkowics E.S., Iribarren A.M. // Curr. Org. Chem. 2006. V. 10 (11). P. 1197-1215.

57. Friedkin M., Roberts D. // J. Biol. Chem. 1954. V. 207 (1). P. 245-256.

58. Friedkin M., Roberts D. // J. Biol. Chem. 1954. V. 207 (1). P. 257-266.

59. Duschinsky R., Pleven E., Rlalbica J., Heidelberger C. // Abstracts, 132nd National Meeting of the American Chemical Society. New York, 1957. P. 19-C.

60. Duschinsky R. US Patent 3,168,513 (1965).

61. Hoffer M., Duschinsky R., Fox J.J., Yung N. // J. Am. Chem. Soc. 1959. V. 81 (15). P. 4112-4113.

62. Hoffer M. // Chem. Ber. 1960. V. 93. P. 2777-2781.

63. Heidelberger C., Parsons D.G., Remy D.C. // J. Am. Chem. Soc. 1962. V. 84 (18). P. 3597-3598.

64. Heidelberger C., Parsons D.G., Remy D.C. // J. Med. Chem. 1964. V. 7. P. 1-5.

65. Friedkin M., Kalckar H.M. // The Enzymes, 2nd ed. / Eds Boyer P.D., Lardy H., Myrbäck K. New York: Acad. Press, 1961. V. 5. P. 237-255.

66. Heidelberger C., Ansfield F.J. // Cancer Res. 1963. V. 23. P. 12261243.

67. Heidelberger C. // Progr. Nucleic Acid. Res. Mol. Biol. 1965. V. 4. P. l-50.

68. Heidelberger C. // Annu. Rev. Biochem. 1975. V. 44. P. 79-121.

69. Kalinichenko E.N., Barai V.N., Bokut S.B., et al. // Biotechnol. Lett. 1989. V. 11. P. 621-626.

70. Tuttle J.V., Tisdale M., Krenitsky T.A. // J. Med. Chem. 1993. V. 36. P. 119-125.

71. Tuttle J.V., Krenitsky T.A. EP 0285432 B1 (Wellcome Found, GB), Publ. 1988-10-05.

72. Zinchenko A.I., Barai V.N., Bokut S.B., et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. V. 32. P. 658-661.

73. Zaitsewa G.V., Zinchenko A.I., Barai V.N., et al. // Nucleosides Nucleotides. 1999. V. 18. P. 687-688.

74. Zaitseva G.V., Kvasyuk E.I., Vaaks E.V., et al. // Nucleosides Nucleotides. 1994. V. 13. P. 819-834.

75. Esipov R.S., Gurevich A.I., Chuvikovsky D.V., et al. // Protein Expes. Purif. 2002. V. 24. P. 56-60.

76. Roivainen J., Elizarova T., Lapinjoki S., et al. // Nucleosides, Nucleotides, &.Nucleic Acids. 2007. V. 26. P. 905-909.

77. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. // Z. Naturforsch. 1990. V. 45c. P. 59-70.

78. Koellner G., Bzowska A., Wielgus-Kutrowska B., et al. // J. Mol. Biol. 2002. V. 315. P. 351-371.

79. Krenitsky T.A., Rideout J.L., Koszalka G.W., et al. // J. Med. Chem. 1982. V. 25. P. 32-35.

80. Krenitsky T.A., Rideout J.L., Chao E.Y., et al. // J. Med. Chem. 1986. V. 29. P. 138-143.

81. Hennen W.J., Wong C.-H. // J. Org. Chem. 1989. V. 54. P. 4692-4695.

82. Mikhailopulo I.A., Zinchenko A.I., Bokut S.B., et al. // Biotechnol. Lett. 1992. V. 14 (10). P. 885-890.

83. Mikhailopulo I.A., Kazimierczuk Z., Zinchenko A.I., et al. // Nucleosides Nucleotides. 1995. V. 14 (3-5). P. 477-480.

84. Mikhailopulo I.A., Kazimierczuk Z., Zinchenko A.I., et al. // Nucl. Acids Symp. Ser. № 31. 1994. P. 83-84.

85. Doskocil J., Holy A. // Coll. Czech. Chem. Commun. 1977. V. 42. P. 370-383.

86. Rosemeyer H., Seela F. // J. Org. Chem. 1987. V. 52. P. 5136-5143.

87. Colacino J. M., DeLong D. C., Nelson J. R., et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1990. V. 34. P. 2156-2163.

88. Ehlhardt W. J., Wheeler W. J., Breau A.P., et al. // Drug Metabolism Disposition. 1993. V. 21. P. 162-170.

89. Hayden F.G., Tunkel A.R., Treanor J. J., et al. // Antimicrob. Agents. Chenther. 1994. V. 38. P. 1178-1181.

90. Ling F., Inoue Y., Kimura A. // Appl. Envirom. Microbiol. 1990. V. 56 (12). P. 3830-3834.

91. Shirae H., Yokozeki K. // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55 (7). P. 1849-1857.

92. Cardinaud R. // Methods Enzymol. 1978. V. 51. P. 446-455.

93. Anand R., Kaminski P.A., Ealick S.E. // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 2384-2393.

94. McNutt W.S. // Biochem. J. 1952. V. 50. P. 384-397.

95. Roush A.H., Betz R.F. // J. Biol. Chem. 1958. V. 233. P. 261-266.

96. Beck W.S., Levin M. // J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 702-709.

97. Holguin L., Cardinaud R. // Eur. J. Biochem. 1975. V. 54. P. 505-514.

98. Huang M.-C., Hatfield K., Roetker A.W., et al. // Biochem. Pharmacol. 1981. V. 30. P. 2663-2671.

99. Holguin L., Cardinaud R., Salemink C.A. // Eur. J. Biochem. 1975. V. 54. P. 515-520.

100. Carson D.A., Wasson D.B. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 155. P. 829-834.

101. Cook W.J., Short S.A., Ealick S.E. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 2682-2683.

102. Smar M., Short S.A., Wolfenden R. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 7908-7912.

103. Freeman G.A., Shaver S.R., Rideout J.L., Short S.A. // Bioorg. Med. Chem. 1995. V. 3. P. 447-458.

104. van Draanen N.A., Freeman G.A., Short S.A., et al. // J. Med. Chem. 1996. V. 39. P. 538-542.

105. Armstrong S.R., Cook W.J., Short S.A., Ealick S.E. // Structure. 1996. V. 4. P. 97-107.

106. Cheng J.C.-Y., Hacksell U., Daves G.D., Jr. // J. Org. Chem. 1985. V. 50 (15). P. 2778-2780.

107. Walker J.A., II, Chen J.J., Wise D.S., Townsend L.B. // J. Org. Chem. 1996. V. 61 (6). P. 2219-2221.

108. Porter D.J.T., Merrill B.M., Short S.A. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270 (26). P. 15551-15556.

109. Kaminski P.A. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 14400-14407.

110. Kaminski P.A., Dacher P., Dugue L., Pochet S. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 20053-20059.

111. Uerkvitz W. // Eur. J. Biochem. 1971. V. 23. P. 387-395.

112. Chapeau M.-C., Marnett L.J. // Chem. Res. Toxicol. 1991. V. 4. P. 636-638.

113. Müller M., Hutchinson L.K., Guengerich F.P. // Chem. Res. Toxicol. 1996. V. 9. P. 1140-1144.

114. Parkin D.W. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271 (6). P. 21713-21719.

115. Pelle R., Schramm V.L., Parkin D.W. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273 (4). P. 2118-2126.

116. Tozzi M.G., Camici M., Mascia L., et al. // FEBS J. 2006. V. 273. P. 1089-1101.

117. Ouwerkerk N., van Boom J.H., Lugtenburg J., Raap J. // Eur. J. Org. Chem. 2000. V. 5. P. 861-866.

118. Ouwerkerk N., Steenweg M., De Ruijter M., et al. // J. Org. Chem.

2002. V. 67. P. 1480-1489.

119. Ogawa J., Saito K., Sakai T., et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem.

2003. V. 67. P. 933-936.

120. Ishige T., Honda K., Shimizu S. // Curr. Opinion Chem. Biol. 2005. V. 9. P. 174-180.

121. Horinouchi N., Ogawa J., Kawano T., et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 71. P. 615-621.

122. Horinouchi N., Ogawa J., Kawano T., et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. V. 70. P. 1371-1378.

123. Horinouchi N., Ogawa J., Kawano T., et al. // Biotechnol. Letters. 2006. V. 28. P. 877-881.

124. Horinouchi N., Kawano T., Sakai T., et al. // New Biotechnol. 2009. V. 26 (1/2). P. 75-82.

125. Komatsu H., Awano H., Tanikawa H., et al. // Nucleosides Nucleotides Nucl. Acids. 2001. V. 20. P. 1291-1293.

126. Komatsu H., Awano H. // J. Org. Chem. 2002. V. 67. P. 5419-5421.

127. Komatsu H., Awano H., Ishibashi H., et al. // Nucl. Acids Res. Suppl. № 3. 2003. P. 101-102.

128. Komatsu H., Araki T. // Nucleosides Nucleotides Nucl. Acids. 2005. V. 24 (5-7). P. 1127-1130.

129. Komatsu H., Araki T. // Tetrahedron Lett. 2003. V. 44. P. 2899-2901.

130. Taverna-Porro M., Bouvier L.A., Pereira C.A., et al. // Tetrahedron Lett. 2008. V. 49. P. 2642-2645.

131. Yamada K., Matsumoto N., Hayakawa H. // Nucl. Acids Symp. Ser. No. 48. 2004. P. 45-46.

132. Yamada K., Matsumoto N., Hayakawa H. // Nucleosides Nucleotides Nucl. Acids. 2009. V. 28. P. 1117-1130.

133. Chuvikovsky D.V., Esipov R.S., Skoblov Y.S., et al. // Bioorg. Med. Chem. 2006. V. 14. P. 6327-6332.

134. Esipov R.S., Gurevich A.I., Chuvikovsky D.V., et al. // Protein Expres. Purif. 2002. V. 24. P. 56-60.

135. Mikhailopulo I.A., Konstantinova I.D., Fateev I.V., et al. // The 2nd International Conference on Drug Discovery & Therapy: Abstracts. Dubai, 2010. P. 123. (ICDDT_AbstractBook.pdf, p. 123).

136. Miroshnikov A.I., Esipov R.S., Konstantinova I.D., et al. // Nucleo-sides Nucleotides Nucl. Acids. 2010. In press.

137. de Lederkremer R.M., Nahmad V.B., Varela O. // J. Org. Chem. 1994. V. 59. P. 690-692.

138. Euzen R., Ferrieres V., Plusquellec D. // J. Org. Chem. 2005. V. 70. P. 847-855.

139. Hanessian S., Lou B. // Chem. Rev. 2000. V. 100. P. 4443-4463.

140. MacDonald D.L. // J. Org. Chem. 1962. V. 27. P. 1107-1109.

141. MacDonald D.L. // Carbohyd. Res. 1966. V. 3. P. 117-120

142. MacDonald D.L. // Carbohyd. Res. 1968. V. 6. P. 376-381.

143. Mendicino J., Hanna R. // J. Biol. Chem. 1970. V. 245. P. 6113-6124.

144. Chittenden G.J.F. // Carbohyd. Res. 1972. V. 25. P. 35-41.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

145. Wright R.S., Khorana H.G. // J. Am. Chem. Soc. 1958. V. 80. P. 1994-1998.

146. Maryanoff B.E., Reitz A.B., Nortey S.O. // Tetrahedron. 1988. V. 44. P. 3093-3106.

147. Aspinall G.O., Cottrell I.W., Matheson N.K. // Can. J. Biochem. 1972. V. 50. P. 574- 5 8 0.

148. Larson R.A. // Seminar Oncol. 2007. V. 34 (Suppl. 5). P. S13-S20.

149. Gandhi V., Plunkett W. // Curr. Opinion Oncol. 2006. V. 18. P. 584-590.

150. Bonate P.L., Arthaud L., Cantrell, Jr., W.R., et al. // Nature Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. P. 855-863.

151. Kobayashi M. // Tetrahedron. 2002. V. 58. P. 9365-9371.

152. Konstantinova I.D., Antonov K.V., Fateev I.V., et al. // Nucleosides Nucleotides Nucl. Acids. 2010. In press.

153. Averett D.R., Koszalka G.W., Fyfe J.A., et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1991. V. 35. P. 851-857.

Современные тенденции в биотехнологии нуклеозидов Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Михайлопуло И. А., Мирошников А. И.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Михайлопуло И. А., Мирошников А. И.

Текст научной работы на тему «Современные тенденции в биотехнологии нуклеозидов»