CC BY
14
mg trade marks: Sunar, Evika and Relakton. No experimental disease was produced in suckling baby rats if the nitrates were present in a solution of dry milk of trade mark Lakton, which inhibits the growth of reducing bacteria. The above data were obtained from the case-histories and clinical observations of sick breast-fed babies. Besides, it was shown that the glutathione reacted directly with the nitrates resorbed by the blood and altered abruptly the development of methemoglobinemia.
Ъ Ъ Ъ
%
РНФ КАК МЕТОД ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
ДИЗЕНТЕРИИ
Микробиолог И. В. Шантаренко (Киев)
Метол индикации бактерий при помощи фага, предложенный Ф. Сергиенко и разработанный в дальнейшем В. Д. Тимаковым и Д. М. Гольдфарбом в виде реакции нарастания титра фага (РНФ), успешно при меняется практическими санитарно-бактериологическими лабораториями. Это подтверждает полезность метода РНФ и одновременно выдвигает ряд вопросов, требующих специального изучения.
В первую очередь
Обсемененность внешней среды бактериями
дизентерии
сюда следует отнегти вопрос о достоверносл ;г специфических показаний реакции. Некоторые лаборатории, убедившись в расхождениях показаний реакции с конкретной эпидемической ситуацией, применяют ее с большой осторожностью. Подчас даже раздаются голоса о полной непригодности реакции как санитарно-бактериологического метода исследования.
Мы провели изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии. В своей работе мы пользовались оригинальным индикаторным фагом
Флекснера производства Института экспериментальной медицины имени Н. Ф. Гамалеи от 27/VII 1960 г., индикаторным фагом Ныокестл, выделенным Ершовым, эталонными культурами дизентерийных бактерий Флекснера, штамм № 170, Зонне, штамм № 2486 и Ныокестл, штамм «Сергеев». Ввиду того что находящийся у нас штамм Зонне № 2486 представляется в чистой R-форме, для изучения отдельных вопросов использовался наш штамм Зонне № 14 (SR-форма); с этой целью использовались также бактерии Штуцера — Шмитца №47 и кишечная палочка, штамм № 261, лизирующаяся индикаторным фагом Флекснера.
Всего нами поставлено 2874 РНФ и исследовано 958 проб материала из внешней среды на дизентерийных бактерий Флекснера, Зонне и Ныокестл. Результаты исследования отдельных объектов приводятся в таблице.
• Положительные
Коли- пробы
Материал чество
проб (абсолют- / «У 1
ные числа) ( к)
Смывы с обору лов-1 ни и ин- _
вентаря объектов питания 472 44 9
Смывы с рук (объединен-
ные пробы у 8—10 чело-
век) .......... 166 4 2,4
156 76 48,7
Вода питьевчя ....... 87 0 0
Смывы с оборудования жилья 61 2 3,8
Прочие (сточные воды, поч-
ва) .......... 16 6
Всего. . I 958 132 13,7
Обсемененность также зависит от уровня заболеваемости. В одном случае из 163 проб с оборудования объектов питания 34 были положительными (20%), а в других условиях из 309 проб были положительными (3%). Эти данные говорят >в пользу специфичности РНФ.
Из 132 положительных РНФ 23 проявились за счет негативных колоний, несвойственных индикаторному фагу на данной эталонной культуре. В отличие от круглых диаметром 3—4 мм негативных колоний индикаторного фага на эталонной культуре Флекснера штамм № 170 нарастание фага наступало за счет полиморфных колоний диаметром 0,5—2 мм с нечетко выраженными краями.
Если сопоставить эти два типа реакций, полученных на однотипных объектах (посуда и оборудование столовых), то при эпидемическом благополучии в отношении дизентерии из 309 проб получено 4 положительных результата за счет колоний, типичных для индикаторного фага, и 6 с нехарактерными колониями, а при наличии заболеваний из 163 проб — соответственно 31 и 3. Таким образом, РНФ, при которых нарастание фага происходит за счет колоний, несвойственных индикаторному фагу, не зависит от эпидемиологической ситуации; встречается около 2% исследованных проб с объектов кухни-столовой и 4%, проб из мух. В отношении ко всем положительным результатам на нашем материале они составили 17,4%.
Для выяснения природы положительных реакций, нарастание фага при которых происходит за счет колоний, несвойственных индикаторному фагу, мы подвергли дополнительному исследованию 17 проб материала, давшего положительные результаты такого типа. Из непрогре-той порции контроля на свободный фаг (вторая пробирка реакции) производили посев материала на мясо-пептонном агаре, в последующем выросшие изолированные колонии бактерий засевали штрихом на мясо-пептонном агаре и наносили на них капли индикаторного фага. Таким путем из 14 проб мы выделили кишечные палочки, которые в чистом виде воспроизводили подобные положительные реакции на эталонной культуре Флекснера № 170. Тот факт, что при этих ложноположитель-ных реакциях количество колоний индикаторного фага в опытной пробирке остается таким же, как и в контроле фага, свидетельствует о том, что он не вступил во взаимодействие с бактериями. Следовательно, имелось основание предполагать, что нарастание фага в этих реакциях происходит за счет какого-то другого компонента, содержащегося в индикаторном фаге Флекснера.
Проверяя это предположение, мы провели следующие опыты. Оригинальный индикаторный фаг Флекснера последовательно разводили, начиная с 1 : 10 и выше, на мясо-пептонном бульоне. По 1 мл каждого разведения засевали методом агаровых слоев на разные культуры. Уколом петли в негативную колонию, выросшую из последнего разведения, фаг переносили в 10 мл мясо-пептонного бульона. Сюда же вносили 0,1 мл смытой суточной агаровой культуры, которую применяли для титрования индикаторного фага. После 16—18 часов инкубации в термостате смесь фаг-бактерия при отсутствии видимого роста бак- . терий прогревали 30 минут при 56—58°; при наличии видимого роста прогреванию предшествовала фильтрация через мембранный фильтр № 3. Полученный таким образом фаг подвергали изучению * спектра литического действия на твердых и жидких питательных средах. На чашку с мясо-пептонным агаром наносили штрихи культур, на которые петлей наслаивали фаг; после инкубации в термостате учитывали эффект воздействия фага. Для изучения спектра действия на жидких средах использовали методику РНФ. При этом 0,1 мл смыва суточного роста испытываемой культуры засевали на 10 мл мясо-пептонного бульона, прибавляли 1 мл рабочего разведения изучаемого.
фага и строго по методике ставили РНФ с разными культурами. В случае отрицательного результата в РНФ для выявления наличия фага к данной культуре брали 1 мл цельного фага и исследовали методом агаровых слоев с испытываемой культурой.
На культуре кишечной палочки штамм № 261 оригинальный индикаторный фаг Флекснера проявился в виде полиморфных колоний с неровными краями, диаметром 0,5—2 мм, в титре 105. Фаг, полученный на этой культуре, лизирует как на твердой, так и на жидкой среде свою и культуру Флекснера в Б-форме. Колонии его на культуре Флекснера такие же, как и на кишечной палочке штамм № 261. Бактерий других видов дизентерии в Б- и И-форме этот фаг не лизирует.
На культуре Флекснера № 170 оригинальный индикаторный фаг в титре 9-Ю8 проявился в виде круглых колоний диаметром 3—4 мму с резко выраженными краями и полной степенью лизиса. Полученный на культуре Флекснера фаг на твердых и жидких средах лизирует свою культуру в Б- и И-форме (за исключением первого типа I по старой классификации) и И-формы других видов бактерий дизентерии. Культуру кишечной палочки в Б- и Я-формах, а также культуры других видов дизентерии в Б-форме этот фаг не лизирует. В отличие от колоний на культуре Флекснера, на культуре Зонне, штамм № 2486г выделенный фаг образует мелкие (диаметром 0,5—1 мм) с нерезко выраженными краями колонии.
Итак, с оригинального индикаторного фага Флекснера выделен второй фаг, отличающийся от него своим спектром действия.
На эталонной культуре Зонне № 2486 оригинальный индикаторный фаг Флекснера проявился различно, в виде мелких (диаметром 0,5—1 мм) и крупных (диаметром 4—5 мм) колоний. По первому размеру колоний титр фага определялся в 105 корпускул в 1 мл, а по второму в 103. Фаг, полученный с мелкой колонии на культуре Зонне № 2486, вел себя, как и фаг, выделенный на культуре Флекснера № 170. Это дивалентный фаг, лизирующий Э-формы бактерий дизентерии Флекснера, кроме первого типа, и И-формы других видов бактерий дизентерии. На разных культурах он проявляется по-разному. Эта разница проявляется в морфологии негативных колоний и во множественности заражения. Последнее наглядно проявляется в разнице титров этого фага: на культуре Флекснера № 170 он определяется в 9-108, на культуре Зонне № 2486 в 105. Бактериофаг, отвитый из большой колонии, лизирует как на твердых, так и на жидких питательных средах только И-формы бактерий Флекснера, Зонне, Штуцера— Шмитца и Ньюкестл. Этот фаг является третьим компонентом (фагом) оригинального индикаторного фага Флекснера.
Таким образом, из оригинального индикаторного фага Флекснера выделено 3 разных его компонента или фага, каждый со своим спектром литического действия, которые в сумме полностью восстанавливают свойства исходного индикаторного фага.
То, что выделенные нами фаги не являются вариантами или мутантами исходного фага, а представляют собой его составные части, доказывается следующими данными: во-первых, эти фаги с одинаковыми свойствами выделяются не на одном, а на разных видах бактерий, причем не меняют своих свойств при длительном пассировании; во-вто-рых, антифаговые сыворотки, приготовленные к этим фагам, нейтрализуют только свои фаги. Прибавляя к оригинальному индикаторному фагу антифаговые сыворотки второго компонента, первый его компонент выделяется на культуре Флекснера № 170, который при титрации цельного фага без специфических сывороток не выявляется из-за сплошного лизиса культуры, за счет второго компонента фага. Допустить мысль об изменчивости как причине появления фагов представляется возможным лишь к компоненту, лизирующему только И-формы
бактерий дизентерии, так как он частично нейтрализуется антифаговой сывороткой компонента фага Флекснера; однако и он не обладает взаимностью в этом свойстве.
Из сказанного видно, что причина ложноположительных РНФ с бактериями Флекснера заключается в том, что индикаторный фаг Флекснера содержит компонент фага, лизирующий некоторые штаммы кишечной палочки. Также из структуры и спектра литического действия индикаторного фага становится понятным механизм возникновения видовонеспецифических реакций. Последние возникают из-за свойства компонента фага Флекснера лизировать другие виды бактерий дизентерии, находящихся в И-форме, а также за счет компонента, лизирующего только Я-формы всех видов бактерий дизентерии в случае применения эталонной культуры в И-форме. Наличие подобных видовонеспецифических РНФ, встречающихся в практической работе, приводится нами в сопоставлении этиологической структуры дизентерии в очаге (см. рисунок).
Как видно из приведенных данных, удельный вес бактерий дизентерии во внешней среде, выявленных РНФ в отношении бактерий Флекснера и Ньюкестл, почти полностью совпадает с возбудителями у больных дизентерией, подтвержденных бактериологически, а показатели РНФ в отношении дизентерийных бактерий Зонне, которых было 10 из 50 положительных проб, не совпали с этиологической структурой бактерий дизентерии заболевших.
Вопрос о постороннем фаге имеет большое значение при РНФ. По нашим данным, свободный фаг, лизирующий бактерий дизентерии в смывах с объектов питания, встречался в 10°/о, а при исследовании мух — в 70% проб. Из всего количества проб, содержащих посторонний фаг, примерно в 7з случаев наступал полный лизис эталонной культуры в контроле на свободный фаг. В 2/3 случаев он проявлялся в виде мелких, чаще точечных колоний, что позволяло полностью прочесть реакцию. Для выяснения вопроса, является ли так называемый свободный фаг в буквальном смысле свободным, покоящимся фагом, мы предприняли следующий опыт. В РНФ контроль на свободный фаг ставили в двух пробирках, одну из которых до инкубации прогревали 30 минут при 58°. Подсчет количества фага производили дважды — до и после инкубации, в термостате. Только в 2 случаях из 63 изученных проб с наличием постороннего фага количество корпускул было приблизительно равным в обеих пробирках до и после инкубации, а 61 проба дала резкое нарастание титра постороннего фага (от 2-Ю3 до 109 в 1 мл) в непрогретой порции. Из проб, содержащих посторонний фаг, сравнительно легко выделяются лизогенные, продуцирующие
его кишечные палочки.
Взаимоотношение индикаторного фага с посторонним фагом проб нередко резко проявляется в РНФ. Так, из 102 проб, содержащих посторонний фаг, в 71 случае он проявился в равных количествах как в опытной пробирке, так и в пробирке на свободный фаг; в 21 пробе
наблюдалось резкое торможение свободного фага в опытной пробир-
. в
Июнь и»?ль Л5густ Июнь июль Я В густ
Внешняя среда
больные
■'.а 8-'.
Населенный пункт н/
■08,
0.2
'0.5:.'.
¿1
0.2
:0.5 г.
0.2
Населенный пуннт н2
У?777\.<Рлекснер ТТТТЛНьюкест \ \ Зон не
Этиологический состав бактерий дизентерии у больных (бактериологически) и на объектах внешней среды (РНФ) по периодам.
Чу
«V1
СУч1
Г
ке, иногда вплоть до полного исключения его, а в 10 пробах отмечалась стимуляция роста постороннего фага, симулирующего положительные реакции.
Пытаясь выяснить причины этого, мы подвергали пробы, давшие подобные результаты, дополнительному исследованию. Опытную часть реакции ставили из двух пробирок; в одну из них прибавляли 1 мл рабочего разведения живого фага, а во вторую — такое же количество этого разведения фага, убитого в автоклаве. После инкубации ставили, как обычно, РНФ. В результате оказалось, что в пробирке с живым и в пробирке с убитым фагом происходило нарастание фага в 5—15 раз по сравнению с контролем. Подобные результаты были получены с чистыми культурами лизогенных кишечных палочек, выделенных с подобных проб.
Полученные результаты дают основание полагать, что в этих случаях прибавленный фаг или стимулирует рост лизогенных бактерий, или представляет им материал для более интенсивной лизогении.
При этих ложноположительных реакциях, происходящих за счет взаимодействия индикаторного фага с посторонним фагом проб, воз-1л росший фаг проявляется так же, как и при ложноположительных реак-Л'циях описанной выше природы, в форме негативных колоний, несвойст-(Ч^венных индикаторному фагу на данной эталонной культуре. * Из изложенного выше видно, что главный путь повышения специфичности РНФ заключается в поисках высокоспецифических монофагов. В этом направлении мы предприняли попытку выделить из полифа-'гов производства Тбилисского института дизентерийные монофаги. Выделение велось путем длительного пассирования и селекцией. Длительное пассирование осуществлялось методом обычного и интенсивно-I го культивирования. По 0,5 мл фага вносилось в 10 мл мясо-пептонного ^^ бульона, куда прибавляли 0,1 мл смыва суточного роста отдельных чув-х^ствительных к фагу бактерий дизентерии. Через 18—20 часов инкубации при обычном и через 1 час при интенсивном методе культивирования систему фаг-бактерии 30 минут прогревали при 58°, а затем пассаж фага повторяли. После каждого пассажа определяли спектр лизиса фага на твердых и жидких питательных средах. Таким путем из полифага, включающего 6 компонентов (Флекснер, Зонне, Ньюкасл, Штуцер — Шмитц, кишечная палочка и И-фаг, лизирующий все виды бактерий дизентерии в И-форме), при обычном методе культивирования только на кишечной палочке № 261 получен монофаг, обладающий дивалент-ностью, лизирующий Б-формы бактерий Флекснера всех типов и кишечную палочку № 261. Методом интенсивного культивирования получен тот же фаг на кишечной палочке и на бактерии Штуцера —-Шмитца монофаг, лизирующий только бактерий Штуцера—Шмитца в Б-форме. Кроме кишечной палочки, с 3-го пассажа до 20-го на всех культурах при обычном методе культивирования, а на бактериях Флекснера № 170 и Зонне № 14 и при интенсивном культивировании размножалось одновременно несколько фагов.
Как выяснилось, причина этого, кроме описанной выше возможности развития на одном виде бактерий двух родственных фагов, заключается еще и в том, что под влиянием специфического фага бактерии дизентерии (Штуцер—Шмитц, Ньюкестл, Флекснер) приобретают свойство полилизабильности и служат субстрат-культурой для размножения неродственных фагов, находящихся в смеси.
Так, из специфической системы фаг-бактерия, бактерии которых лизировались только своими фагами (Штуцер—Шмитц, Ньюкестл, Флекснер), после 6-часовой инкубации выделяются бактерии, которые лизируются неродственными фагами, причем устойчивость к своему фагу в этих случаях не является обязательной. Следует полагать, что эта фагоизменчивость бактерий может стать также причиной видово-
2 Гигиена и санитария. № 10
17
неспецифических РНФ при наличии в пробах специфического постороннего фага.
Методом селекции удалось с первого пассажа на этих же культурах выделить отдельные монофаги. Фаги Ньюкестл и Штуцера — Шмитца являются моновалентными и лизируют только родственных им бактерий в Б-форме. Фаги Флекснера и Зонне лизируют своих бактерий в Б-форме и И-формы других видов дизентерии, причем фаг Флекснера лизирует все типы своего подвида и полностью освобождает РНФ от ложноположительных результатов, вызываемых оригинальным индикаторным фагом.
Выводы
• *
1. РНФ является специфической и может успешно применяться в санитарной бактериологии.
2. Ложноположительные РНФ возникают из-за наличия в индикаторном фаге Флекснера компонента, лизирующего некоторые штаммы кишечной палочки; их причиной может быть также взаимодействие индикаторного фага с посторонним фагом исследуемых проб.
3. Видовонеспецифические РНФ зависят от свойства дизентерийных фагов лизировать И-формы других видов бактерий дизентерии.
4. Методом длительного пассирования не удается выделить из полифагов большинство дизентерийных монофагов, что легко достигается методом селекции. Этим путем получен фаг Флекснера, превосходящий по специфичности предложенный индикаторный фаг.
ЛИТЕРАТУРА
СерНенко Ф. Мжробюл. ж., 1936, № 1, стр. 85 - Т и м а к о в В. Д., Гольдфарб Д. М. Ж. микробиол., 1956, № 10, стр. 3. — О н и же. Вестн. АМН СССР, 1956, № 2, стр. 28.— Они же. Реакция нарастания титра фага. М., 1962.
Поступила 15/1V 1963 г
PHAGE NEUTRALIZATION REACTION AS A METHOD FOR INDICATING
THE PRESENCE OF DYSENTERY BACILLI
/. V. Shantarenko, microbiologist
The author performed 2874 PNR (phage neutralization reaction) with various ob ¡ects of natural environment and thereby proved the possible use of this reaction in sanitary bacteriology. It was shown that the original Flexner indicator phage consisted of a mixture of phages, contained a component producing lysis of certain strains of colon bacilli and could consequently give rise to false positive reactions. The nonspecific type reactions are due to the ability of Flexner and Zonne phages to produce lysis of R-forms of other types of dysentery bacilli. It was demonstrated that several types of closely related phages could grow on one type of dysentery bacilli; and, on the other hand, as result of action of various specific phages, a bacteria could be lysed by several kinds of phages. Therefore, the isolation of dysenteric monophages from the polyphages by means of prolonged passages proved to be impossible, however, this could be easily attained by means of the selection method.
# * Ъ
