CC BY
35
УДК 615.9+577.472(28):614+577.4
О РОЛИ АДЕНИЛАТКИНАЗЫ В SALVAGE СИНТЕЗЕ NAD КОРИНЕФОРМНЫМИ БАКТЕРИЯМИ
В.Ж. Цыренов, Л.В. Тулохонова, Е.М. Подлепа, А.А. Санданов
Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40-А, vtsyrenov@gmail.com.
В работе впервые показано, что ингибирующее действие NAD и NADP в случае их микробиологического синтеза коринеформными бактериями направлено на аделилаткиназу (К.Ф. 2.7.4.3), фермент в аденилатной ветви salvage синтеза NAD. Частично очищенная аденилаткиназа ингибируется также промежуточными метаболитами salvage синтеза НАД. Ил. 9. Табл. 1. Библиогр. 4 назв.
Ключевые слова: NAD; аденилаткиназа; АТР; биосинтез.
ROLE OF ADENYLATE KINASE IN SALVAGE SYNTHESIS OF NAD BY CORYNEFORM BACTERIA
V.Zh. Tsyrenov, L.V. Tulokhanova, E.M. Podlepa, A.A. Sandanov
East Siberian State University of Technology and Management, 40v Kluchevskaya st., Ulan-Ude, 670013, Russia, vtsyrenov@gmail.ru.
Inhibition action of NAD and NADP during biosynthesis of them by coryneform bacteria was shown to be attracted to adenylete kinase (E.C. 2.7.4.3), which is member of adenylate branch of NAD biosynthesis salvage pathway. Pattially purified adenylatekinase was also inhibited by intermediate metabolytes of salvage synthesis of NAD.
9 figures. 1 table. 4 sources.
Keywords: NAD; adenylatekinase; ATP; Biosynthesis.
ВВЕДЕНИЕ
НАД и НАДФ участвуют более чем в 300 окислительно-восстановительных реакциях в качестве коферментов [1]. Эти коферменты используют в качестве реактивов для производства диагностикумов, а также применяются в качестве лекарств.
Наиболее перспективным методом получения NAD и NADP является микробиологический синтез, основанный на применении предшественников - аденина и никотинамида. Данный метод широко используется в биотехнологии для получения нуклеотидов и известен в литературе
как salvage синтез [2].
Успешное применение данного метода синтеза зависит от знаний регуляции активности ферментов, участвующих в синтезе нуклеотидов и нуклеотидных коферментов. Ключевым ферментом синтеза НАД является аденилаткиназа. Целью данной работы является исследование регуляции активности этого фермента в условиях сверхсинтеза NAD коринеформными бактериями.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования: Corynebacterium ammoniagenes АТСС 6872, Corynebacterium fla-vum ВСТИ 301, Corynebacterium ammoniagenes ВСТИ 403 из коллекции Института биохимии им А.Н. Баха и кафедры биотехнологии ВСГУТУ. Эти микроорганизмы являются наиболее эффективными продуцентами, осуществляющими Salvage синтез нуклеотидов [2].
Условия культивирования включали выращивание посевного материала на среде следующего состава (г/л): глюкоза - 20; пептон -10; ферментолизат белково-витаминного концентрата (ФБВК) -10; NaC1 - 3; биотин - 30 мкг; рН среды перед стерилизацией 7,3-7,4. Ферментацию осуществляли на среде следующего состава (г/п): глюкоза - 100; мочевина - 6: KH2PO4 -10; K2HPO4 - 10; ФБВК - 10; СаС12 - 0,1; MgSO4 -7H20 - 10; биотин - 30 мкг; рН среды перед стерилизацией 7,3-7,4; глюкозу, мочевину и биотин стерилизовали отдельно; режим стерилизации -0,5 атм. в течение 30 мин.
Количество выросшей биомассы определяли по оптической плотности при 660 нм на спектрофотометре СФ-26 [3]
Определение количества синтезированного NAD и NADP проводили ферментативным методом [1].
Хроматографическое разделение нуклеотидов проводили на бумаге Whatman ЗММ в системе растворителей этанол : уксуснокислый аммоний (7:3), на пластинках Silufol UV 254 в системе растворителей изомасляная кислота : ледяная уксусная кислота : 1 N водный аммиак (10:1:5).
Бесклеточный экстракт получали разрушением клеток на прессе с последующей экстракцией Трис-HCl буфером (рН 7,5) и центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин.
Колоночную хроматографию проводили на колонке размером 20x180 мм с DEAE-TOYOPEARL HW-65.
Аденилаткиназную активность определяли по переходу радиоактивной метки из [14С]-АМР в ADP и АТР. Радиоактивность регистрировали на жидкостном ^интилляционном счетчике «Intertechnique» (Франция). За единицу активности принимали количество нмоль продуктов реакции, образующихся за 1 мин. [4].
Электрофорез белковых фракций проводили по методу Дэвиса (Davis, 1964) на пластинках с 10% полиакриламидным гелем (ПААГ) в присутствии додецил-сульфата натрия (ДОН).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Накопление NAD в условиях сверхсинтеза не достигало 100% выхода от количества внесенных предшественников. Это позволило предположить, что при сверхсинтезе NAD действуют регуляторные механизмы, одним из которых, возможно, является ретроингибирование.
Для исследований по ретроингибирующему действию NAD, NADP, NADH на синтез NAD использовалась культура, выращенная в течение 24 ч: NAD синтезирующая активность биомассы этого возраста была наиболее высокой.
Внесение в культуральную среду экзогенных NAD, NADP и NADH показало, что эти соединения ингибировали сверхсинтез NAD. Ингибиру-ющий эффект NAD проявляется при концентрации его 4 мг/мл. NADP оказывал более сильный эффект (рис.1).
Известно, что ферменты salvage синтеза NAD находятся под контролем АТР. Поэтому представлялось интересным выяснить, направлено ли обнаруженное нами ретроингибирующее действие NAD и NADP на образование АТР, являющегося промежуточным метаболитом синтеза NAD.
В отсутствие пиридинового предшественника и в присутствии AMP наблюдался сверхсинтез АТР. Изучая влияние NAD и NADP на образование АТР из AMP было обнаружено, что уровень накопления АТР из AMP снижался при внесении в среду NAD (3 мкмоль/мл) и HADP (2 мкмоль/мл). NAD ингибировал синтез АТР на 56%, NADP - 17%. Поскольку в качестве предшественника использовался AMP, мы заключили, что одного из точек приложения ингибирую-щего действия NAD и NADP на сверхсинтез NAD является синтез АТР из AMP.
Для подтверждения этих результатов исследована активность фосфорилирования AMP бесклеточными экстрактами в качестве источника фосфорилируюицих ферментов с использованием радиоактивного [С14] - AMP.
Максимальное угнетение реакции фосфо-рилирования AMP наблюдалось при одной и той же концентрации обоих эффекторов - 5 мМ (рис. 2).
Для того чтобы отделить аденилаткиназу от нук-леозиддифосфокиназы, при очистке использовали кислотную обработку бесклеточного экстракта C. ammoniagenes АТСС 6872 1 N НС1 до рН 3. Следующая стадия очистки заключалась в дробном высаливании сернокислым аммонием от 35 до 55% насыщения.
Активность аденилаткиназы ингибировалась на 50% под действием NAD и NADP при концен-
Рис. 1. Влияние NAD (I) и NADP (2) на сверхсинтез NAD (время синтеза 45 ч)
трации эффекторов 3 и 3,5 мМ соответственно (рис. 3).
Для дальнейшего изучения ингибирующего действия NAD и NADP ферментный препарат
был подвергнут дополнительной очистке. Чтобы полностью отделить аденилаткиназу от нуклео-зиддифосфаткиназы, мы применили обработку
, НАДО],
Рис. 2. Влияние NAD и NADP на синтез ATP бесклеточными экстрактами
C. Ammoniagenes ATCC 6872
2 4
[НАД, НАДФ], мМ
Рис. 3 Ингибирование NAD (1) и NADP (2) частично очищенной аденилаткиназы
Очистка аденилактиназы из С. Ammoniagenes ATCC 6872
Таблица
№ п/п Стадия очистки Общая активность, Удельная активность, Ед/мг Выход по активности, % Кратность очистки
ед. белка
1 Бесклеточный экстракт 35100 9,76 100,0 1,0
2 Кислотная обработка 27200 15,75 77,5 1,6
3 Высаливание (NN4)2 ЭОд, 35-55% 8200 47,55 23,4 4,9
4 5 Кальций-фосфатный гель Фракция с колонки ОБАБ-ТОУОРБАР1_ 6800 3410 85,17 1680 19,4 9,7 8,7 172,0
Аденилаткиназа
Белки маркеры (кДа):
1. Цитохром C (12,3)
2. Лактальбумин (14,4)
3. Многлобин (17,8)
4. Ингибитор трипсина (20,1)
5. Карбангидраза (20,0)
Рис. 4. Определение молекулярной массы аденилаткиназы C. Ammoniagenes ATCC 6872 методом электрофореза в ПААГ
ферментного препарата кальций-фосфатным гелем.
Надосадочную жидкость после отделения геля (с белками) наносили на колонку с DEAE-TOYOPEARL, которую элюировали 0,05 М Трис-НС1 буфером (рН 7,5). Результаты очистки приведены в таблице.
Молекулярная масса аденилаткиказы, определенная методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, составляла 27500 Да (рис. 4).
Изучение кинетики аденилаткиназной реакции показало, что Km для АТР составляет 4,710-4 М, для АМФ - 5,510-4М (рис. 5). С увеличением концентрации АTP наблюдалось субстратное ингибирование реакции. Константа ингиби-рования (Kj) АТР, определенная в координатах Диксона, составила 1,3-10-3 М.
Исследовано действие пиридиновых динук-леотидов. Константы ингибирования для NAD и NADP, определенные в координатах Диксона, оказались одинаковы и равнялись 1,810 М. Однако сродство аденилаткиназы к субстратам в присутствии этих ингибиторов менялось в разной степени (рис. 5). Так, для AMP константа Миха-элиса увеличивалась с 5,510-4 М до 2,510-3 М, под действием NAD, а под действием NADP - до 1,710- М; для АТР константа Михаэлиса (4,7 10-4 M), под действием NAD, изменялась незначительно (5,310-4 М), а в присутствии NADP уве
3
личивалась до 1,5-10- М. NAD проявлял по отношению к AMP конкурентное ингибирование, а по отношению к АТР - смешанный конкурентно-неконкурентный тип ингибирования. NADP по отношению к обоим субстратам оказывал инги-бирующий эффект конкурентно-неконкурентного типа.
Никотиновая кислота и никотинамид не влияли на активность фермента. Мононуклеотид никотиновой кислоты в концентрации 3 мкмоль/ мл снижал активность аденилаткиназы на 78%. Дезамидированное производное NAD также подавляло аденилаткиназу (рис. 7). Мононуклеотид никотинамида проявлял меньший ингибирующий эффект.
Флавинмононуклеотид (FMN) практически не влиял на активность фермента. FAD оказался сильным ингибитором аденилаткиназы с константой ингибирования 1,910-3 М. Действие FAD можно отнести к смешанному конкурентно-неконкурентному типу ингибирования по отношению к обоим субстратам (рис. 8).
Из нуклеозидфосфатов наиболее выраженное ингибирующее действие оказывал GT(P с константой ингибирования 7,0-10-4 М. СТР и YTP, оказывали меньший ингибирующий эффект (рис. 9).
Аденозинтетрафосфат оказывал сильное действие, ингибируя аденилаткиназу на 70% при концентрации 1 мкмоль/мл. Константа ингибиро-
Рис. 5. Аденилаткиназная активность в зависимости от концентрации субстратов: А - в координатах Лайнуивера-Берка (1 - при постоянной концентрации АТР, 2 - при постоянной концентрации АМР); Б - в координатах Диксона (при постоянной концентрации АМР)
Рис. 6. Влияние NAD (2) и NADP (3) на аденилаткиназу: 1 - без добавки эффекторов: А - при постоянной концентрации ATP; Б - при постоянной концентрации AMP
3
вания равнялась 6-10" М. Аденозин и полиадени-ловая кислота практически не влияли на активность фермента. Пирофосфат и фосфорибо-зилпирфосфат в концентрациях до 3 мкмоль/мл
не оказывали влияния на активность аденилатки-назы. В то же время рибозо-5-фосфат при этой концентрации ингибировал фермент на 402, константа ингибирования равнялась 410-3 М. Таким
2 4 6
1/[АТФ], ю3 м1 А Б
Рис. 7. А - изменение активности аденилаткиназы под действием МНН (1), дезомидоНАД (2) и МННК (3); Б - Константы ингибирования (К) в координатах Диксона: 1 - для МНН; 2 - для дезамидо НАД; 3 - для МННК
О 1
1/ГАТФ], 10'М 1
Рис. 8. А - влияние FMH (1) и FAD (2) на аденилаткиназу; Б - определение К для FAD (координаты Диксона) при постоянной концентрации АТР и изменении концентрации АМР; В - изменение сродства
аденилаткиназы к субстратам под действием FAD
Рис. 9. А - влияние ийР (1), СТР (2), вТР (3) и АТРР (4) на аденилаткиназу; Б - определение К для этих соединений (в координатах Диксона)
образом, показано, что ни адениновый остаток, ни никотинамидная и пирофосфатная группа, в отдельности не влияли на каталитическую активность аденилаткиназы. Однако, объединенные в молекулу динуклеотида, они производили выраженный ингибирующий эффект.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что ингибирующее действие NAD и NADP направлено на аденилаткиназу, фермент в аденилатной ветви salvage синтеза NAD.
2. Показано, что аденилаткиназа, выделенная и очищенная в 170 раз из С. amoniagenes АТСС 6872, ингибируется не только NAD и NADP, но и промежуточными метаболитами salvage синтеза NAD (АТР, МННК, деНАД). Не ингибировали активность аденилаткиназы нико-тинамид, никотиновая кислота, аденозин, FMN, PRPP и пирофосфат.
3. Показано, что кроме NAD, NADP и промежуточных метаболитов сэл-видж синтеза НАД, ингибирующим действием обладал ряд нуклео-тидов, таких как ATP, GTP, FAD, CTP, UTP.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Abbouni B., Elhariary H.M., Auling G., Overproduction of NAD and 5'-inosine monophosphate by a mutant of corynebacterium ammoniagenes with thermosensi-tive nucleotide reduction after temperature shift. // Arch. Microbiol. 2004. № 2-3. P. 119-125.
2. Цыренов В.Ж. Микробиологический синтез нуклеозидфосфатов. М.: Наука, 1990. 199 с.
3. Санданов А.А., Цыренов В.Ж., Островский Д.Н. Биосинтез НАД коринеподобными бактериями // Вестник ВСГТУ. 2010. № 2. С. 31-37.
4. Tsirenov V.Z., Dulyaninova W.G., Podlepa E.M., Sandanov A.A. Nicotinate-Phosphoribosiltransferase» properties and regulation // Industrial Application of Biotechnology. New York. Nova Science Publishers. Inc. 2006. P. 123-129.
Поступило в редакцию 15 ноября 2011 г. После переработки 13 мая 2013 г.
