CC BY
23
УДК 615.9+577.472(28):614+577.4
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ 2-С-МЕТИЛ-й-ЭРИТРИТ-2,4-ЦИКЛОДИФОСФАТА
А.А. Санданов, В.Ж. Цыренов, Д.Н. Островский
Восточно-Сибирский государственный технологический университет, Российская Федерация, 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская , 42б. vtsyrenov@gmail.com
В статье рассмотрен процесс биосинтеза 2-С-метилЮ-эритрит-2,4-циклодифосфата (МЭЦ) различными коринеподобными бактериями. Установлен наиболее эффективный продуцент 2-С-метил-D-эритрит-2,4-циклодифосфата. Определен выход продукта. С помощью ионообменной хроматографии произведена количественная оценка различных фосфорных соединений, содержащихся в клеточном экстракте, полученного из клеток культивированных в присутствии редокс-медиатора. Полученный штамм-продуцент может быть использован для получения препаратов МЭЦ для потребностей фармацевтической биотехнологии. Ил. 2. Табл. 2. Библиогр. 6 назв.
Ключевые слова: 2-С-метил^-эритрит-2,4-циклодифосфат, Corynebacterium, немевалонатный путь, биосинтез изопреноидов, окислительный стресс.
ВВЕДЕНИЕ
2-С-метил^-эритрит-2,4-ци клопи рофосфат (МЭЦ) - интермедиат немевалонатного пути биосинтеза изо преноидов. 2-С-метил^-эритрит-2,4-циклодифосфат способствует возврату дор-мантных клеток Mycobacterium smegmatis в активное состояние [1].
В данной работе была поставлена цель: изучить способность отдельных штаммов кор инепо-добных бактерий синтезировать 2-С-метил^-эритрит-2,4-ци клоди фосфат.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Хранение и культивирование микроорганизмов. Объектом исследования явились представители группы коринебакте рий: Cory-nebacterium ammoniagenes ВСТИ 403, Coryne-bacterium flavum ВСТИ 301, Corynebacterium species ВСТИ 4, из коллекции ФГУП «ГосНИИ-генетика» и коллекции кафедры биотехнологии ВСГТУ. Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872, Micrococcus lysodelkticus (luteus) коллекция института биохимии им. А.Н.Баха. Длительное хранение штамма (до 6 мес.) проводилось под слоем вазелинового масла. Культуру после роста при 30 оС на скошенном мя-сопептонном агаре МПА заливали маслом на
1 см выше края питательной среды и сохраняли при 4 оС. До двух недель штамм можно хранить в этих условиях без заливки маслом, Пересев производили каждые 1,5-2 мес. Петлей брали материал из-под масла, производили разведение клеток в стерильном физиологическом растворе. Для приготовления посевного материала использовался только свежепере-сеянный косяк, выращенный в течение суток при 30 оС.
Подготовка питательной среды. Посевная среда содержала: 20 г D-глюкозы моногидрата, 10 г пептона, 10 г дрожжевого экстракта и 2,5 г NaCl на 1 л воды. Перед стерилизацией pH доводили до 7,2 с помощью 3 н NaOH. Ино-кулят (10%) готовили на посевной среде. Культуру микроорганизмов объемом по 50 мл выращивали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл.
Ферментационная среда Nutrient broth M002 (Himedia) содержала 50 г глюкозы моно-гид рата, 3 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л воды. Для осуществления биосинтеза МЭЦ ферментационную среду разливали по 200 мл в качалочные колбы на 750 мл, доводили pH 5 н NaOH до 7,6 и стерилизовали в течение 15 мин при 1 атм.
Условия ферментации. Культуру с 2-суточного косяка петлей переносили в 200 мл посевной среды и помещали на круговую качалку (220 об/мин). После суток роста при 30 ± 1 оС посевной культурой в количестве 10 об.% инокулировали ферментационную среду. Для осуществления синтеза 2-С-метил-D-эритрит-2,4-циклодифосфата в ферментационную среду добавляли бензилвиологен 50 мкг/мл, а также глюкозу 40% 10 мл после 24 ч ферментации. Продолжительность ферментации составляла 48 ч.
Определение роста микроорганизма. Наблюдения за ростом клеток проводили измерением оптической плотности при 578 нм. Отбирали 1 мл аликвоту культуральной жидкости, разбавляли её 3 мл дистиллированной воды. Осадок после низкоскоростного центрифугирования ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды и измеряли мутность. Для вычисления сухого веса пользовались калибровочной кривой.
Хроматография. Бумажную хроматографию нуклеотидов и их производных проводили на бумаге Whatman. Для разделения нуклео-тидов использовали систему растворителей изомасляная кислота - 1 М аммиак - вода (20 : 12 : 3), для нуклеозидов и оснований -использовали систему растворителей бутанол-1-уксусная кислота-вода (4 : 1 : 5) [2]
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) клеточного экстракта с градиентной элюцией выполнялась по методу [4] с использованием хроматографа Agilent 1100 (производство США), оснащенного ультрафиолетовым детектором переменной частоты, установленным на 254 нм. Элюент А содержал 20 мл концентрированной фосфорной кислоты в 800 мл деионизованной воды с доведенным до 4,0 pH с помощью 25% NaOH, и объемом, доведенным водой до 1 л. Элюент B содержал равные объемы ацетонитрила и метанола. Все реактивы фильтровали через фильтр (5 мкм). Элюцию нуклеотидов с колонки C18 5 р проводили при температуре 37 оС. Для использования в качестве стандартов в элюенте А растворяли рибонуклеотиды 5'-АМФ и АТФ (0,1 М стандартные растворы нуклеотидов). Скорость элюции -0,7 мл/мин. В течение первых 5-ти минут элюция была изократической (100% элюент А), затем в течение 15 мин следовал линейный градиент (85% элюент А, и 15% элюент Б). Затем подвижная фаза вновь устанавливалась на 100% элю-ента А в течение 5 мин. Новый образец наносили после уравновешивания в течение 15 мин 100% элюентом А.
Спектрофотометрический анализ. Содержание нуклеотидов в элюате контролировали, измеряя поглощение при 260 нм каждой фракции против воды. Фракции отдельных нуклеотидов объединяли. Содержание нуклео-тидов определяли спектрофотометрически с
использованием коэффициентов молярных экстинкций [5].
Идентификация 2-С-метил-й-эритрит-2,4-циклодифосфата и его количественное определение. Биомассу бактерий осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 3800 об/мин и её экстрагировали 50% раствором этанола при комнатной температуре в течение 1 ч из расчета 10 мл раствора на 1 г биомассы. Экстракт отделяли центрифугированием, лиофильно сушили и растворяли в воде с содержанием D20 не менее 20% так, чтобы 1 мл этого раствора соответствовал = 2 г сырой биомассы. Этот раствор использовали для регистрации 31Р-ЯМР (спектрометр фирмы «Bruker» (США), модель AMX-400), внешний стандарт Na-соль этилендиаминтет-рафосфоновой кислоты в D20 с химическим сдвигом 12,78 м.д. относительно 85%-ной ор-тофосфорной кислоты. Образцы помещали во вращающиеся лампы диаметром 10 мм при температуре 24 оС. Рабочая частота спектрометра 1 б1,98 МГц, импульс 45о, время задержки 2 с. При двумерной спектроскопии заданный импульс 0о, импульсная последовательность Д1 = 90о, Д2 = 45о, время задержки 0 с.
Молярную концентрацию 2-С-метил^-эритрит-2,4-циклодифосфата рассчитывали по интегралу спектра 3 Р-ЯМР путем сравнения со спектром известной навески NADP при отнесении интегралов к интенсивности сигналов стандарта.
Для выделения и очистки 2-С-метил^-эритрит-2,4-циклодифосфата с сигналом 3 Р-ЯМР с химическим сдвигом 14,8 м.д. клетки выращивали в присутствии радиоактивного фосфата (10 Мбк на 1 мл) либо [14C] гидроли-зата белка (0,2 Мбк на 1 мл), экстракты наносили на колонку с анионобменником Dowex 1 х4 (Serva) в формиатной форме, проводя, затем, элюцию в градиенте 0-1,7 М формиата аммония pH 4,0.
Элюат с колонки анализировали на содержание радиоактивности и поглощение при 260 нм, а также на наличие сигналов 31Р-ЯМР. Радиоактивность измеряли в счетчике SL-4000 Intertechnique (Франция), помещая 0,1 мл образца во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8.
В опытах использовали препарат 2-С-метил^-эритрит-2,4-циклодифосфата, полученный в лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Исследуемые микроорганизмы культивировали в отсутствии или присутствии бензилвио-логена или другого редокс медиатора, клетки экстрагировали этанолом и экстракт затем использовали в качестве образца для снятия спектров 31Р-ЯМР, по интенсивности их сигна-
фосфорное соединение
10,00
5,00
0,00
-5,00 -10,00
Химический сдвиг, м.д. 31г
-15,00 -20,00 -25,00
10,00
5,00
0,00
-5,00 -10,00 Химический сдвиг, м.д.
-15,00
-20,00
-25.00
Рис. 1. Спектр Р-ЯМР-экстрактов из клеток Corynebacterium flavum ВСТИ 301, выращенных в отсутствии (а) и в присутствии (б) бензилвиологена (50 мкг на 1 мл среды). Традиционное отнесение сигналов: 1 - фосфодиэфиры, 2 - ортофосфат, 3 - фосфодиэфиры, 4 - гамма-фосфор-нулеозидди и трифосфаты, 5 - альфа-фосфор-нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфатов, 6 - NAD, 7 - UDP-caxapa, 8 - бэта-фосфор-нуклеозндтрифос-фаты. ФС - фосфорное соединение. Спектры 31Р-ЯМР экстрактов из бактерий сняты в Институте органической химии РАН (г. Москва)
лов определяли концентрацию фосфорных соединений.
Установлено, что в клетках большинства исследуемых нами культур коринеподобных бактерий происходит в той или иной мере накопление фосфорного соединения с химическим сдвигом в спектре 31Р-ЯМР = -14,8 м.д. Это иллюстрирует рис. 1, где приведен спектр 31Р-ЯМР-экстракта из клеток Corynebacterium flavum ВСТИ 301, после их инкубации с бен-зилвиологеном.
Данные соединения в клетках всех исследуемых организмов в отсутствие редокс медиатора, что впервые показано на примере культур Micrococcus luteus и Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872, а соответствующее соединение идентифицировано как 2-С-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфат (МЭЦ) [3,7]
Как видно на рис. 1а, в отсутствие бензилвиологена в клетке после их инкубации обнаруживается большее количество (около 8) сигналов фосфорных соединений, относимых к
фосфомоноэфирам, ортофосфату, нуклео-зидфосфатам и другим соединениям. Также видно, что в присутствии редокс медиатора бензилвиологена количество сигналов уменьшается до трех и одним из них (сигнал 3) является новым сигналом вещества, индуцированного редокс медиатором. Данное вещество в случае использования Micrococcus luteus, Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 Островским и сотр. был идентифицирован как МЭЦ [3].
Как видно из табл. 1, в клетках коринепо-добных бактерий в присутствии бензилвиоло-гена наблюдается накопление фосфорного соединения с химическим сдвигом в спектре 31-Р-ЯМР = -14,8 м.д., которое исходя из данных литературы предварительно идентифицировано как МЭЦ.
Для уточнения идентификации -14,8 м.д. фосфорного соединения МЭЦ, обращающегося в клетках 301 и для дополнительной его количественной оценки проводили его очистку и
Таблица 1
Содержание фосфорного соединения с химическим сдвигом в спектре 31Р-ЯМР = -14,8 м. д. в клетке у различных штаммов коринеподобных бактерий, выращенных п присутствии редокс-медиатора бензилвиологена в концентрации 100 мкг/мл
Микроорганизмы Содержание фосфорного соединения 14 м.д., отнесенное к общему фосфору и к суммарному фосфору нуклеотидполифосфатов и нуклеотидов, в %
Робш Рнукл
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 12,7 ± 1,0 26,8 ± 2,5
Corynebacterium ammoniagenes ВСТИ 403 11,4 ± 1,0 21,5 ± 2,5
Corynebacterium flavum ВСТИ 301 14,2 ± 1,5 25,8 ± 2,5
Corynebacterium ammoniagenes ВСТИ 404 12,9 ± 1,5 23,3 ± 2,5
Corynebacterium insidiosum 224 3,2 ± 0,3 5,7 ± 0,5
Corynebacnerium stationis 336 3,6 ± 0,3 4,1 ± 0,5
Corynebacterium linenens 242 2,4 ± 0,3 4,8 ± 0,5
выделение по методу основанному на использовании ионообменной хроматографии и изотопного анализа [3]. Для этого биомассу (около 2х г.) С. flavum ВСТИ 301, выращенную в присутствии радиоактивного фосфата, отделяли центрифугированием, инкубировали с бензилвиолгеном и экстрагировали этанолом, образец экстракта наносили на хроматографи-ческую колонку. Проводили ионообменную хроматографию этанольного экстракта клеток бактерий.
Хроматографические исследования начаты с постановки модельного опыта с радиоактивным препаратом 32P 2-C-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфата который мы использовали в качестве реперного соединения. Было показано, что МЭЦ элюируется в виде одного пика по радиоактивности. Затем осуществляли хроматографию этанольных экстрактов клеток C. flavum ВСТИ 301, полученных соответственно после инкубации с редокс медиатором бензил-виологеном (рис. 2) и без него (контроль). Показано, что хроматографические профили опыта и контроля по показателю содержания УФ-поглощающих веществ (по A260) одинаковы: в том и в другом случае обнаруживаются 3 пика веществ которые были идентифицированы как производные нуклеотидов и других низкомолекулярных компонентов нуклеиновых кислот. Хроматографические профили опыта (рис. 2) и контроля по результатам анализа содержания
113
радиоактивности в элюатах с колонки обнаруживали существенные различия.
На основе данных спектра 31Р-ЯМР-экстрактов из клеток Corynebacterium ammo-niagenes ВСТИ 301 в присутствии бензилвио-логена (опыт, рис. 2) и в его отсутствии (контроль) и сравнении с данными литературы [3, 7], фосфорные соединения в экстракте клеток исследуемых бактерий, синтез которых индуцируется бензилвиологеном, нами идентифицирован как 2-^метил^-эритритол-2,4-циклодифосфат (МЭЦ)
Для микробиологического синтеза МЭЦ микроорганизмы культивировали в ферментационной среде до конца логарифмической фазы роста и затем вводили водные растворы бензилвиологена двуххлористого до концентрации 75 мкг/л
Из данных табл. 2 следует, что все исследуемые коринеподобные бактерии в ответ на окислительный стресс индуцируемый редокс медиатором осуществляет биосинтез МЭЦ.
Уровень накопления данного метаболита у разных микроорганизмов различается в существенной мере. В случае использования в ферментации C. flavum DCNB 301 выход МЭЦ (30,5 мг/г) сырой биомассы высокий, что позволяет говорить о его сверхсинтезе и данный штамм-продуцент может быть использован для получения препаратов МЭЦ для потребностей фармацевтической биотехнологии.
Рис. 2. Хроматография экстракта клеток СогупеЬаЫепит flavum ВСТИ 301 в присутствии бензилвиологена на колонке йошвх 1x4 (НСОО', 1,6х23 см): в градиенте 0-1,7 М формиата аммония, объем фракций 5 мл, скорость элюции 1 мл/мин, температура 20 оС, 1,2,3,7- пики по оптической плотности при 260 нм, 4,5,6,8 - пики по радиоактивности 32Р
Таблица 2
Содержание МЭЦ в биомассе коринеподобных бактерий, выращенных в среде содержащей 1,5% глюкозы и инкубированных в присутствии бензилвиологена в концентрации 75 мкг
Микроорганизм Количество выросшей биомассы, г/л Содержание МЭЦ, мг/л культуральной жидкости Содержание МЭЦ, мг/г сырой биомассы
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 11,6 320 ± 30 27,8 ± 3
Corynebacterium ammoniagenes ВСТИ 403 12,4 330 ± 30 26,7 ± 3
Corynebacterium flavum ВСТИ 301 11,4 347 ± 35 30,5 ± 3
Corynebacterium ammoniagenes ВСТИ 404 8,9 190 ± 20 21,7 ± 3
Corynebacterium insidiosum 224 7,8 36 ± 3 4,7 ± 3
Corynebacnerium stationis 336 6,4 28 ± 3 4,5 ± 3
Corynebacterium linenens 242 8,5 34 ± 3 4 ± 3
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Испытание коринеподобных бактерий в условиях их окислительного стресса показало, что происходит биосинтез и накопление 2-С-метил-й-эритрит-2,4-циклодифосфата (МЭЦ). Уровень накопления данного метаболита раз-
1. Санданов А.А., Мазикин К.В., Островский Д.Н. Нитроксильные соединения у бактерий // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. ВГУ. 2008. № 10. С. 7-18.
2. Ершов. Ю.В. 2-С-метилэритрофосфатный путь биосинтеза изопреноидов как мишень при поиске новых антибиотиков, гербицидов и иммуномодуляторов // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. № 2. С. 133-157.
3. О природе нового макроэрга, возникающего у бактерий в ответ на окислительный стресс / Щипано-ва И.Н. [и др.]// Биохимия. 1992. № 57. С. 862-871.
личен у различных штаммов. Наиболее высокий выход МЭЦ, представляющий практический интерес для производства, обуславливающий применение Corynebacterium ammoniagenes ВСТИ 301.
КИЙ СПИСОК
4. Венкстерн Т.В., Баев А.А. Спектры поглощения минорных компонентов и некоторых олигонуклеотидов рибонуклеиновых кислот. М. : Наука, 1967.
5. Abbouni B., Elhariry H.M., Auling G. Overproduction of NAD+ and 5'-inosine monophosphate in the presence of 10 microM Mn2+ by a mutant of Corynebacterium ammoniagenes with thermosensitive nucleotide reduction (nrd(ts)) after temperature shift // Arch Microbiol. 2004. № 182. Р. 119-125.
6. Островский, Д.Н. Новые участники окислительного стресса у бактерий // Успехи биологической химии, 1997. Т. 37. С. 147-169.
